用于检测微生物的组合物和方法
相关申请案
本申请要求2014年2月18日提交的美国临时申请序列号61/940,955和2014年3月4日提交的美国临时申请序列号61/947,627的优先权，其各自通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般涉及用于检测样品中微生物存在的组合物和方法。更具体地，本公开涉及能够结合微生物蛋白的核酸适体，以及用于以核酸适体捕获并检测样品中微生物的方法。
通过引用将标题为“Sequence_Listing_ST25”、2015年2月13日创建的、大小16千字节的序列表整体并入本文。
背景技术
食物和水的污染在发达国家和第三世界国家都造成了主要的健康威胁，并被认为是每年数百万人死亡和疾病的原因。另外，对食物和水的污染也威胁到动物健康，包括家畜和水生生态系统。
通常，这些疾病由微生物污染引起，例如细菌、寄生虫或病毒。就食物生产而言，复杂性和参与者的数量提供了大量的意外污染机会，以及恐怖行为和食物供应的潜在和不幸相互作用。地表和地下水通常被宠物、家畜或野生动物在水源中或附近排便污染，同时垃圾填埋场、化粪池、下水道和农田的排水也加剧了水污染。不管污染的类型和来源，个体确定食物或水是否被污染是困难的，因为它可能看起来和尝起来是好的，但仍然导致疾病和最终死亡。因此，监测食物、tttt水、非无菌产品或环境的微生物污染在全球规模上对公众健康都是至关重要的
因此，持续需要改进的、有成本效益的以及有效监测食物和水中微生物污染的替代组合物和方法。本公开通过提供新颖适体试剂满足此类需要，该适体试剂对微生物上的细胞表面表位有高特异性和亲和性，用于捕获和富集以低细胞密度存在的微生物并用于直接检测(例如，通过qPCR或荧光染色)，而无需培养或细胞裂解。
发明内容
本公开描述了采用纯化的重组或天然蛋白，以多种修饰DNA文库通过SELEX生成针对几种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞表面相关蛋白的慢解离速率修饰的适体(SOMAmer)新颖试剂。获得对葡萄球菌蛋白A(SpA)、凝集因子(ClfA、ClfB)、纤连蛋白结合蛋白(FnbA、FnbB)以及铁调节的表面决定簇(Isd)具有次纳摩尔Kd的高亲和性结合剂。几种适体特异结合来自全部测试菌株的金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞，但不结合其它葡萄球菌或其它细菌。SpA和ClfA适体证明对于从低细胞密度基质(如通过培养和PCR所示)中选择性捕获和富集金黄色葡萄球菌细胞是有用的，得到改进的检测限和有效去除PCR抑制剂。与基因组PCR比较，当以适体覆盖细菌细胞表面以及随后进行适体的qPCR时，对金黄色葡萄球菌细胞的检测提高了几个数量级。
本公开描述了一种用于检测样品中存在或不存在微生物的方法，其包括：a)使该样品与第一适体接触以形成混合物，其中该第一适体能够结合微生物的第一细胞表面蛋白以形成复合物并且包含第一标记物，其中该第一标记物能够结合固体载体；b)使该混合物与固体载体在允许第一标记物结合固体载体的条件下接触；c)洗涤固体载体以对该混合物富集复合物和/或洗涤固体载体以基本上去除未结合物质；c)使该混合物与第二适体接触，其中第二适体能够结合该微生tttt物的第一细胞表面蛋白或第二细胞表面蛋白；以及d)进行测定以检测该第二适体，其中检测到第二适体表明样品中存在该微生物，以及其中未检测到第二适体表明样品中不存在该微生物。
本公开还提供了一种用于检测样品中存在或不存在微生物的方法，其包括：
a)使该样品与固体载体接触，其中第一适体通过第一标记物结合固体载体，以及其中该第一适体能够结合该微生物的第一细胞表面蛋白以形成复合物；b)洗涤固体载体以对该混合物富集复合物和/或洗涤固体载体以基本上去除未结合物质；c)使该混合物与第二适体接触，其中该第二适体能够结合该微生物的第一细胞表面蛋白或第二细胞表面蛋白并包含第二标记物；以及d)进行测定以检测第二适体，其中检测到该第二适体表明样品中存在该微生物，以及其中未检测到该第二适体表明样品中不存在该微生物。.
在另一方面，第一适体和第二适体中的至少一个还包含至少一个C-5修饰的嘧啶。在相关方面，该C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(BndC)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PEdC)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PPdC)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NapdC)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NapdC)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NEdC)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NEdC)；5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)；5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)；5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)；5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物以及5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。
在另一方面，第二适体是可扩增的。在相关方面，第二适体是酶扩增的模板(例如通过PCR或qPCR)。在再另一相关方面，第二适体通过能够与第二适体或第二适体的一个或多个区域杂交的PCR引物扩增。
在另一方面，第二适体包含第二标记物，其中第二标记物选自染料、量子点、放射标签、PCR引物位点、电化学官能团、以及酶加可检测酶底物。
在另一方面，第一标记物选自多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、聚组氨酸、或这些结构的任何片段或衍生物。
在另一方面，固体载体选自珠粒和基底。在相关方面，该珠粒选自聚合物珠粒、琼脂糖珠粒、聚苯乙烯珠粒、丙烯酰胺珠粒、实心珠粒、多孔珠粒、顺磁珠粒、玻璃珠粒、微珠粒、以及受控孔珠粒。在再另一相关方面，该基底选自微量滴定孔、环烯烃共聚物基底、膜、塑料基底、尼龙、Langmuir-Blodgett膜、玻璃、锗基底、硅基底、硅晶片芯片、导流芯片、纳米颗粒、聚四氟乙烯基底、聚苯乙烯基底、砷化镓基底、金基底、以及银基底。
在另一方面，该测定选自包括但不限于PCR、qPCR、质谱、测序杂交等的组。在相关方面，该测定选自PCR和qPCR。
在另一方面，该微生物选自包括但不限于细菌细胞、寄生虫和病毒的组。
在另一方面，该微生物为细菌细胞。在相关方面，该细菌细胞为致病性的。在再另一相关方面，该细菌细胞为葡萄球菌细胞。在另一相关方面，该细菌细胞为金黄色葡萄球菌细胞。
在另一方面，第一细胞表面蛋白和第二细胞表面蛋白是相同的蛋白或不同的蛋白。
在另一方面，第一细胞表面蛋白为细菌细胞表面蛋白。
在另一方面，第二细胞表面蛋白为细菌细胞表面蛋白。
在另一方面，第一细胞表面蛋白选自SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH以及SasD。在相关方面，第一细胞表面蛋白选自SPA和ClfA。
在另一方面，第二细胞表面蛋白选自SPA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH和SasD。在相关方面，第二细胞表面蛋白选自SPA和ClfA。
在另一方面，第一适体包含具有GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(SEQ ID NO:14)序列的核酸分子，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4或5。在相关方面，n为2。在相关方面，第一适体为至少约32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。在再另一相关方面，第一适体为约32至约100个核苷酸长(或32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，第一适体包含具有AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO:15)序列的核酸分子，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在相关方面，n为5至20(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在另一方面，n为10至18(或10、11、12、13、14、15、16、17或18)。在相关方面，n为约16。在再另一相关方面，第一适体为至少约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、tttt34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。
在另一方面，第一适体为约18个至约100个核苷酸长(或18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，第一适体包含具有选自SEQ ID NO:1-8和10-12的序列的核酸分子，其中W为C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，第二适体包含具有GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(SEQ ID NO:14)序列的核酸分子，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4或5。在相关方面，n为2。在相关方面，第二适体为至少约32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。在再另一相关方面，第二适体为约32个至约100个核苷酸长(或32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，第二适体包含具有AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO:15)序列的核酸分子，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何tttt未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在相关方面，n为5至20(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在另一方面，n为10至18(或10、11、12、13、14、15、16、17或18)。在相关方面，n为约16。
在另一方面，第二适体为至少约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。
在另一方面，第二适体为约18个至约100个核苷酸长(或18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，第二适体包含具有选自SEQ ID NO:1-8和10-12的序列的核酸分子，其中W为C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，该C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(BndC)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PEdC)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PPdC)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NapdC)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NapdC)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NEdC)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NEdC)；5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)；5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)；5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)；5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物以及5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。
在另一方面，该样品选自包括但不限于水样品、土壤样品、食物样品、细胞样品、培养物样品、组织样品、细胞碎片样品生物样品等的组。
在另一方面，以及对于本文公开实施方案的任一个，第一适体的浓度为约0.5nmol l-1至约60nmol l-1(或0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60nmol l-1)。在相关方面，第一适体的浓度为约1nmol l-1至约40nmol l-1(或1、1.5、2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、36、37、38、39或40nmol l-1)。在相关方面，第一适体的浓度为约2nmol l-1至约35nmol l-1(或2、2.5、3、3.2、3.5、4、4.5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5或35nmol l-1)。
