一种用于检测肿瘤突变的双标签接头序列及检测方法
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域，尤其涉及用于检测肿瘤突变的双标签接头序列及检测方法。
背景技术
目前的二代测序由于样品制备(文库制备)和仪器系统本身的原因(DNA本身的氧化损伤或脱氨基损伤等、建库过程中PCR酶复制时本身引入的突变、测序时仪器读取碱基时引入的错误等)，测序得到的每个碱基出现错误的概率在1/1000-1/100之间，即每1000个碱基就会出现1到10个错误碱基。
在germline mutation(生殖系细胞突变)检测中由于产生突变位点在样本中占的比率只有0％，50％和100％ 3种情况，因此系统性的碱基读取错误可以通过数据分析中同一区域的overlap reads来校正，从而达到很高的测序准确度；
而对于肿瘤细胞突变等体细胞突变(somatic mutation)等突变位点细胞之间具有很大的异质性(每个细胞的突变位点都可能不同)，这类突变在样本中占的比例很低(低于1％)，这类突变无法使用传统的生物信息学方法区分(系统碱基错误率作为噪音和肿瘤突变位点的信号之间信噪比过低)，因此肿瘤位点突变用常规的测序方法无法准确检测。
后来发展出来的分子标签(UMI unique molecule identifier)可以有效的解决这一问题。通过在样本原始的DNA分子上引入随机序列标签，给每一个分子都做上独特的标记，然后每个分子在建库过程中得到扩增并最后测序，通过生物信息学分析，可以去除掉大部分建库和测序过程中产生的突变(错误)，使测序的碱基错误率降低到1×10-5，假设肿瘤突变检测需要10倍的信噪比，此种方法可以准确检测1×10-4的突变率。
如何提高肿瘤突变率检测的灵敏度，是一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高肿瘤突变率检测灵敏度的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种用于检测肿瘤突变的双标签接头序列，其特征在于，所述接头序列由接头引物P5和接头引物P7合成，其中接头引物P5为SEQ ID NO：1通过I5 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示，接头引物P7为FFFFFEEEEEDDDDDNNNNNNNNNNNN依次连接在SEQ ID NO：3的5’端；SEQ ID NO：3再通过I7 index序列连接SEQ ID NO：4所得序列所示；
SEQ ID NO：1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；
SEQ ID NO：2：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
SEQ ID NO：3：
AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；
SEQ ID NO：4：
ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
所述FFFFF为酶切位点保护碱基，EEEEE为酶切位点，DDDDD为定位标签序列，NNNNNNNNNNNN为随机分子标签序列；FFFFF、DDDDD、EEEEE包括但不限于5个相同碱基，I7 index序列为6-8个碱基；NNNNNNNNNNNN为4到12个随机碱基，且没有四个连续相同的碱基；优选的，NNNNNNNNNNNN表示为BDHVBDHVBDHV，其中B表示该位置是除A外的碱基，D位置表示该位置是除C外的碱基，H表示该位置是除G外的碱基，V表示该位置是除T外的碱基。
进一步，所述I5 index序列选自SEQ ID NO:5-12；所述I7 index序列选自SEQ IDNO:13-24；
任选的，所述DDDDD的序列可以和所属EEEEE的序列部分重叠，也可以完全重叠，当部分或者完全重叠的时候，重叠部分的碱基只出现一次。比如在实施例3中，EEEEE为ACAGT；DDDDD为AGT；其中的AGT就是EEEEE序列中的重叠，就只出现了一次，没有重复。
进一步，合成步骤为，
退火：将接头引物P5和接头引物P7与缓冲液在PCR仪上进行退火得到退火接头；
扩增退火接头：对所得退火接头进行聚合酶延伸得到延伸接头；
第一次沉淀：对所得延伸接头进行乙醇/异丙醇沉淀纯化得到纯化后的延伸接头；
酶切：对纯化后的延伸接头加入能够产生3’T突出末端的限制性内切酶进行酶切得到酶切接头；
第二次沉淀：将所得酶切接头进行乙醇/异丙醇沉淀纯化后即得到最终的双标签接头序列。
进一步，所述退火步骤中，
退火的体系为，100uM的接头引物P5和接头引物P7分别10ul，3ul NEB buffer2，7ul的ddH2O；
任选的，退火的程序为，95℃，5min；按照0.2-0.5℃/s梯度从95℃降温至24℃；24℃维持；
任选的，扩增退火片段中，扩增程序为37℃，1h；扩增体系为所述退火片段30ul，10×NEB buffer 2ul，10Mm dNTP mix 5ul；ddH2O 8ul，5U/ul的Klenow exo 5ul；
任选的，酶解步骤中，酶解温度和时间为37℃16h；
任选的，第一次或第二次沉淀步骤中，采用NaAC和无水乙醇对第一扩增PCR片段进行沉淀。
本发明还提供一种文库构建方法，其特征在于，包括，
