ssDNA次级文库的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学与临床医学技术领域。具体而言，本发明涉及ssDNA次级文库的制备方法。
背景技术
核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选而获得的单链DNA或RNA，它是一种新型的核酸分子探针，通过折叠可形成特定的三维结构，能与生物靶分子结合。核酸适配体具有分子量小、可人工合成、稳定性好、无毒性等优点，近年来核酸适配体的筛选得到迅速发展，在疾病基础研究及诊断治疗中具有广泛的应用价值。
核酸适配体筛选技术是核酸适配体生物医学应用的前提和基础，虽然目前已有多种筛选方法，但均存在不足。PCR扩增是Aptamer筛选的关键技术，但随着PCR扩增循环数的增加，大量的序列基序（sequence motifs）通过非特异性杂交产生大量的副产品，这些副产品会干扰Aptamer的筛选，并导致筛选失败。所以PCR扩增产物均需纯化，以便获得单一的ssDNA成分，但现有的纯化技术会导致目标分子的大量丢失。目前主要用于ssDNA 文库制备的方法主要有三种：不对称PCR法（asymmetric PCR）、生物素-链霉亲和素分离法（biotin-streptavidin separation）及核酸外切酶消化法（exonuclease digestion）。
不对称PCR法是用不等量的一对引物进行PCR扩增，在最初的循环中扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当低浓度引物消耗完后，只有高浓度引物存在的PCR扩增就会产生大量的单链DNA。不对称PCR法的主要缺陷是扩增产物必须使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶进行纯化，以便去除在不对称PCR扩增过程中产生的双链DNA及其它副产品。但聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶纯化会导致大量ssDNA丢失，很难保证目标ssDNA的产量。
生物素-链霉亲和素分离法是使用生物素标记其中一条引物进行PCR扩增。扩增结束后，在产物中加入链霉亲和素磁珠，携有生物素的dsDNA与携有链霉亲和素的磁珠结合，将dsDNA从扩增产生物中分离出来。然后使用碱法或加热法对结合于磁珠上的dsDNA进行处理，使之释放出无生物素标记的ssDNA。该法的主要缺陷是ssDNA是通过碱或热处理获得的，不仅产量低而且在处理过程中会导致ssDNA失去原有的三维结构，对Aptamer筛选的特异性与亲和性产生较大影响。
核酸外切酶消化法是在PCR扩增产物中加入λ核酸外切酶（Lambda exonuclease）对dsDNA进行消化来获得ssDNA。为获得能满足下轮筛选所需的ssDNA次级文库，经消化后的扩增产物同样需聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶纯化，去除未消化的dsDNA、消化后的碎片、核酸酶等，通过该法所获得的ssDNA产量极低。
可见，目前常用的ssDNA次级文库制备方法存在着产量低或特异性差的缺陷。
发明内容
本发明提供了一种高纯度、高产量的ssDNA次级文库的制备方法，此制备方法同时保证了ssDNA的亲和性与特异性。
本发明提供了一种制备ssDNA次级文库的方法,包括如下步骤：
步骤一：使用均有生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA；
步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，进行不对称PCR扩增得到混合扩增产物；
步骤三：在步骤二的混合扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得ssDNA次级文库。
所述步骤一中，ssDNA文库由82bp组成：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N40-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’。其中N40为40bp的随机序列。
所述步骤一中，生物素标记上游引物为5’-biotin-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’，所述生物标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’，其中biotin 为生物素。
所述步骤一中，PCR反应体系如下所示：
10×Buffer 5μl
MgCl2（25mM） 3μl
dNTP（10mM）2μl
Taq酶（5U/μl） 0.5μl
生物素标记上游引物（10pmol/μl）5μl
生物素标记下游引物（10pmol/μl）5μl
ssDNA文库（50ng/μl）1μl
ddH2O28.5μl
总体积 50μl
所述Taq酶选自Promega 公司的型号为M1665S的试剂盒。
所述步骤一中，PCR扩增条件如下所示：
第一阶段：
94℃5min
第二阶段： 11个循环
94℃30s
59℃30s
72℃30s
第三阶段：
72℃ 5min
4℃保存。
所述步骤二中，所述上游引物为5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’，所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’ ，其中biotin 为生物素。
所述步骤二中，所述无生物素标记的上游引物和生物素标记的下游引物的物质的量之比为10:1～30:1。
所述步骤二中，PCR反应体系如下所示：
上游引物（10pmol/μl） 2μl
生物素标记下游引物（0.5pmol/μl）2μl
dsDNA扩增产物 1μl
AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix（2×）10μl
ddH2O 5μl
总体积 20μl
所述AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix（2×）来自Life Technologies公司的4390939试剂盒。
所述步骤二中，PCR扩增条件如下所示：
第一阶段：
95℃ 10min