在相关方面，第一适体的浓度为至少0.5nmol l-1、1nmol l-1、2nmol l-1、3nmol l-1、3.2nmol l-1、4nmol l-1、5nmol l-1、6nmol l-1、7nmol l-1、8nmol l-1、9nmol l-1、10nmol l-1、11nmol l-1、12nmol l-1、13nmol l-1、14nmol l-1、15nmol l-1、16nmol l-1、17nmol l-1、18nmol l-1、19nmol l-1、20nmol l-1、21nmol l-1、22nmol l-1、23nmol l-1、24nmol ttttl-1、25nmol l-1、26nmol l-1、27nmol l-1、28nmol l-1、29nmol l-1、30nmol l-1、31nmol l-1、32nmol l-1、33nmol l-1、34nmol l-1、35nmol l-1、36nmol l-1、37nmol l-1、38nmol l-1、39nmol l-1或40nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少1nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少3nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少5nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少10nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少20nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少30nmol l-1。在相关方面，第一适体的浓度为至少32nmol l-1。
在另一方面，以及对于本文公开实施方案的任一个，第二适体的浓度为约5nM至约200nm(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200nM)。在相关方面，第二适体的浓度为约2.5nM至约100nM(或2.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM)。在相关方面，第二适体的浓度为约10nM至约100nM(或10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100nM)。
在相关方面，第二适体的浓度为至少2.5nM、3nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM或100nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少2nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少2.5nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少5nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少10nM。在相关方面，第tttt二适体的浓度为至少20nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少30nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少40nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少50nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少60nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少70nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少80nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少90nM。在相关方面，第二适体的浓度为至少100nM。
本公开还描述了一种核酸分子，其包含至少约15个至至少约100个核苷酸(或至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70,71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸)，至少一个C-5修饰的嘧啶，以及能够结合微生物的细胞表面蛋白。
在另一方面，该核酸分子包含约15个至约50个核苷酸(或15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。
在另一方面，该核酸分子包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，该核酸分子包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，该核酸分子能够以约0.03nM至约4.7nM(或0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、tttt0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7nM)的平衡结合常数(Kd)结合细胞表面蛋白。
在另一方面，核酸分子能够以至少约0.03、0.07、0.08、0.14、0.15、0.16、0.22、0.35、0.47、0.63、0.73、0.79、0.84、1.3、1.35、1.98、2.17、3.9和4.73nM的平衡结合常数(Kd)结合细胞表面蛋白。
在另一方面，该C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(BndC)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PEdC)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PPdC)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NapdC)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NapdC)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NEdC)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NEdC)；5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)；5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)；5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)；5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物以及5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。
在另一方面，该微生物选自细菌细胞、寄生虫和病毒。
在另一方面，该微生物为细菌细胞。在相关方面，该细菌细胞为致病性的。
在另一方面，该细菌细胞为葡萄球菌细胞。在相关方面，该细菌细胞为金黄色葡萄球菌细胞。
在另一方面，该细胞表面蛋白为细菌细胞表面蛋白。
在另一方面，该细胞表面蛋白选自SPA、ClfA、ClfB、FnbA、ttttFnbB、IsdA、IsdB、IsdC、IsdH以及SasD。
在另一方面，该第一细胞表面蛋白选自SPA和ClfA。
在另一方面，该核酸分子包含序列GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(SEQ ID NO:14)，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4或5。在相关方面，n为2。
在另一方面，该核酸分子为至少约32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。
在另一方面，该核酸分子为约32个至约100个核苷酸长(或32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，该核酸分子包含序列AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO:15)，其中W每次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在相关方面，n为5至20(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在另一方面，n为10至18(或10、11、12、13、14、15、16、17或18)。在相关方面，n为约16。
在另一方面，该核酸分子为至少约18、19、20、21、22、23、tttt24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸长。
在另一方面，该核酸分子为约18个至约100个核苷酸长(或18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长)。
在另一方面，该核酸分子包含具有选自SEQ ID NO:1-8和10-12的序列的核酸分子，其中W为C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，该C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(BndC)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PEdC)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PPdC)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NapdC)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NapdC)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NEdC)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NEdC)；5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)；5-(N-异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)；5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)；5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物以及5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。
本公开还描述了包括以上描述的核酸分子的用于检测样品中存在或不存在微生物的试剂盒。
本发明的前述和其它目的、特征和优点将由以下参考附图进行的详细说明而变得更显而易见。
附图简述
图1显示以固定在顺磁珠粒上的SpA适体捕获金黄色葡萄球菌。tttt通过定量培养珠粒来计算细胞捕获效率。在图1A中，适体浓度固定为20nmol l-1以捕获0.1ml样品中的细胞。5000CFU、500CFU和50CFU。在图1B中，细胞密度固定为0.1ml样品中6600CFU，并且捕获适体浓度发生变化。32nmol l-1、10nmol l-1、3.2nmol l-1、()1nmol l-1和()0.32nmol l-1。捕获效率通过定量培养来计算。
图2显示基于适体的金黄色葡萄球菌捕获，以及相对于单个基因组拷贝的qPCR，通过结合至高度丰富的细胞表面组分的适体的qPCR进行的信号扩增。不可扩增的、生物素化的ClfA适体4522-5或4503-73用于捕获金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(阴性对照，接着通过可扩增的SpA适体4520-8来检测。随机适体文库用作检测的阴性对照。采用相同的细胞滴度(108个细胞ml-1)进行基因组靶标(sasD基因)的PCR扩增，作为参考。
图3显示在大肠杆菌中以重组形式过表达并通过在Ni-NTA琼脂糖和Streptactin Sepharose上亲和层析纯化的细胞表面相关的金黄色葡萄球菌蛋白的SDS-PAGE分析。
图4显示以来自SELEX池4520NapdU和4531TrpdU的各个适体进行的放射性标记亲和结合测定，采用纯化的系列稀释的0.001-100nmol l-1SpA蛋白(图4A)和稀释至107、106、105和104CFU ml-1的全细胞(图4B)。
图5显示以固定到顺磁链霉亲和素珠粒的SpA和ClfA适体捕获细菌细胞。捕获效率通过在低细胞密度下半定量培养(图5A)或通过在高细胞密度下浑浊度下降(图5B)来监测。
发明详述
I.术语和方法
除非另有说明，技术术语按常规用法使用。分子生物学中常用术tttt语的定义可以在1994年Oxford University Press出版的Benjamin Lewin的Genes V(ISBN 0-19-854287-9)；1994年Blackwell Science Ltd.出版的Kendrew等(编辑的)The Encyclopedia of Molecular Biology(ISBN 0-632-02182-9)；以及1995年VCH Publishers,Inc.出版的Robert A.Meyers(编辑的)Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
为了促进本公开的各种实施方案的综述，提供以下的对具体术语的解释：
适体：如本文所用，术语适体是指非天然存在的对靶分子有期望作用的核酸。期望作用包括但不限于结合靶标、通过催化改变靶标、以修饰或改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、共价连接至靶标(如在自杀性抑制剂中)、以及促进靶标和另一分子的反应。
适体-亲和复合物：如本文所用，术语“适体-靶亲和复合物”、“适体亲和复合物”或“适体复合物”或“复合物”是指通过适体与其靶分子的相互作用形成的非共价复合物。复数形式的“适体-靶亲和复合物”、“适体亲和复合物”或“适体复合物”或“复合物”是指不止一个此类成套复合物。适体-靶亲和复合物、适体亲和复合物或适体复合物或复合物通常可通过诸如温度升高、盐浓度增加或添加变性剂的环境条件改变而被逆转或解离。但是，如果需要，此类复合物也可以是共价相互作用。
可扩增的：如本文所用，术语可扩增的是指能够被复制或拷贝以生成更多拷贝数的分子的分子(例如，核酸分子或适体)。
类似物：如本文所用，术语类似物是指结构化学类似物以及功能化学类似物。结构化学类似物为具有与另一化学化合物类似的结构但有一个或多个原子或官能团不同的化合物。这种不同可以为原子或官能团的增加、原子或官能团的缺失、原子或官能团的替换或其组合。功能化学类似物为具有相似化学、生物化学和/或药理学性质的化合tttt物。术语类似物还可以涵盖化合物的S和R立体异构体。