将10ng-1ug的待检测DNA打断成200-500bp的DNA片段后，DNA片段加入末端修复酶进行末端修复，加A尾，加入所述的双标签接头序列，连接完成后使用Ampure磁珠或切胶进行340-660bp的片段选择。
进一步，还包括，对片段选择好的样本进行PCR扩增富集的步骤。
本发明还提供一种测序方法，其特征在于，包括，
根据所述的方法构建文库；
对所述测序文库进行测序。
本发明还提供一种确定核酸序列的方法，其特征在于，包括
根据所述的方法构建文库；
对所述测序文库进行测序；
根据测序结果进行结果判定；
所述结果判定的方法为：
根据设置的参数选取比对后的碱基Q值大于30的测序唯一匹配序列(因为如果比对质量差，比对后原来的碱基Q值会减小)；
根据随机标签序列进行Duplication判定，从而进行碱基的重新校正；
使用SNP calling软件进行SNP位点检测，统计SNP位点信息，最终得到的SNP位点及对应的MAF信息；
对检测到的SNP位点及MAF信息和对照组的突变位点以及群体基因组变异信息库进行比较，过滤掉相同的突变位点，最终留下的突变位点信息即为最终检测到的突变位点信息。
本发明的双标签接头序列是通过接头引物P5，接头引物P7两个引物合成得到，其中，
接头引物P5为SEQ ID NO：1通过I5 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示，接头引物P7为FFFFFEEEEEDDDDDNNNNNNNNNNNN依次连接在SEQ ID NO：3的5’端；SEQ ID NO：3再通过I7 index序列连接SEQ ID NO：4所得序列所示；
SEQ ID NO：1：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC；
SEQ ID NO：2：
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
SEQ ID NO：3：
AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC；
SEQ ID NO：4：
ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG；
所述FFFFF为酶切位点保护碱基，EEEEE为酶切位点，DDDDD为定位标签序列，NNNNNNNNNNNN为随机分子标签序列；FFFFF、DDDDD、EEEEE包括但不限于5个相同碱基，I7 index序列为6-8个碱基；NNNNNNNNNNNN为4或6或8或12个随机碱基，且没有四个连续相同的碱基；优选的，NNNNNNNNNNNN表示为BDHVBDHVBDHV，其中B表示该位置是除A外的碱基，D位置表示该位置是除C外的碱基，H表示该位置是除G外的碱基，V表示该位置是除T外的碱基。
表1和表2中列举了一部分I5 index序列，I7 index序列和EEEEE序列；但不限于此。
表1部分I5 index序列和I7 index序列表
表2可用的限制性内切酶及酶切位点表(部分)
本发明使用的双标签文库测序，通过在DNA双链上同时引入两个不同的UMI，利用DNA的双链特性，使用两条链相互校正测序得到的信息，可以使测序的碱基错误率降低到2.4×10-6，因此可以准确检测1×10-5的肿瘤突变率，有效提高肿瘤突变检测的灵敏度，结合高通量测序的通量，一次测序可以检测多个基因的多个突变位点。
1.测序结果先会进行格式转换，通过接头尾部的定位碱基对测序序列的测序质量进行评估，如果无法找到定位碱基，则一对测序序列全部丢弃。同时，将一对测序序列前端的随机碱基序列切除并合并到序列ID当中去。
2.过滤后的序列会和参考基因组进行比对(Hg19，GRCh37等)，根据设置的参数过滤掉不合格的测序序列(reads)(mapping quality过低，多位点匹配，Read1和Read2序列不匹配等)，最后得到可以用于分析的高质量唯一匹配序列(unique mappingreads)。
3.通过使用第1步中添加到ID位置的随机标签序列进行Duplication判定，比对到同一位置且具有相同标签的序列被认为来源一同一个起始DNA模板，将会被归为一簇进行碱基的重新校正。
4.使用SNP calling软件进行SNP位点检测，统计SNP位点信息，最终得到的SNP位点及相关的MAF信息。
对检测到的肿瘤突变信息和对照组(同一病人来源的健康组织DNA)的突变位点以及群体基因组变异信息库进行比较，过滤掉相同的突变位点，最终留下的突变位点信息即为最终检测到的肿瘤突变位点信息。
本发明的有益效果：
1、使用双Index接头(原来是单Index)，增加了一次上机测序的样本数量(降低测序成本)，同时，双端Index可以更有效地区分不同样本，这一点在肿瘤的低频突变检测中非常重要，因为一般情况下检测的肿瘤突变位点的突变率是千分之一到百分之一左右，如果具有不同突变位点的不同样本出现了交叉污染，那么在最终突变位点判定时就容易出问题。
2、使用的接头为长接头，即接头上带有测序时和测序仪上flowcell结合的相关序列(P5、P7)，PCR连接之后不需要再进行PCR扩增引入P5、P7序列，可以完成PCR-free建库，避免了文库构建过程中PCR引入的碱基错误(突变)和扩增的片段偏好性，以及PCR产生的非天然的嵌合体序列。