第二阶段：30个循环
96℃3s
59℃3s
68℃3s
第三阶段：
72℃10s
4℃保存。
所述步骤三得到的ssDNA次级文库的浓度为810～1230 nM。
本发明提供了一种ssDNA次级文库的制备方法，包括PCR扩增、不对称PCR扩增和链霉亲和素磁珠处理。在此制备过程中，不需要对扩增产物进行碱或热处理，也不需要酶处理，故避免了ssDNA的三级结构变异，保证了ssDNA次级文库的亲和性与特异性，同时引入链霉亲和素磁珠处理更进一步保证了ssDNA次级文库的纯度；而且此制备过程避免了凝胶纯化、切胶、浸泡提取、沉淀浓缩的过程，所以不仅可以大量简化试验室操作，并且克服了目标分子在凝胶回收过程中的大量丢失，保证了ssDNA次级文库的产量。
附图说明
图1为实施例1的ssDNA次级文库的制备方法流程图。
图2为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的琼脂糖凝胶电泳图，从左至右依次为：分子量为500bp的Marker；1为步骤一的对称PCR扩增产物；2为步骤二的不对称PCR扩增产物；3为步骤三的在步骤二的产物基础上纯化后的产物。
图3为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的MLCE条带模式分析图，从左至右依次为：分子量为300bp的Marker；1为步骤一的对称PCR扩增产物；2为步骤二的不对称PCR扩增产物；3为步骤三的在步骤二的产物基础上纯化后的产物。
图4为实施例1中ssDNA次级文库的制备方法的各步骤产物的扩增副产品MLCE峰值分析图，横坐标为产物大小，纵坐标为荧光值。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种ssDNA次级文库的制备方法，其制备流程见图1，包括如下步骤：
步骤一：使用生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA，为不对称PCR提供足够的模板。
PCR反应体系如下：
10×Buffer 5μl
MgCl2（25mM）3μl
dNTP（10mM）2μl
Taq酶（5U/μl） 0.5μl
生物素标记上游引物（10pmol/μl）5μl
生物素标记下游引物（10pmol/μl）5μl
ssDNA文库（50ng/μl）1μl
ddH2O28.5μl
总体积 50μl
所述Taq酶选自Promega 公司的型号为M1665S的试剂盒。
所述生物素标记上游引物为5’-biotin-AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’；
所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’；
其中，biotin 为生物素。
所述ssDNA文库由82bp组成，文库中间为40bp的随机序列，两侧是分别由21bp组成的引物结合区：5’-AGAGACGGACACAGGATGAGC-N40-CCTTCCCCAAGACAGCATCCA-3’。
以上引物和ssDNA文库均由TaKaRa公司合成。
扩增条件：
第一阶段：
94℃5min
第二阶段：（11个循环）
94℃30s
59℃30s
72℃30s
第三阶段：
72℃ 5min
4℃保存，得到获得携有生物素的dsDNA扩增产物。
步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，两者物质的量之比为20:1，进行不对称PCR扩增。经过不对称PCR扩增后所得到的dsDNA、副产品均携有生物素，而ssDNA却不含生物素。
上游引物（10pmol/μl） 2μl
生物素标记下游引物（0.5pmol/μl）2μl
dsDNA扩增产物 1μl
AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix（2×）10μl
ddH2O 5μl
总体积 20μl
所述 AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix（2×）来自Life Technologies公司的4390939试剂盒。
所述上游引物为5’- AGAGACGGACACAGGATGAGC-3’；
所述生物素标记下游引物为5’-biotin-TGGATGCTGTCTTGGGGAAGG-3’；
其中，biotin 为生物素，上述引物均由TaKaRa公司合成。
按下列条件进行扩增：
第一阶段：
95℃ 10min
第二阶段：（30个循环）
96℃3s
59℃3s
68℃3s
第三阶段：
72℃10s
4℃保存，得到扩增产物，此扩增产物包括均携有生物素的dsDNA和副产品，以及不含生物素的ssDNA 。
步骤三：最后在步骤二的扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得高纯度、高浓度的ssDNA。
取步骤二的扩增产物1.5倍体积的链霉亲和素磁珠（MagneSphere® Paramagnetic Particles，Promega,Z5482），用PBS-Tween（pH 7.4, with 0.02% Tween-20）洗涤3次，在磁力架上贴壁30s，去除上清。将ssDNA扩增产物转移至磁珠管中，室温摇摆孵育20min。在磁力架上吸出上清液，上清液即为所需要的ssDNA次级文库。
结果检测：
1）ssDNA浓度
使用荧光定量法检测ssDNA浓度，经检测ssDNA浓度为21.67～33.27μg/mL，即810～1230 nM。
经对比可知，此ssDNA浓度高于采用其它方法获得的ssDNA浓度，其它方法如文献报道的不对称PCR法、生物素-链霉亲和素分离法及核酸外切酶消化法得到的ssDNA浓度分别为： 237～275 nM、30.6～42.0 nM和31.5～41.5 nM。
2）ssDNA纯度
使用高分辨琼脂糖凝胶电泳及微流控芯片毛细管电泳法（MLCE法）检测ssDNA的纯度，结果见图2-4。
琼脂糖凝胶电泳既可分析dsDNA也可分析ssDNA，而MLCE只能分析dsDNA，不能分析ssDNA。从图2可以看出，1-3分别为步骤一、步骤二和步骤三的产物，从图可以看出，步骤一只获得dsDNA，步骤二获得dsDNA、ssDNA，以及少量副产品，经步骤三纯化后dsDNA和少量副产品已经去除，得到纯度较高的ssDNA；从图3可以看出，经步骤三纯化后，dsDNA已经去除而检测不到。图4也印证了图2和图3的检测结果。