生物活性：如本文所用，术语生物活性是指一种或多种细胞间、细胞内或细胞外过程(例如，细胞-细胞结合、配体-受体结合、细胞信号转导等)，它们可影响生理学或病理生理学过程。
生物样品：如本文所用，生物样品是指“样品”和“测试样品”，它们在本文中可互换使用，是指从个体获得或以其它方式源于个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血块黄层、血浆和血清)、痰、眼泪、粘液、鼻洗涕液、鼻抽吸液、呼吸、尿、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸液、支气管抽吸液、滑液、关节抽吸液、细胞、细胞抽提物以及脑脊液。这还包括所有前述物的实验分离组分。例如，血液样品可分级分离为血清或含有诸如红血细胞或白血细胞(白细胞)的特定类型血细胞的组分。必要时，样品可为来自个体的样品的组合，例如组织与体液样品的组合。术语“生物样品”还包括含有匀浆的固体材料的材料，例如来自粪便样品、组织样品，或例如活检组织。术语“生物样品”还包括源自组织培养或细胞培养的材料。可采用任何适合于获得生物样品的方法；示例性方法包括例如放血术、拭子(例如，口腔拭子)、以及细针穿刺活检过程。可以接受细针穿刺的示例性组织包括淋巴结、肺、肺洗液、BAL(支气管肺泡灌洗)、甲状腺、乳房、以及肝脏。也可例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微切割(LCM)或激光显微切割(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如，PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或源自个体的“生物样品”包括从个体获得后以任何适合方式处理过的任何此类样品。
C-5修饰的嘧啶：如本文所用，C-5修饰的嘧啶(或C-5修饰的核苷酸)是指具有C-5位置修饰的嘧啶。C-5修饰的嘧啶的实例包括在美国专利No.5,719,273和5,945,527、以及2010年12月14日提交的标题为“Nuclease Resistant Oligonucleotides”的美国临时申请序列号61/422,957中描述的那些。本文提供另外的实例。
细胞表面蛋白：如本文所用，细胞表面蛋白是指这样的蛋白，其在细胞、细胞膜、细胞壁外膜的表面表达，或者具有暴露于细胞的外表面、外部细胞膜或细胞壁外膜上的结构域，而该蛋白的另一部分或结构域在细胞膜或细胞壁外膜内和/或在细胞的细胞内空间表达。
共有序列：如本文所用，共有序列是指代表经历序列比对的一系列核酸序列在每一位置发现的最常观察到的核苷酸的核苷酸序列。
共价键：共价键或相互作用是指涉及两原子间共用至少1对电子的化学键。
富集：如本文所用，术语富集(enrich/enrichment)意指使样品经历加工，以致作为结果，至少一个组分(例如，复合物或适体-靶复合物)或一组组分的比例表示与另一个组分或另一组组分比较时提高了。富集可以意指与另一组分比较，富集一个组分至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。
抑制：如本文所用，术语抑制意指防止或降低肽或多肽的表达到该肽或多肽不再具有可检测的活性或生物活性的程度；或者降低肽或多肽的稳定性和/或降低或防止肽或多肽的活性到该肽或多肽不再具有可检测的活性或生物活性的程度。
微生物：如本文所用，术语微生物是指单细胞或多细胞生物体，并且可以包括细菌、古细菌、原生动物、真菌、藻类、微生植物、轮虫、涡虫病毒。
修饰的：当提及寡核苷酸而使用时，术语修饰的(或修饰(modify/modification))及其任何变体意指，该寡核苷酸的4个组成性核苷酸碱基(即，A、G、T/U、和C)的至少一个为天然存在的核苷酸的类似物或酯。
调节：如本文所用，术语调节意指通过相对于参照表达水平增加或降低肽、蛋白或多肽的表达水平来改变其表达水平，和/或通过相tttt对于参照稳定性和/或活性水平增加或降低肽、蛋白或多肽的稳定性和/或活性水平来改变其稳定性和/或活性。
非共价键：非共价键或非共价相互作用是指不涉及两原子间共用电子对的化学键或相互作用。非共价键或相互作用的实例包括氢键、离子键(静电键)、范德华力以及疏水相互作用。
核酸：如本文所用，核酸是指任何含有DNA、RNA和/或其类似物的核酸序列，并且可以包括单链、双链或多链形式。术语“核酸”、“寡”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用。
药学上可接受的：如本文所用，药学上可接受的意指由联邦或州政府的管理机构批准或列在美国药典或其它的公认药典中用于在动物以及更具体地在人类中使用。
药学上可接受的盐：如本文所用，药学上可接受的盐或化合物(例如，适体)的盐是指含有离子键的产品，通常是通过使化合物与酸或碱反应而产生，适合于向个体施用。药学上可接受的盐可包括但不限于酸加成盐，其包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳基烷基磺酸盐、醋酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、以及酒石酸盐；碱金属阳离子如Li、Na、K，碱土金属盐如Mg或Ca，或者有机胺盐。
药物组合物：如本文所用，药物组合物是指包含呈适合于向个体施用的形式的适体的制剂。药物组合物通常配制为与其期望的施用途径相容。施用途径的实例包括，但不限于，口服和胃肠外，例如，静脉内、皮内、皮下、吸入、局部、透皮、跨粘膜、以及直肠施用。
SELEX：如本文所用，术语SELEX通常是指选择以期望方式与靶分子相互作用的核酸，例如以高亲和性与蛋白结合；并扩增这些所选的核酸。SELEX可以用于鉴定与特异靶分子有高亲和性的适体。tttt术语SELEX和“SELEX法”可以互换使用。
序列同一性：如本文所用，在两个或更多个核酸序列语境中，序列同一性为序列共有的相同核苷酸位置数的函数(即，同一性％＝相同位置数/总位置数×100)，考虑为两个或更多个序列的最佳比对而需要引入的空位数以及每一空位的长度。可采用数学算法，例如以其默认参数的BLAST和Gapped BLAST程序(例如，Altschul等,J.Mol.Biol.215:403,1990；还参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上的BLASTN)，来完成两个或更多个序列的序列比较和同一性百分比确定。对于序列比较，通常是将一个序列用作参照序列，测试序列与其比较。当采用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，指定子序列坐标(若必要)，并指定序列算法程序参数。接着，基于指定的程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。用于比较的最佳序列对比可例如通过以下方法进行：Smith和Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.,2:482,1981；Needleman和Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.,48:443,1970；Pearson和Lipman的相似性搜索法，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；这些算法的计算机执行(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)，或者视觉观察(一般参见，Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987))。如本文所用，当描述核酸如Spa(或SPA)适体的同一性百分比时，它的序列与参照核苷酸序列是至少例如约95％同一的，则意味着，除了该核酸序列可以在参照核酸序列的每100个核苷酸中包括至多5个点突变之外，该核酸序列与参照序列是同一的。换言之，为了获得期望的核酸序列，即其序列与参照核酸序列是至少约95％同一的，则参照序列中至多5％的核苷酸可以被删除或者被另一核苷酸置换，或者至多参照序列中总核苷酸数的5％数量的核苷酸可以插入参照序列中(本文中称为插入)。为了生成期望序列，参照序列的这些突变可以发生在参tttt照核苷酸序列的5'或3'末端位置处或者这些末端位置之间的任何地方，单个地散布于参照序列内的核苷酸间或者以一个或多个连续群散布在参照序列中。
固体载体：固体载体是指具有分子可以直接或间接、通过共价或非共价键连接的表面的任何基底。固体载体可以包括能够为连接至表面的捕获元件或探针提供物理支持的任何基底材料。该材料通常能够忍受与捕获元件或探针连接至表面相关的条件，以及进行测定期间遇到的任何随后的处理、操作或加工。该材料可以是天然存在的、合成的或者为天然存在的材料的修饰物。适合的固体载体材料可以包括硅、硅晶片芯片、石墨、镜化表面、层压材料、膜、陶瓷、塑料(包括聚合物，诸如例如聚(氯乙烯)、环烯烃共聚物、琼脂糖凝胶或珠粒、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚四氟乙烯(PTFE或)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、锗、砷化镓、金、银、朗缪尔-布劳杰特膜(Langmuir Blodgett film)、导流芯片等，以它们自身使用或者与其它材料结合。可以考虑其它的刚性材料，例如玻璃，其包括二氧化硅，并且还包括例如可作为生物玻璃获得的玻璃。可以采用的其它材料包括多孔材料，诸如例如，受控孔玻璃珠粒、交联的珠粒或琼脂糖树脂珠粒或交联的双丙烯酰胺与氮杂内酯的共聚物。其它的珠粒包括纳米颗粒、聚合物珠粒、实心珠粒、顺磁珠粒或微珠粒。也考虑本领域已知的任何能够具有在其表面掺入的一个或多个官能团(例如氨基、羧基、巯基或羟基官能团的任一个)的其它材料。
用于固体载体的材料可以采取从简单到复杂的各种配置中的任何一种。固体载体可具有许多形状中的任一种，其包括条、板、盘、杆、颗粒、珠粒、管、孔(微量滴定)等等。固体载体可以为多孔的或无孔的，有磁性的、顺磁的或无磁性的，多分散的或单分散的，亲水的或疏水的。固体载体还可以呈紧密堆积的凝胶或浆料形式(如在柱基质中)或松散堆积的颗粒形式。
在一个实施方案中，将带有连接的捕获元件的固体载体用于从测试混合物中捕获带标记物的适体-靶亲和复合物或适体-靶共价复合物。在一个具体样品中，当标记物为生物素部分时，则固体载体可为链霉亲和素包覆的珠粒或树脂，例如Dynabeads M-280链霉亲和素、Dynabeads MyOne链霉亲和素、Dynabeads M-270链霉亲和素(Invitrogen)、链霉亲和素琼脂糖树脂(Pierce)、链霉亲和素超联树脂、MagnaBind链霉亲和素珠粒(ThermoFisher Scientific)、BioMag链霉亲和素、ProMag链霉亲和素、二氧化硅链霉亲和素(Bangs Laboratories)、高效链霉亲和素琼脂糖(Streptavidin Sepharose High Performance)(GE Healthcare)、链霉亲和素聚苯乙烯微球(Microspheres-Nanospheres)、链霉亲和素包覆的聚苯乙烯颗粒(Spherotech)或任何其它的本领域技术人员常用来捕获带生物素标记物的分子的链霉亲和素包覆的珠粒或树脂。
本发明的一个目的是将蛋白信号转化为适体信号。作为结果，所收集/检测的适体的量表示所结合的靶分子的量和样品中靶分子的量，以及可以直接与它们成比例。可以采用数种检测方案，无需在第二分离或俘获后从第二固体载体洗脱适体-靶亲和复合物或适体-靶共价复合物。除了以下的检测方法实施方案外，其它的检测方法也为本领域技术人员所知。
很多检测方法需要在检测前将显性标签掺入适体。在这些实施方案中，可以将诸如例如荧光或化学发光染料的标签掺入适体，无论是在采用标准核酸合成技术合成期间，还是合成之后。可在采用与适当试剂的标准酶反应合成期间或合成之后掺入放射性标签。也可在第二分离和洗脱后采用适合的酶学技术加标签。例如，采用带有以上提到的标签的引物，PCR将标签掺入洗脱的适体的扩增产物中。当采用凝胶技术定量时，也可采用PCR掺入不同大小的质量标签。这些质量标签也可以掺入不同的荧光或化学发光染料用于额外的多重性能。标签可以这样间接地添加到适体：使用无论是合成期间或者合成后掺入到适体的特定标记物，接着添加与标记物缔合并带有标签的探针。标tttt签包括以上描述的那些以及用在例如比色读数的标准测定法中的酶。这些酶与酶的底物一起工作，并包括诸如例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的酶。标签还可以包括作为用于电化学检测的电化学官能团的材料或化合物。
例如，适体可以在与测试样品接触前如上所述以放射性同位素如32P标记。采用以上讨论的四种基本测定法及其变形的任何一种，通过在测定法的最后定量第二固体载体上的放射性可以简单地完成适体检测。放射性的计数可以直接与最初测试样品中靶标的量成比例。类似地，如上所述，在接触测试样品前以荧光染料标记适体使得能直接在第二固体载体上简单获得荧光读数。可类似地采用化学发光标签或量子点直接从第二固体载体获得读数，而无需适体洗脱。
在另一实施方案中，适体-靶亲和复合物(或适体-靶共价复合物)的量或浓度采用复制期间的“分子信标”来测定(参见，例如，Tyagi等，Nat.Biotech.J.6:49 53,1998；美国专利No.5,925,517)。分子信标为特异的核酸探针，其折叠为发夹环，并在发夹结构的一端含有荧光团，在另一端含有淬灭剂，以致当形成发夹时荧光团产生微弱信号或无信号。环序列特异于靶多核苷酸序列，在与适体序列杂交后，发夹去折叠，由此产生荧光信号。
对于少量仍结合至第二固体载体的适体的多重检测，可利用具有不同激发/发射光谱的荧光染料来检测和定量2种、或3种、或5种、或多至10种单独的适体。类似地，不同大小的量子点可用于多重读数。可在从第二固体载体分离自由适体后引入量子点。通过采用结合至独特量子点的适体特异杂交序列，可进行2、3、4、5、以及多至10种适体的多重读数。以可单独检测的不同放射性同位素如32P、3H、13C、和35S标记不同的适体，也可用于有限的多重读数。
在一个实施方案中，标准DNA杂交阵列或芯片被用于将每一适体或光适体(photoaptamer)与固定在载玻片或芯片上的独特或一系列tttt独特探针杂交，例如Agilent阵列、Illumina BeadChip阵列、NimbleGen阵列或定制印刷阵列。每一独特探针与适体上的序列互补。该互补序列可以为掺入适体中的独特杂交标记物、或适体序列的一部分、或整个适体序列。将第二分离或俘获后从固体载体释放的适体添加至适当的杂交缓冲液，并采用标准杂交方法操作。例如，将适体溶液与DNA杂交阵列于约60℃温浴12小时以保证杂交的严谨性。洗涤阵列，接着在荧光玻片扫描仪中扫描阵列，在阵列的每一特征方面生成适体杂交强度的图像。图像分割和定量采用图像处理软件如ArrayVision完成。在一个实施方案中，多重适体测定法可采用多至25种适体、多至50种适体、多至100种适体、多至200种适体、多至500种适体、多至1000种适体、以及多至10,000种适体来检测。
在一个实施方案中，将具有与如上所述适体互补的独特DNA探针的可寻址微珠粒用于杂交。该微珠粒可以用独特荧光染料来寻址，例如Luminex珠粒技术，或采用条形码标记，如在Illumina VeraCode技术中，或激光驱动转发器(laser powered transponders)。在一个实施方案中，将从第二固体载体释放的适体添加至适当的杂交缓冲液，并采用标准微珠粒杂交方法处理。例如，将适体溶液与一套微珠粒于约60℃温浴2小时以保证杂交的严谨性。接着将溶液在Luminex仪器上处理，该仪器对各个珠粒类型计数并定量适体荧光信号。在另一实施方案中，使VeraCode珠粒与适体溶液接触并在约60℃杂交2小时，接着沉积在网格化表面并采用玻片扫描仪扫描以鉴定和荧光定量。在另一实施方案中，使转发器微珠粒与适体样品在约60℃温浴，接着采用适当的设备对转发器微珠粒定量。在一个实施方案中，多重适体测定法可采用多至25种适体、多至50种适体、多至100种适体、多至200种适体、以及多至500种适体通过与微珠粒杂交来检测。
含有洗脱的适体的样品可经处理以掺入如上所述的独特质量标记物以及荧光标签。然后将经质量标记的适体注射进CGE仪器(本质上是DNA测序仪)，适体通过它们独特质量而被鉴定，并采用来自标记反应期间掺入的染料的荧光定量。这种技术的一个示例性实例已由ttttAlthea Technologies开发。
在很多以上描述的方法中，适体溶液可经扩增以及任选地在定量前加标记。对于从第二固体载体洗脱的适体溶液，可采用标准PCR扩增。此类扩增可在DNA阵列杂交、微珠粒杂交和CGE读数前使用。
在另一实施方案中，适体-靶亲和复合物(或适体-靶共价复合物)采用Q-PCR检测和/或定量。如本文所用，“Q-PCR”是指在使测定结果为定量的方式和控制条件下进行的PCR反应，即该测定法能够定量测试样品中存在的适体的量或浓度。
在一个实施方案中，测试样品中适体-靶亲和复合物(或适体-靶共价复合物)的量或浓度采用PCR测定。该技术通常依赖于寡核苷酸复制酶的5'-3'外切核酸酶活性以从靶序列生成信号。TaqMan探针基于待定量的适体序列来选择，并通常包括5'末端荧光团，诸如例如6-羧基荧光素，以及3'端淬灭剂，诸如例如6-羧基四甲基荧光素，当采用聚合酶链式反应(PCR)扩增适体序列时产生信号。当聚合酶拷贝适体序列时，外切核酸酶活性将荧光团从在PCR引物下游退火的探针释放，由此产生信号。当产生复制产物时信号增强。PCR产物的量取决于所进行的复制循环数以及适体的起始浓度。
在另一实施方案中，适体-靶亲和复合物(或适体-靶共价复合物)的量或浓度在复制过程期间采用嵌入式荧光染料来测定。与存在单链DNA时产生的荧光信号比较，该嵌入式染料诸如例如绿在存在双链DNA时产生大量荧光信号。当PCR期间形成双链DNA产物时，染料产生的信号增加。所产生的信号的量级取决于PCR循环数和适体的起始浓度。
在另一实施方案中，适体-靶亲和复合物(或适体-靶共价复合物)采用质谱来检测和/或定量。如上所述可采用酶学技术引入独特质量标记物。对于质谱读数，无需检测标签，而是质量自身用于鉴定，以tttt及采用本领域技术人员常用的技术基于位置和质谱分析期间产生的质量峰下面积来定量。采用质谱的实例为由Sequenom开发的系统。
SOMAmer：如本文所用，术语SOMAmer(或SOMAmer试剂)是指具有改进的解离速率(off-rate)特征的适体。可替代地，SOMAmer试剂也指慢解离速率修饰的适体(Slow Off-Rate Modified Aptamer)，并可以通过标题为“Method for Generating Aptamer with Improved Off-Rates”的美国公布No.20090004667中描述的改进的SELEX法筛选，通过引用将该公布整体并入本文。慢解离速率修饰的适体是指解离速率(t1/2)≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的适体(包括包含至少一个带有疏水修饰的核苷酸的适体)。
间隔序列：如本文所用，间隔序列是指由共价结合至适体核酸序列的5'-端、3'-端或5'和3'端的小分子构成的任何序列。示例性间隔序列包括但不限于聚乙二醇、烃链、以及其它聚合物或共聚物，它们提供连接共有区域的分子共价骨架，同时保留了靶-适体结合活性。在某些方面，间隔序列可以通过标准键联共价结合至适体，例如末端3'或5'羟基，2'碳，或碱基修饰如嘧啶的C5位置或嘌呤的C8位置。
基本上去除：如本文所用，基本上去除意指相对于另一组分(例如，结合至固体载体的物质或适体-靶复合物)，去除一个或多个组分(例如，未结合至固体载体的物质)的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多。
标记物：如本文公开的，适体还可包含“标记物”，它是指为将适体(以及任何与其结合的靶分子)连接或固定到固体载体提供手段和/或为检测适体或复合物(适体-靶复合物)提供手段的组分。“标记物”为能够与“捕获元件”缔合的部分。复数形式的“标记物”或“捕获元件”tttt是指不止一套此类组分。可通过任何适合的方法将标记物连接到或包括进适体。通常，标记物使得适体能直接或间接地与连接到固体载体的捕获元件或受体缔合。捕获元件通常选择(或设计)为在其与标记物的相互作用中是高度特异的，并且在随后的处理步骤或操作中保持缔合。标记物使得能将适体-靶亲和复合物(或共价适体-靶亲和复合物)定位至固体载体上空间上确定的地址。因而，不同的标记物使得能将不同的适体-靶共价复合物定位至固体载体上不同的空间上确定的地址。标记物可为多核苷酸、多肽、肽核酸、锁核酸、寡糖、多糖、抗体、亲和体、抗体模拟物、细胞受体、配体、脂质、生物素、聚组氨酸，或这些结构的任何片段或衍生物，前述物质的任何组合，或者捕获元件(或接头分子，如下文描述的)可设计为或配置为与其结合或以其它方式与其特异缔合的任何其它结构。在用于检测目的的标记物的上下文中，标记物可以为染料、量子点、放射性标签、PCR引物位点、电化学官能团、以及酶加上可检测的酶底物。标记物可以包含两个不同的连接到适体以使适体可被检测到的结构域或区域(例如，PCR引物位点可包括两个不同的核酸序列，它们可连接到适体的5'或3'端，或在某些情况下，一个PCR引物位点连接至适体的5'端，另一PCR引物组(对)连接至适体的3'端。
通常，标记物可以在SELEX之前或之后添加至适体。在一个实施方案中，标记物包括在适体的5'端。在另一实施方案中，标记物包括在适体的3'端。在再另一实施方案中，标记物可以包括在适体的3'和5'端。在另一实施方案中，标记物可以为适体的内部区段。
靶分子：如本文所用，靶分子(或靶标)是指核酸可以期望方式(例如，结合靶标、通过催化改变靶标、以修饰或改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、共价连接至靶标(如在自杀性抑制剂中)、以及促进靶标与另一分子的反应)作用于其上的任何化合物或分子。靶分子的非限定性实例包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、有毒物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生tttt长因子、细胞、组织、任何前述物质的任何部分或片段，等等。实际上任何化学或生物效应子都可以为适合的靶标。任何大小的分子都可用作靶标。靶标还可经某些方式的修饰以增加靶标和核酸之间相互作用的可能性或强度。靶标还可以包括具体化合物或分子的任何细微变化，例如，对于蛋白的情况，例如其氨基酸序列的变化、二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化，或者任何其它不在本质上改变分子本体的操作或修饰，例如与标记组分的缀合。“靶分子”或“靶标”为能够结合适体的一种类型或种类的分子或多分子结构的一组拷贝。复数形式的“靶分子”或“靶标”是指不止一组此类分子。
如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其修饰形式，以及其类似物。核苷酸包括的种类包括嘌呤类(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤、及其衍生物和类似物)以及嘧啶类(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、及其衍生物和类似物)。
如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”、以及“多核苷酸”可互换使用，是指核苷酸的聚合物，其包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体以及这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰物，其中各种实体或部分在任何位置处连接到核苷酸单元都包括在内。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、以及“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸、以及多核苷酸为比术语适体更宽泛的术语，因此，术语核酸、寡核苷酸、以及多核苷酸包括作为适体的核苷酸的聚合物，但是术语核酸、寡核苷酸、以及多核苷酸并不限于适体。
如本文所用，当提及寡核苷酸使用时，术语“修饰”、“修饰的”、“修饰物”、及其任何变体意指，寡核苷酸的4个组成性核苷酸碱基(即，A、G、T/U、和C)的至少一个为天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，修饰的核苷酸赋予对寡核苷酸的核酸酶抗性。在一些实施方案中，修饰的核苷酸导致适体与蛋白靶标主导性地疏水相互作用，产生高结合效率和稳定的共结晶复合物。在C-5位有取代的嘧啶为修饰的核苷酸的实例。修饰可以包括骨架修饰、甲基化、不常tttt见碱基配对组合，例如异碱基异胞苷和异胍(isoguanidine)，等等。修饰也可包括3'和5'修饰，例如加帽。其它的修饰可包括一个或多个天然存在的核苷酸被类似物置换，核苷酸间修饰诸如例如不带电键联修饰(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)和带电键联修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，嵌入剂修饰(例如吖啶、补骨脂素等)，含有螯合剂的修饰(例如金属、放射性金属、硼和氧化性金属等)，含有烷化剂的修饰和具有修饰的键联的修饰(例如α-异头核酸等)。另外，任何通常存在于核苷酸的糖中的羟基可被膦酸酯基团或磷酸酯基团替换；被标准保护基团保护；或者被激活以准备对额外核苷酸或对固体载体的额外键联。5'和3'末端OH基团可以磷酸化或者被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一些实施方案中范围从约10至约80kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物、在一些实施方案中范围从约20至约60kDa的PEG聚合物或其它亲水或疏水的生物或合成聚合物所取代。在一些实施方案中，修饰在于嘧啶的C-5位。这些修饰可通过直接在C-5位处的酰胺键联或者通过其它类型的键联来产生。
多核苷酸也可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，其包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物例如甲基核苷。如上所述，一个或多个磷酸二酯键联可被其它连接基团替换。这些替代性连接基团包括其中磷酸酯被以下基团替换的实施方案：P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛(formacetal)”)，其中每个R或R'独立地为H或任选含有醚(-O-)键联的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。不是多核苷酸中的所有键联都必须相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代对设计终产物可以是有利的，由于可改变骨架结构，例如像聚酰胺骨架。
如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割寡核苷酸的核苷酸亚单tttt元之间磷酸二酯键的酶。如本文所用，术语“内切核酸酶”是指在寡核苷酸内部位点切割磷酸二酯键的酶。如本文所用，术语“外切核酸酶”是指切割连接寡核苷酸的末端核苷酸的磷酸二酯键的酶。生物流体通常含有内切核酸酶和外切核酸酶的混合物。
如本文所用，术语“核酸酶抗性的”和“核酸酶抗性”是指寡核苷酸作为内切或外切核苷酸的底物的能力减弱，以至于，当与此类酶接触时，该寡核苷酸或者不降解，或者与由未修饰的核苷酸构成的寡核苷酸相比降解更慢。
如本文所用，当提及核酸的修饰时，术语“至少一个嘧啶”是指核酸内的一个、几个或全部嘧啶，表示核酸内C、T或U的任一个或全部的任一次或每次出现可以为修饰的或未修饰的。
如本文所用，A、C、G、U和T分别表示dA、dC、dG、dU和dT，除非另有说明。
如本文所用，“核酸配体”、“适体”、以及“克隆”可互换使用，是指对靶分子有期望作用的非天然存在的核酸。期望作用包括但不限于结合靶标、通过催化改变靶标、以修饰或改变靶标或靶标的功能活性的方式与靶标反应、共价连接至靶标(如在自杀性抑制剂中)、以及促进靶标与另一分子的反应)。在一些实施方案中，该作用为对靶分子的特异结合亲和性，此类靶分子为不同于多核苷酸的三维化学结构，以独立于Watson/Crick碱基配对或三螺旋形成的机制结合核酸配体，其中适体不是被靶分子结合的具有已知生理功能的核酸。给定靶标的适体包括从核酸的候选混合物鉴定的核酸，其中适体为靶标的配体，采用的方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中可将相对于候选混合物中其它核酸与靶标有增加亲和性的核酸与候选混合物的剩余物分离；(b)将增加亲和性的核酸与候选混合物的剩余物分离；以及(c)扩增增加亲和性的核酸以生成富集配体的核酸混合物，因而鉴定了靶分子的适体。公认的是，亲和相互作用只是程度的问题；但是，在本tttt上下文中，适体对其靶标的“特异结合亲和性”意指该适体通常以比其结合混合物或样品中其它非靶组分高得多程度的亲和性与其靶标结合。“适体”或“核酸配体”为具有特定核苷酸序列的一个类型或种类的核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何适当数量的核苷酸。复数形式的“适体”是指不止一组此类分子。不同的适体可具有相同或不同的核苷酸数量。适体可以为DNA或RNA，以及可以为单链的、双链的、或含有双链或三链区域。
如本文所用，“蛋白”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化的”多肽、蛋白、肽或肽片段为基本上无细胞材料或其它来自细胞、组织或无细胞来源(从其获得氨基酸序列)的污染蛋白，或者当化学合成时基本上无化学前体或其它化学物。
“SPA适体”为能够结合SPA蛋白的适体。术语“SpA”、“SPA”或“Spa”可以互换使用，是指SPA蛋白或SPA适体。
“ClfA适体”为能够结合ClfA蛋白的适体。
“ClfB适体”为能够结合ClfB蛋白的适体。
“FnbA适体”为能够结合FnbA蛋白的适体。
“FnbB适体”为能够结合FnbB蛋白的适体。
“IsdA适体”为能够结合IsdA蛋白的适体。
“IsdB适体”为能够结合IsdB蛋白的适体。
“IsdC适体”为能够结合IsdC蛋白的适体。
“IsdH适体”为能够结合IsdH蛋白的适体。
“SasD适体”为能够结合SasD蛋白的适体。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公tttt开所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。单数形式的“一个(a/an)”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。“包含A或B”意指包括A或B，或A和B。还应理解的是，所有的碱基大小或氨基酸大小，以及为核酸或多肽给出的所有分子量或分子质量值，都是大概的，是出于描述需要而提供的。
另外，本文提供的范围理解为范围内所有值的速记法。例如，1至50的范围理解为包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任何数、数的组合或子范围(及其分数，除非上下文另有明确说明)。任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所列出范围内的任何整数值，以及适当时还包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。同样，本文列出的涉及任何物理特征如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所列范围内的任何整数，除非另有说明。如本文所用，“约”或“基本上由……组成”意指所指出的范围、值或结构的±20％，除非另有说明。如本文所用，术语“包括”和“包含”为开放型的，并同义使用。应理解，本文所用的术语“一个(a/an)”是指所列举组分的“一个或多个”。替代物(例如，“或”)的使用应理解为意指替代物的任一个、二者或其任何组合。
尽管类似或等同于本文描述的方法和材料可用于实施或试验本公开，但还是在下文描述了适合的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献都通过引用将它们整体并入。矛盾时，以包括术语解释在内的本说明书为准。另外，这些材料、方法和实例是解释性的，而不旨在限制。
概述
微生物表面上特异组分的结合剂可为用于不同检测平台的有价tttt值诊断工具。
SELEX
SELEX通常包括制备核酸的候选混合物，使候选混合物与期望的靶分子结合以形成亲和复合物，将亲和复合物与未结合的候选核酸分开，从亲和复合物分开和分离核酸，纯化核酸，以及鉴定特定的适体序列。该方法可以包括多轮，以进一步改进所选适体的亲和性。该方法可在过程中的一个或多个点包括扩增步骤。参见，例如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利No.5,475,096。SELEX法可用于产生与其靶标共价结合的适体以及与其靶标非共价结合的适体。参见，例如，标题为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX”的美国专利No.5,705,337。
SELEX法可用于鉴定含有修饰的核苷酸的高亲和性适体，该修饰的核苷酸赋予适体改善的特征，诸如例如体内稳定性的改善或改善的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX法鉴定的含修饰的核苷酸的适体在标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的美国专利No.5,660,985中有描述，其描述了含有在嘧啶的5′-和2′-位处被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利No.5,580,737(见上文)描述了含有一个或多个以2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)、和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的核苷酸的高度特异的适体。还参见标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布20090098549，其描述了具有扩展的物理和化学性质的核酸文库以及它们在SELEX和photoSELEX中的用途。
SELEX还可用于鉴定具有期望解离速率特征的适体。参见标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利申请公布20090004667，其描述了用于产生可结合靶分子的适体的改进的SELEX法。如上文提到的，这些慢解离速率适体称为tttt“SOMAmer”。描述了用于产生适体或SOMAmer试剂的方法以及具有较慢的从它们各自靶分子解离的速率的光适体或SOMAmer试剂。该方法涉及使候选混合物与靶分子接触，使核酸-靶复合物的形成出现，并进行慢解离速率富集操作，其中具有快解离速率的核酸-靶复合物将解离并不再形成，而具有慢解离速率的复合物仍保持完好。此外，该方法包括在产生候选核酸混合物中使用修饰的核苷酸，以生成具有改进解离速率性能的适体或SOMAmer试剂。
这种测定法的变形采用包括光反应性官能团的适体，光反应性官能团使得适体能共价结合或“光交联”它们的靶分子。参见例如标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”的美国专利No.6,544,776。这些光反应性适体也称为光适体。参见，例如，美国专利No.5,763,177、美国专利No.6,001,577和美国专利No.6,291,184，每一个专利的标题都为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”；还参见，例如，标题为“Photoselection of Nucleic Acid Ligands”的美国专利No.6,458,539。在微阵列与样品接触以及光适体有机会结合它们的靶分子后，使光适体进行光活化，并洗涤固体载体以除去任何非特异结合的分子。由于光适体上的光活化官能团形成的共价键，结合至光适体的靶分子通常不会被去除，因此可以使用苛刻洗涤条件。
在这两种测定形式中，适体或SOMAmer试剂都在与样品接触前固定在固体载体上。但是，在某些情况下，在与样品接触前将适体或SOMAmer试剂固定化不能提供最佳测定法。例如，适体或SOMAmer试剂的预固定可以引起适体或SOMAmer试剂与靶分子在固体载体表面的低效率混合，可能导致冗长的反应时间，并由此，延长温浴时间，以便允许适体或SOMAmer试剂有效结合它们的靶分子。进一步地，当在测定中采用光适体或光适体，并取决于用作固体载体的材料时，固体载体可以倾向于散射或吸收用于引起光适体或光适体和它们的靶分子间形成共价键的光。此外，取决于所采用的方法，对结合至tttt它们的适体或光适体的靶分子的检测可能是不精确的，因为固体载体的表面也暴露于任何所用的标记试剂并受其影响。最后，在固体载体上固定适体或SOMAmer试剂通常涉及在适体或SOMAmer试剂暴露于样品前的适体或SOMAmer试剂制备步骤(即，固定化)，并且该制备步骤可以影响适体或SOMAmer试剂的活性或功能性。
也已描述了这样的适体测定法：允许适体在溶液中捕获其靶标，接着采用设计的在检测前去除适体-靶混合物的特异组分的分离步骤。(参见，美国专利申请公布20090042206，标题为“Multiplexed Analyses of Test Samples”)。所描述的适体测定方法使得能通过检测和定量核酸(即，适体)来检测和定量测试样品中的非核酸靶标(例如，蛋白靶标)。所描述的方法建立了用于检测和定量非核酸靶标的核酸替代物(即，适体)，由此能使各种各样的包括扩增在内的核酸技术应用于更大范围的期望靶标(包括蛋白靶标)。
在标题为“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”的美国专利No.6,376,190中描述了其中靶标为肽的SELEX法的实施方案。
适体的化学修饰
适体可以含有改善其性质和特征的修饰的核苷酸。此类改善的非限定性实例包括体内稳定性、抗降解稳定性、与其靶标的结合亲和性、和/或改善的递送特征。
此类修饰的实例包括在核苷酸的核糖和/或磷酸和/或碱基位置处的化学取代。SELEX法鉴定的含修饰的核苷酸的适体在标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的美国专利No.5,660,985中有描述，其描述了含有在嘧啶的5′-和2′-位处被化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利No.5,580,737(见上文)描述了含有一个或多个以2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)、和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的核苷酸的高度特异的适体。还参见标题为tttt“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布No.20090098549，其描述了具有扩展的物理和化学性质的核酸文库以及它们在SELEX和photoSELEX中的用途。
C-5修饰的具体实例包括在脱氧尿苷C-5位处的取代，取代基独立地选自：苄基甲酰胺(可选地苄基氨基羰基)(Bn)、萘基甲基甲酰胺(可选地萘基甲基氨基羰基)(Nap)、色氨基甲酰胺(可选地色氨基羰基)(Trp)、以及异丁基甲酰胺(可选地异丁基氨基羰基)(iBu)，如下文立即阐述的。
C-5修饰的具体实例包括脱氧尿苷的取代C-5修饰的嘧啶的化学修饰还可与单独的或任何组合的2'-位糖修饰、环外胺的修饰、以及4-硫代尿苷的取代等组合。
代表性的C-5修饰的嘧啶包括：5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基甲酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-氟尿苷或tttt5-(N-[1-(2,3-二羟基丙基)]甲酰胺)-2'-脱氧尿苷)。
如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在组装多核苷酸之前或之后给予。核苷酸的序列可由非核苷酸组分中断。多核苷酸还可在聚合后进一步修饰，例如通过与标签组分缀合。
可以掺入本公开核酸序列中的修饰的核苷酸(例如，C-5修饰的嘧啶)的其它非限定性实例包括以下结构：
其中R'定义如下：
其中
R””选自支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基(OH)，卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR”)；伯酰胺(CONH2)；仲酰胺(CONHR”)；叔酰胺(CONR”R”')；磺酰胺(SO2NH2)；N-烷基磺酰胺(SONHR”)；
其中
R”、R”'独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C2))；苯基(C6H5)；R””取代的苯基环(R””C6H4)；其中R””定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR””')；其中R””'为支链或直链低级烷基(C1-C20)；和环烷基；其中R”＝R”'＝(CH2)n；
其中n＝2-10。
进一步地，C-5修饰的嘧啶核苷酸包括以下结构：
在一些实施方案中，修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。在C-5位有取代的嘧啶为修饰的核苷酸的实例。修饰可以包括骨架修饰、甲基化、不常见碱基配对组合，例如异碱基异胞苷和异胍，等等。修饰也可包括3'和5'修饰，例如加帽。其它的修饰可包括一个或多个天然存在的核苷酸被类似物置换，核苷酸间修饰诸如例如不带电键联(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的修饰和带电键联(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼和氧化tttt性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰和具有修饰的键联(例如α-异头核酸等)的修饰。另外，任何通常存在于核苷酸的糖上的羟基可被膦酸酯基团或磷酸酯基团替换；被标准保护基团保护；或者被激活以准备对额外核苷酸或固体载体的额外键联。5'和3'末端OH基团可以磷酸化或者被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中范围从约10至约80kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一个实施方案中范围从约20至约60kDa的PEG聚合物或其它亲水或疏水的生物或合成聚合物所取代。在一个实施方案中，修饰在嘧啶的C-5位处。这些修饰可通过直接在C-5位处的酰胺键联或者通过其它类型的键联来产生。
多核苷酸也可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，其包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖、碳环糖类似物、a-异头糖、差向异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物例如甲基核苷。如上所述，一个或多个磷酸二酯键联可被可替代的连接基团替换。这些可替代的连接基团包括磷酸酯被以下基团替换的实施方案：P(O)S(“硫代酯”)、P(S)S(“二硫代酯”)、(O)NR2(“酰胺化”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)，其中每个R或R'独立地为H或任选含有醚(-O-)键的取代或未取代的烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。不是多核苷酸中的所有键联都必须相同。由于可改变骨架结构，例如像聚酰胺骨架，因此糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代对设计终产物可以是有利的。
以下提供实例来解释某些具体特征和/或实施方案。这些实例不应解释为将本公开限制到所描述的具体特征或实施方案。
金黄色葡萄球菌
用于免疫荧光显微技术的表面抗原染色已被证实，其采用抗体-荧光团缀合物在体内感染模型中随时间检测较少数量的金黄色葡萄tttt球菌细胞(Timofeyeva等,2014)。通过噬菌体展示已鉴定了作为金黄色葡萄球菌细胞表面的特异配体的短肽，并且采用荧光量子点使得合成的共有肽(SA5-1)能够在加标生物样品中检测大约100CFU ml-1(Rao等，2013)。
主要的群为MSCRAMM(微生物表面成分识别粘附基质分子)、SERAM(可分泌扩展的文库粘附分子)、以及其它细胞外毒素和免疫逃避因子(Gill等2005；Speziale等2009)。可能采用完整细菌细胞用于SELEX(Cao等，2009)、或者用LiCl、溶葡萄球菌素、或2％SDS(Palma等，1998；Hussain等，2001；Roche等，2003)从细胞提取的或通过胰蛋白酶消化(shaving)(Ythier等，2012)释放的表面相关蛋白。但是，表面蛋白质组的构成在体外在不同菌株间变动，并且取决于培养基和生长阶段。另外，不同于金黄色葡萄球菌的葡萄球菌表达紧密相关的蛋白，这可以妨碍不经仔细反选择(counter-selection)来分离物种特异的试剂。因此，我们选择聚焦于已知大量地并且在大多数生长条件下表达的相当保守的金黄色葡萄球菌特异细胞表面蛋白，并以重组形式生成这些SELEX靶标。
暴露在金黄色葡萄球菌细胞表面上的蛋白可直接与包括药物和抗体在内的细胞外分子相互作用，并且这些粘附或免疫逃避蛋白代表了疫苗候选靶标(Stranger-Jones等，2006；McCarthy和Lindsay,2010；Dreisbach等，2011)。对金黄色葡萄球菌细胞被膜、细胞壁相关蛋白和蛋白附着机制都有相当好的了解(Dreisbach等，2011)。但是，对58个金黄色葡萄球菌菌株的全基因组序列的比较揭示了参与粘附或免疫应答逃避的蛋白的变体，或者在一些菌株中消失或截短的蛋白(McCarthy和Lindsay,2010)。粘附素包括通过保守的LPXTG基序(Schneewind等，1995)共价连接到肽聚糖的表面蛋白家族。表面蛋白的蛋白质组学和转录组学概况已显示与金黄色葡萄球菌中的粘附-表型很好地相关(Roche等，2003；Ythier等，2012)。
我们生成了针对10种表面相关蛋白的适体，其包括SpA、ClfA、ttttClfB、FnbA、FnbB、SasD、IsdA、IsdB、IsdC以及IsdH。所有这些蛋白都通过分选酶(sortase)介导的在LPXTG分选酶基序的苏氨酸和甘氨酸之间的切割连接到细胞壁，并成为酰胺连接到肽聚糖的五甘氨酸交联桥(Marraffini等，2006)。由于我们的目标是获得金黄色葡萄球菌细胞的结合剂，所以我们产生代表表面暴露结构域但缺乏信号序列和细胞壁包埋结构域的重复区域的重组蛋白。金黄色葡萄球菌蛋白A(SpA)存在于细菌表面并分泌到细胞外环境中。SpA结合抗体的Fc区域和B细胞受体(IgM)的Fab区域，由此阻断调理吞噬并导致B细胞死亡，因而SpA为有力的免疫逃避因子(Falugi等，2013；Kobayashi和Deleo,2013)。由于SpA在金黄色葡萄球菌之间相当保守，但不存在于诸如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)的非致病葡萄球菌中，所以这种蛋白代表了有吸引力的诊断靶标。也已描述了带有截短的SpA变体的临床分离株，这些变体缺乏带有C末端分选信号的XC区域，因此主要在细胞外发现(Sorum等，2013)。ClfA和ClfB为结构上相关的纤维蛋白原结合蛋白(McDevitt等，1997；Ni Eidhin等，1998)。ClfB为负责粘附至前鼻孔脱落上皮细胞的关键因子之一，并且通常在生长的早对数期产生(Ni Eidhin等，1998)。FnbA和FnbB粘附至细胞外基质的成分纤连蛋白和弹性蛋白二者，对于感染期间宿主组织定植很重要(Roche等，2004)。SasD是推定的粘附蛋白，生理作用未知(Roche等，2003；Ythier等，2012)。四种蛋白属于铁反应性表面决定簇(Isd)系统，该系统在金黄色葡萄球菌中于铁限制条件下诱导，并且对于从血红蛋白捕获血红素(IsdB、IsdH)以及将其运输(IsdA、IsdC)穿过细胞壁是重要的(Mazmanian等，2003；Grigg等，2010)。
作为概念验证以及评估它们的效率，将针对金黄色葡萄球菌细胞表面相关蛋白生成的适体用于捕获和采用qPCR检测金黄色葡萄球菌，以及也通过流式细胞仪直接检测细胞。
SOMAmer(慢解离速率修饰的适体)试剂由单链DNA(ssDNA)制备并具有相当长的(>30min)解离速率，这些单链DNA含有在5-主要tttt位置处被氨基酸侧链模拟物修饰的嘧啶残基(Gold等，2010)。这些特征带来了与标准RNA或DNA适体相比具有更好的亲和性和更佳的动力学特性的适体。实际上任何蛋白都可用于SELEX(通过指数富集进行配体的系统进化)，在以动力学挑战、分离、以及扩增进行的多轮选择中从修饰的ssDNA的随机文库中生成特异的、高亲和性适体(Gold等，2010；Vaught等，2010)。适体相对于抗体的优点包括在溶液中超常的热稳定性，较低分子量，较高的多重能力，对热、干燥和溶剂的化学稳定性，可逆的复性，容易的试剂制备，不同批次间性能的一致以及较低的成本。已经针对>1000种人蛋白生成了适体，它们为由SomaLogic开发的SOMAscanTM蛋白质组平台在小(0.1ml)血液样品中同时并以高精确性测量这些蛋白的基础。这种高度多重的测定法的应用已导致在各个药学领域中发现生物标志物(Gold等，2012)。就微生物蛋白而言，我们之前报道了针对艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素的适体的特征，并显示了这些结合剂的大范围的潜在应用(Ochsner等，2013)。
采用纯化的重组或天然蛋白，以多种修饰的DNA文库通过SELEX生成针对几种金黄色葡萄球菌细胞表面相关蛋白的慢解离速率修饰的适体(SOMAmer试剂)试剂。获得对葡萄球菌蛋白A(SpA)、凝集因子(ClfA、ClfB)、纤连蛋白结合蛋白(FnbA、FnbB)以及铁调节的表面决定簇(Isd)具有次纳摩尔Kd的高亲和性结合剂。进一步的筛选揭示了特异性结合至全部测试菌株的金黄色葡萄球菌细胞、但不结合至其它葡萄球菌或其它细菌的几种适体。SpA和ClfA适体证明对于从低细胞密度基质(如通过培养和PCR所示)中选择性捕获和富集金黄色葡萄球菌细胞是有用的，得到改进的检测限和有效去除PCR抑制剂。当以适体覆盖细菌细胞表面以及随后通过适体的qPCR时，对金黄色葡萄球菌细胞的检测提高了几个数量级。此外，荧光标记的SpA适体展示了它们在流式细胞术中作为直接检测剂的用途。
包括适体组合物的试剂盒
本公开提供包括本文描述的任何适体的试剂盒。此类试剂盒可例如包含(1)至少一种结合靶标的适体；和(2)至少一种药学上可接受的载体，例如溶剂或溶液。其它的试剂盒组分可任选地包括，例如：(1)本文确定的任何药学上可接受的赋形剂，例如稳定剂、缓冲剂等；(2)至少一种用于容纳和/或混合该试剂盒组分的容器、小瓶或类似装置；以及(3)递送装置。
在另一方面，本公开提供了结合SEQ ID NO:9代表的SPA蛋白的适体序列。该核苷酸序列可以进一步归纳为以下序列：
GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(SEQ ID NO：14)
其中序列中的“W”代表可以被C-5修饰的嘧啶占据的位置，“N”代表可以被任何未修饰的或修饰的核苷酸占据的位置，并且n为0至2(或0、1或2)。
在另一方面，N为C、T、G或A。在另一方面，N为C、T或A。
在另一方面，该核苷酸序列可以包括多至约100个核苷酸、多至约95个核苷酸、多至约90个核苷酸、多至约85个核苷酸、多至约80个核苷酸、多至约75个核苷酸、多至约70个核苷酸、多至约65个核苷酸、多至约60个核苷酸、多至约55个核苷酸、多至约50个核苷酸、多至约45个核苷酸、多至约40个核苷酸。
在本公开的另一方面，该适体可以与SEQ ID NO:14的任一种是至少约95％同一的、至少约90％同一的、至少约85％同一的、至少约80％同一的或至少约75％同一的。在另一实施方案中，该适体包括SEQ ID NO:14的序列片段。
在另一方面，该适体包含1至50(或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、tttt39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)个C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含5至30(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含10至15(或10、11、12、13、14或15)个C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，该适体包含约1％至100％(或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约10％至约50％(或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约20％至约40％(或20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约25％至约35％(或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约27％至约33％(或27、28、29、30、31、32或33％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约37％至约43％(或37、38、39、40、41、42、43％)的C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，W可以代表C-5修饰的尿苷或胞苷。
在另一方面，W可以代表以下立即阐述的C-5修饰的嘧啶：
其中R'定义如下：
其中
R””选自支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基(OH)，卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR”)；伯酰胺(CONH2)；仲酰胺(CONHR”)；叔酰胺(CONR”R”')；磺酰胺(SO2NH2)；N-烷基磺酰胺(SONHR”)；
其中
R”、R”'独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C2))；苯基(C6H5)；R””取代的苯基环(R””C6H4)；其中R””定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR””')；其中R””'为支链或直链低级烷基(C1-C20)；以及环烷基；其中R”＝R”'＝(CH2)n；
其中n＝2-10。
在另一方面，W可以代表选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-奈基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)及其组合的C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，W代表选自5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)和5-(N-奈基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)及其组合的C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，W可以代表包含显示在式I中的结构的化合物：
其中
R独立地为a-(CH2)n-，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；
RX1独立地选自：
其中＊表示RX1基团与-(CH2)n-基团的连接点；以及
其中
RX4独立地选自取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基；卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；伯酰胺(CONH2)；仲酰胺(CONHRX2)；叔酰胺(CONRX2RX3)；磺酰胺(SO2NH2)；N-烷基磺酰胺(SONHRX2)；
RX2和RX3每一次出现独立地选自取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代的苯基环(RX4C6H4)，其中RX4定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)，其中RX5为支链或tttt直链低级烷基(C1-C20)；以及环烷基，其中RX2和RX3一起形成取代的或未取代的5或6元环；
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2以及-叠氮基；
R'独立地选自-H、-OAc；-OBz；-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)；以及-OSiMe2tBu；
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐；
Z独立地选自-H、取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4)；
及其盐；
具有以下例外：
当n＝4，则RX1不能为H；
当n＝3，则RX1不能为CH3；
当n＝0，则RX1不能为–CH(CH3)2；以及
当n＝2，RX1为以及RX4为羟基，则RX1不能为
在相关方面，n为选自1、2或3的整数。
在相关方面，RX1选自：
其中
＊表示RX1基团与-(CH2)n-基团的连接点；以及
Z独立地选自-H、取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4)。
在相关方面，RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6)；-OH；-F以及羧酸(COOH)。
在相关方面，X独立地选自-H、-OH、-OMe以及–F。
在相关方面，R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
在相关方面，R"为三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
在另一方面，本公开提供包含选自式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)和VIII(2NEdC)的结构的化合物：
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2和-叠氮基。
在本公开的另一方面，适体可以对其靶标具有约10nM或更小的解离常数(Kd)。在另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约15nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约20nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约25nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约30nM或更小的解离常数(Kd)。在tttt再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约35nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约40nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约45nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约50nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有范围约3-10nM(或3、4、5、6、7、8、9或10nM0)的解离常数(Kd)。采用多点滴定并拟合等式y＝(max-min)(蛋白)/(Kd+蛋白)+min，可通过结合测定法测定适合的解离常数。应理解的是，解离常数的测定是高度依赖于测量条件，因此这些数值可以随一些因素显著变化，例如平衡时间，等。在其它实施方案中，适体的Kd小于或等于选自SEQ ID NO:1-15的适体的Kd。
结合ClfA蛋白的适体序列的基序通过SEQ ID NO:13表示。该序列基序可以进一步归纳为以下序列：
AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO：15)
序列中的“W”代表可以由C-5修饰的嘧啶占据的位置，并且“N”代表可以由任何未修饰的或修饰的核苷酸或间隔序列或接头占据的位置。进一步地，n可以为1至30(或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)、或2至20(或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)、或5至18(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)、或10至16(或10、11、12、13、14、15或16)的数值，或N约为16。
在另一方面，该核苷酸序列可以包括多至约100个核苷酸、多至约95个核苷酸、多至约90个核苷酸、多至约85个核苷酸、多至约80个核苷酸、多至约75个核苷酸、多至约70个核苷酸、多至约65个核苷酸、多至约60个核苷酸、多至约55个核苷酸、多至约50个核苷酸、多至约45个核苷酸、多至约40个核苷酸、多至约35个核tttt苷酸、多至约30个核苷酸、多至约25个核苷酸、以及多至约20个核苷酸。
在本公开的另一方面，该适体可以与SEQ ID NO:15的任一种是至少约95％同一的、至少约90％同一的、至少约85％同一的、至少约80％同一的或至少约75％同一的。在另一实施方案中，该适体包括SEQ ID NO:15的序列片段。
在另一方面，该适体包含约1％至100％(或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约10％至约50％(或10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约20％至约40％(或20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约25％至约35％(或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约27％至约33％(或27、28、29、30、31、32或33％)的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，该适体包含约37％至约43％(或37、38、39、40、41、42、43％)的C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，W可以代表C-5修饰的尿苷或胞苷。
在另一方面，W可以代表以下立即阐述的C-5修饰的嘧啶：
其中R'定义如下：
其中
R””选自支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基(OH)、卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR”)；伯酰胺(CONH2)；仲酰胺(CONHR”)；叔酰胺(CONR”R”')；磺酰胺(SO2NH2)；N-烷基磺酰胺(SONHR”)；
其中
R”、R”'独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C2))；苯基(C6H5)；R””取代的苯基环(R””C6H4)；其中R””定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR””')；其中R””'是支链或直链低级烷基(C1-C20)；以及环烷基；其中R”＝R”'＝(CH2)n；
其中n＝2-10。
在另一方面，W可以代表选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)及其组合的C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，W可以代表选自5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)和5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)及其组合的C-5修饰的嘧啶。在另一方面，W可以代表包含显示在式I中的结构的化合物：
其中
R独立地为-(CH2)n-，其中n为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数；
RX1独立地选自：
其中＊表示RX1基团与-(CH2)n-基团的连接点；以及
其中
RX4独立地选自取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基；卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX2)；伯酰胺(CONH2)；仲酰胺(CONHRX2)；叔酰胺(CONRX2RX3)；磺酰胺(SO2NH2)；N-烷基磺酰胺(SONHRX2)；
RX2和RX3每一次出现独立地选自取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20)；苯基(C6H5)；RX4取代的苯基环(RX4C6H4)，其中ttttRX4定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COORX5)，其中RX5为支链或直链低级烷基(C1-C20)；以及环烷基，其中RX2和RX3一起形成取代的或未取代的5或6元环；
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2和-叠氮基；
R'独立地选自-H、-OAc；-OBz；-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)；和-OSiMe2tBu；
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐；
Z独立地选自-H、取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4)；
及其盐；
具有以下例外：
当n＝4，则RX1不能为H；
当n＝3，则RX1不能为CH3；
当n＝0，则RX1不能为–CH(CH3)2；以及
当n＝2，RX1为以及RX4为羟基，则RX1不能为
在相关方面，n为选自1、2或3的整数。
在相关方面，RX1选自：
其中
＊表示RX1基团与-(CH2)n-基团的连接点；以及
Z独立地选自H、取代的或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4)。
在相关方面，RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6)；-OH；-F以及羧酸(COOH)。
在相关方面，X独立地选自-H、-OH、-OMe和-F。
在相关方面，R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
在相关方面，R"为三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
在另一方面，本公开提供了包含选自式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)和VIII(2NEdC)的结构的化合物：
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2以及-叠氮基。
在本公开的另一方面，适体可以对其靶标具有约10nM或更小的解离常数(Kd)。在另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约15nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约20nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约25nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性tttt实施方案中，适体对靶蛋白具有约30nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约35nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约40nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约45nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有约50nM或更小的解离常数(Kd)。在再另一示例性实施方案中，适体对靶蛋白具有范围约3-10nM(或3、4、5、6、7、8、9或10nM0)的解离常数(Kd)。采用多点滴定并拟合等式y＝(max-min)(蛋白)/(Kd+蛋白)+min，可通过结合测定法测定适合的解离常数。应理解的是，解离常数的测定是高度依赖于测量条件，因此这些数值可以随一些因素显著变化，例如平衡时间，等。在其它实施方案中，适体的Kd小于或等于选自SEQ ID NO:1-15的适体的Kd。
本公开还提供了用于检测样品中存在或不存在微生物的方法，其包括：使该样品与适体接触并进行测定以检测该适体，其中检测到第二适体表明样品中存在该微生物，并且其中未检测到第二适体表明样品中不存在该微生物；其中，该适体包含具有选自GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)xGWC(SEQ ID NO:14)和AWCWGGWWC(N)yWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO:15)的序列的核酸分子，以及其中W每一次出现独立地为C-5修饰的嘧啶，N为任何未修饰的或修饰的核苷酸，以及x为0、1、2、3、4或5，y为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
在另一方面，该C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(BndC)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PEdC)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(PPdC)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NapdC)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NapdC)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(NEdC)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(2NEdC)；5-(N-苄基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)；5-(N-tttt异丁基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)；5-(N-色氨基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)；5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2′-脱氧尿苷氯化物和5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。
在另一方面，该适体是可扩增的。
在另一方面，该测定选自PCR、qPCR、质谱、测序以及杂交。
在另一方面，该微生物选自细菌细胞、寄生虫和病毒。在相关方面，该微生物为细菌细胞。在再另一相关方面，该细菌细胞为致病性的。
在另一方面，该细菌细胞为葡萄球菌细胞。
在另一方面，该细菌细胞为金黄色葡萄球菌细胞。
在另一方面，该适体包含具有选自SEQ ID NO:1-8和10-12的序列的核酸分子，其中W为C-5修饰的嘧啶。
在另一方面，本公开提供了包含SEQ ID NO:1-15的组合物。
以下提供实施例来解释某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本公开限制到所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1：选择和鉴定与金黄色葡萄球菌蛋白有结合特异性的适体
本实施例提供代表性方法来选择和生成对以下10种表面相关的金黄色葡萄球菌蛋白有结合特异性的适体：SpA、ClfA、ClfB、FnbA、FnbB、SasD、IsdA、IsdB、IsdC以及IsdH。
金黄色葡萄球菌靶标的纯化
编码期望靶标或靶结构域的基因相关部分用引物从金黄色葡萄球菌NRS384(USA300)基因组DNA中进行PCR扩增并克隆进pCR-Script SK+(Stratgene)。clfA、clfB、fnbA、sasD、isdA、isdB、isdC、以及isdH基因作为BamHI-SacI盒转移进带有氨基末端链霉亲和素标记物和羧基末端His10标记物的表达载体pET-51b(EMD-Novagen)。将靶标之一fnbB作为NdeI-BamHI片段克隆进pET-14b(EMD-Novagen)，其带有氨基末端His10标记物。对质粒测序以确认基因身份以及所克隆的DNA片段与载体的His标记物和链霉亲和素标记物编码序列的正确基因融合。
重组蛋白在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)或BL21(DE3)/pLysE(EMD/Novagen)中过表达。对生长温度(25-37℃)和诱导时间(4-15h)，优化可溶性蛋白的最佳表达条件。来自0.1至0.8l培养物的细胞用10ml BugBuster/Benzonase试剂(EMD Millipore)裂解。通过在Ni-NTA琼脂糖和Strep·SuperflowTM琼脂糖(EMD Millipore)上相继亲和层析，从可溶性组分纯化重组体，带His10/链霉亲和素标记物的蛋白。从VWR购得天然葡萄球菌蛋白A，并以NHS-PEG4-生物素(Pierce Biotechnology)生物素化。采用Quick Start Bradford蛋白测定试剂盒(BioRad)测定蛋白浓度。
当在大肠杆菌中过表达时，全部10种重组金黄色葡萄球菌细胞表面蛋白都在可溶性组分中发现。在Ni-NTA琼脂糖和Streptactin琼脂糖上的相继亲和层析获得0.1-1.5mg的每种蛋白，>95％纯度(见图3)。
适体选择
具有5-(N-苄基甲酰胺)-dU(BndU)、5-(N-萘基甲基甲酰胺)-dU(NapdU)、以及5-(N-色氨基甲酰胺)-dU(TrpdU)的独立文库被用于以金黄色葡萄球菌蛋白来进行SELEX。每一选择都从1nmol(1014-1015)序列开始，该序列含有40个连续随机位置，侧接PCR扩增所需的固tttt定序列。基本上按所描述的进行SELEX(Gold等，2010；Vaught等，2010；Ochsner等，2013)。在整个SELEX过程以及随后的结合测定中使用缓冲液SB18T，其由40mmol l-1HEPES pH 7.5、0.1mol l-1NaCl、5mmol l-1KCl、5mmol l-1MgCl2、以及0.05％Tween-20构成。进行8轮选择，并且从第2轮开始，用10mmol l-1硫酸葡聚糖进行动力学挑战以便有利于慢解离速率。用结合重组蛋白上的His10标记物的顺磁Talon(Invitrogen)或用于生物素化SPA的MyOne链霉亲和素C1珠粒(Life Technologies)完成适体-靶复合物的分离。以80μl 40mmol l-1NaOH将所选的序列从珠粒结合的靶标上洗脱，以20μl的160mmol l-1HCl中和，并采用KOD EX DNA聚合酶(Invitrogen-Life Technologies)进行PCR扩增。按所描述的，以KOD EX DNA聚合酶通过引物延伸从PCR产物的反义链制备用于下一轮的修饰DNA并进行纯化(Gold等，2010)。
将从第3轮到第8轮选择的DNA的DNA复性动力学分析(C0t)用于评估随后多轮期间的序列衔接(convergence)，表明一些序列或序列家族的丰度增加。克隆在溶液结合放射测定(见下文)中表现出良好亲和性(Kd≤10nmol l-1)的适体池，每个适体池测定48个克隆的序列。基于序列模式和差异性选择多至12种不同适体并通过酶促制备，用于进一步的表征。
采用标准亚磷酰胺化学以1μmol规模制备作为48-50-mer的合成适体，并进行HPLC纯化。它们含有5’生物素-dA或5’荧光素-生物素-dA，以及在3’端含有倒转的dT核苷酸(3’idT)，用于增加3’至5’外切核酸酶稳定性。
采用3个独立的ssDNA文库，用这些蛋白进行8轮SELEX，并且C0t复性动力学表明序列复杂度的降低。适体池亲和性测定证实对以ssDNA C-5修饰的核苷酸BndU、NapdU或TrpdU获得的一共22个适体池成功地选择了适体，适体池亲和性在0.13-8.90nmol l-1的范围。观察到特异结合金黄色葡萄球菌细胞，但不结合表皮葡萄球菌、tttt溶血葡萄球菌、化脓性链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(E.faecalis)、大肠杆菌或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。
比对针对来自每一适体池的48个克隆测定的序列显示多拷贝克隆以及共有共同序列模式的家族。在亲和性测定中筛选代表性克隆，并且适体的Kd在0.03-2.17nmol l-1的范围(表1)。
表1.用于金黄色葡萄球菌细胞表面蛋白的适体，显示在SELEX中获得的原始全长序列的亲和性(Kd)
表1中的适体通常为39个至40个核苷酸长并包含C-5修饰的嘧啶(例如BndU、TrpdU或NapdU)。另外，表1的适体包含约8个至约21个C-5修饰的嘧啶(8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19或21个C-5修饰的嘧啶)，或者约20％C-5修饰的嘧啶至约53％C-5修饰的嘧啶(或者20％、22.5％、25％、27.5％、30％、30.8％、32.5％、35％.37.5％、40％、45％、47.5％或52.5％)。表1中的适体通常具有约0.03nM至约4.7nM(或0.03、0.07、0.08、0.14、0.15、0.16、0.22、0.35、0.47、0.63、0.73、0.79、0.84、1.3、1.35、1.98、2.17、3.9以及4.73nM)的Kd。
在以下表2中鉴定了所选的分别靶向SPA蛋白和ClfA蛋白的克隆的核苷酸序列。
表2.通过SELEX鉴定的适体的适体核苷酸序列选择
*表示靶向SPA蛋白的序列中核苷酸“W”为C-5修饰的核苷酸(特别是NapdU)
+表示靶向ClfA蛋白的序列中核苷酸“W”为C-5修饰的核苷酸(特别是BndU)
结合SPA蛋白的适体序列的基序(4520)通过SEQ ID NO:9表示。该序列基序可以进一步归纳为以下序列
GGCWWCGGGWACCWAWWAWNGGWWWAGCC(N)nGWC(SEQ ID NO：14)。
序列中的“W”代表可以由C-5修饰的嘧啶占据的位置，并且“N”代表可以由任何未修饰的或修饰的核苷酸占据的位置，以及n为0至2(或0、1或2)。
结合ClfA蛋白的适体序列的基序(4503)由SEQ ID NO:13表示。该序列基序可以进一步归纳为以下序列：
AWCWGGWWC(N)nAWCWGGWWWWWAAG(SEQ ID NO：15)
序列中的“W”代表可以由C-5修饰的嘧啶占据的位置，并且“N”代表可以由任何未修饰的或修饰的核苷酸占据的位置。另外，n可以为1至30(或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或)、或2至20(或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)、或5至18(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)、或10至16(或10、11、12、13、14、15或16)的数值。
实施例2：通过适体结合和选择性捕获细菌细胞
本实施例显示所选的和鉴定的结合金黄色葡萄球菌细胞表面蛋白的适体也结合全细胞并能够在混合的细菌培养物中选择性地捕获金黄色葡萄球菌细胞。
适体平衡和全细胞放射标记结合测定
在结合测定前，通过在95℃加热5min，然后在10-15min时间内冷却至室温，使适体正确折叠。
按所描述的(Gold等，2010)，使用系列稀释的蛋白(0.001-100nmol l-1)以及用于分离至滤板上的Zorbax PSM-300A(Agilent Technologies)树脂，在放射性标记适体(10-20pmol 1-1)的平衡溶液结合测定法中确定亲和性(Kd)。
在克隆前，在2h平衡结合测定中，还对适体池测试对金黄色葡萄球菌的特异结合，采用表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、化脓性链球菌、粪肠球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌作为对照。细胞密度范围在105-108CFU mL-1，并且向结合缓冲液添加0.1mmol l-1硫酸葡聚糖和0.35mol l-1NaCl以减少非特异背景。另外，筛选各个适体对8种不同的金黄色葡萄球菌菌株的结合，这些菌株属于不同的谱系，其包括NRS382、NRS383、NRS384、NRS123、NRS385、NRS386、NRS103(NARSA)、以及ATCC 29213(ATCC)。
对纯化的金黄色葡萄球菌蛋白的适体结合亲和性与观察到的对全细菌的结合很好地相关。2个SpA-NapdU克隆(4520-8和4520-9)和3个SpA-TrpdU克隆(4531-55、4531-56、4531-94)能够结合所有测试的金黄色葡萄球菌菌株的全细胞，在放射性标记过滤结合测定中检测限为每孔～104个细胞(105-106个细胞ml-1)。没有观察到结合表皮葡萄球菌或溶血葡萄球菌细胞，表明了这些适体的良好特异性(见图4B)。对于ClfA和ClfB适体，也观察到类似的结合特征。相比之下，大多数的强力结合金黄色葡萄球菌的FnbA和FnbB适体对表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌有一些亲和性。针对Isd蛋白、特别是IsdC的适tttt体显示强力和特异结合金黄色葡萄球菌细胞，并且当细菌已在铁限制性条件下生长时信号增强。SasD适体未能结合全细胞，尽管还不清楚这是否是由于相对适中的亲和性或由于这种表面蛋白的低表达水平。
以细胞表面蛋白导向的适体捕获金黄色葡萄球菌细胞
采用PBDC引物(5’光可断裂生物素、D-间隔物以及cy3)，通过引物延伸酶促制备生物素化的适体。为了固定，将1pmol的PBDC适体添加至20μl MyOne链霉亲和素C1珠粒(10mg ml-1)，并摇动15分钟，基于对未捕获的上清组分中cy3的测量，得到～90％的固定效率。使细菌在含有5％绵羊血和产生铁限制性条件的0.1mmol l-1联吡啶的LB肉汤培养基中或胰胨大豆琼脂上于35℃生长16小时。将在50μl SB18T中含有多至106个细菌的细胞悬浮液添加到捕获珠粒。37℃下摇动温浴1h后，洗涤该珠粒并在50μl SB18T中重悬。未捕获上清液、洗涤组分中、以及该珠粒上的细胞通过在LB琼脂上系列稀释的定量平板法计数。还在混合群体中以及在一定范围的细胞密度上(101-107CFU ml-1)确定通过定量培养获得的捕获效率。
每个细胞上的靶分子数对于任何这些表面蛋白来说都是未知的，并且表达水平可以随生长条件和生长阶段变化。但是，假定每个细胞1000个拷贝以及采用107CFU ml-1将代表20pmol l-1的靶标浓度，这等于或低于典型的适体Kd。因此，放射性标记过滤结合测定法(适体以10-20pmol l-1低浓度存在)仅限于相对高的细胞密度。为了促进结合反应，我们采用更高浓度的(20nmol l-1)生物素化SpA适体作为连接珠粒的捕获剂，并且能够检测少至0.1mL样品中50个细胞(图1A)。对于有效捕获此类低细胞密度的金黄色葡萄球菌，需要10nmol l-1或更高的适体浓度。适体能够选择性结合含有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、以及大肠杆菌各105-106CFU ml-1的混合培养物中的金黄色葡萄球菌细胞。有最佳表现的结合剂为SpA 4520-8和ClfA 4503-73，与随机序列修饰的适体对照比较，显示出低的非特异结合。在宽范围tttt的细胞密度上，从5×102至5×109CFU ml-1，在顺磁适体珠粒上捕获金黄色葡萄球菌是有效的(图5)。
实施例3：采用基于适体的富集来增强金黄色葡萄球菌检测
本实施例提供用于增强样品中微生物(例如，金黄色葡萄球菌)检测的示例性方法，通过基于适体的捕获富集样品中的微生物和随后的检测方法(例如，PCR)进行。
用连接至顺磁SA珠粒的25nmol l-1合成的生物素化的适体(50mer)也完成了金黄色葡萄球菌细胞的捕获(15min，37℃，间歇性摇动)。珠粒用100μl的SB18洗涤两次以除去任何未结合的细胞，并重悬在50μl SB18中。添加全长可扩增适体(50μl的20nmol l-1)，并在间歇性摇动下将珠粒于37℃温浴15min，以使这些表面组分特异的适体覆盖细胞。2min洗涤5次，每次用100μl的SB18/1mmol l-1硫酸葡聚糖/0.01％Tween-20以及用100μl的SB18两次，之后洗脱结合的适体，在引物捕获珠粒上清理掉，并用于以特异于5’和3’固定区的引物进行的qPCR，如所描述的(Gold等，2010)。
金黄色葡萄球菌细胞的捕获证明对通过PCR进行的下游检测是有用的，无论是细胞密度低时用于富集样品，还是除去PCR抑制剂。与基因组靶标的qPCR相比，由于与单个基因组相比每个细胞含有数百个拷贝的靶表面组分用于检测，因此用全长可扩增的适体覆盖金黄色葡萄球菌细胞表面使得能通过适体的qPCR更快地检测。在显示在图2中的实施例中，金黄色葡萄球菌细胞被不可扩增的ClfA适体捕获并被可扩增的SpA适体或随机序列适体对照覆盖，接着采用适体特异引物进行qPCR。另行地，将细胞裂解并采用金黄色葡萄球菌特异基因组引物进行qPCR，这与结合的适体的qPCR相比显然是低效的。观察到qPCR检测中多至8个循环的改变，从适体qPCR的10个循环到基因组qPCR的18个循环，这与几百个拷贝(28＝256)的表面结合的适体与仅单个基因组的比例是一致的。由于不具有ClfA或ttttSpA的表皮葡萄球菌细胞不产生任何高于背景的适体扩增，因此ClfA适体捕获和SpA适体检测的方法是特异于金黄色葡萄球菌细胞的。在珠粒上捕获细菌，接着用适体检测，这不仅使得能够从低细胞密度悬浮液进行富集，还使得能够有效去除PCR抑制剂。当细胞处于含有过量盐(例如，1mol l-1NaCl或0.5mol l-1KCl)或低水平溶剂(例如，5％异丙醇)的基质中时，直接的基因组PCR是不成功的，除非首先捕获细胞以除去这些已知的PCR抑制剂(Abu Al-Soud和Radstrom,1998；Schrader等，2012)。
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