本发明的双标签接头结构如图1所示，左侧的Y型结构(不包括分子标签和定位标签)和Illumina测序平台的标准接头相同；其中，Y型接头平行部分碱基互补配对，开叉部分碱基无配对序列；其中P5和P7反向互补需要用于和Illumina测序仪的测序芯片上的探针进行杂交，后续进行桥式扩增放大信号；I5和I7序列作为构建的不同测序文库的标签，用来区分不同样本构建的文库，；Read1测序序列和Read2测序序列用来和测序引物进行结合进行边合成边测序；分子标签即为NNNNNNNNNNNN随机标签序列，用来给高通量测序的DNA文库模板加上不同的标记；因为分子标签序列随机，因此需要在后面加入固定序列的定位碱基用来在数据分析时判断分子标签的位置及序列。
本发明利用双标签接头上的随机标签序列，在高通量测序文库构建过程中的加接头步骤中，给每一个DNA模板加上不同的序列标签，然后在后续的PCR富集过程中每一个原始模板连同其标签序列被多次复制，产生多个拷贝(duplications)；对这些拷贝进行高通量测序，通过序列标签识别测序片段来源(用来区分建库过程中产生的重复序列——duplication的来源，以便数据分析时对测序结果进行校正)，再利用模板的拷贝进行序列校正(扩增错误以及测序仪碱基识别错误)，第一次校正后再利用DNA的两条链反向互补的结构，通过标签序列的两两反向互补配对，再次对序列进行校正(DNA建库前及建库过程中产生的脱氨基、氧化等损伤)。
附图说明
图1是双标签接头结构示意图。
图2是通过PCR引入Index的双标签接头示意图；
图3是双标签接头文库构建流程图；
图4是鉴别细胞突变的流程示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的描述中，“第一”、“第二”、“第三”等为指代或描述方便，不能理解为有顺序关系或者有相对重要性指示，除非另有说明，“多个”、“多组”、“多重”的含义是两个(组或重)或两个(组或重)以上。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下是实力结合附图1-4进行说明。
实施例1：Duplex接头的制备
将接头引物P5，接头引物P7两个引物(接头引物P5为SEQ ID NO：1通过I5 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示；接头引物P7为SEQ ID NO：3通过I7 index序列连接SEQ ID NO：4所得序列所示；其中FFFFFEEEEEDDDDDNNNNNNNNNNNN依次连接在SEQ ID NO：3的5’端；合成厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)用ddH2O(或TE缓冲液)稀释至100uM；
其中FFFFF为酶切位点保护碱基，EEEEE为酶切位点，DDDDD为定位标签序列，NNNNNNNNNNNN为随机分子标签序列，所述I5 index序列选自SEQ ID NO:5-12；所述I7 index序列选自SEQ ID NO:12-23。
同时FFFFF/DDDDD/EEEEE/包括但不限于5个相同碱基；NNNNNNNNNNNN为4到12个随机碱基，且没有四个连续相同的碱基。
表1和表2中列举了一部分I5 index序列，I7 index序列和EEEEE序列；但不限于此。
表1部分I5 index序列和I7 index序列表
表2可用的限制性内切酶及酶切位点表(部分)
可根据需要任意选择以上表格中的序列。
退火：在0.2ml EP管中配制以下体系：接头引物P5：10ul，接头引物P7：10ul，NEBbuffer2:3ul，ddH2O：7ul；共30ul。将此体系在PCR仪上进行退火反应：95℃，5min；95℃-24℃0.2-0.5℃/s梯度降温；24℃维持；
扩增退火片段：在原PCR管中加入：10×NEB buffer：2ul，10mM dNTP mix：5ul，ddH2O：8ul，Klenow exo-(5U/ul)：5ul，共50ul，混匀后，37℃放置1h。
第一次沉淀：向上述所得产物中加入1/10体积的NaAC(3M)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃2h；13000g离心30min；去上清，加入600ul 70体积％乙醇漂洗沉淀，4℃，13000g离心30min；去上清，室温晾干DNA 5-10min，用30ul ddH2O重悬DNA。
酶解(以HpyCH4III内切酶为例，酶切位点：ACNGT，相应的接头引物P7序列EEEEE则为ACAGT)：取上述所得30ul，加入10×NEB CutSmart buffer：5ul，ddH2O：10ul，HpyCH4III(5U/ul)：5ul，共50ul，混匀后，37℃酶解16h。
第二次沉淀：向上述酶解产物中加入1/10体积的NaAC(3M)和2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃2h；4℃，13000g离心30min；去上清，加入600ul 70％乙醇漂洗沉淀，4℃，13000g离心30min；去上清，室温晾干DNA 5-10min，用26ul TE low buffer重悬DNA，即为最终双标签接头(25uM)，5ul分装，-80℃冻存备用。
实施例2：血浆DNA突变率检测
本实施例中：保护碱基为TCTTCT；酶切位点序列为
I5和I7的可以是：I501-I701，I502-I702，I503-I703，I504-I704，I505-I705，I506-I706，I507-I707，I508-I708，I501-I707，I502-I708，I503-I709，I504-I710。(序号所对应的碱基序列见表1)
样本的选取和质控：取5份肺癌病人血浆样本，使用QIAGEN血浆DNA提取试剂盒提取血浆DNA，使用分光光度计测定DNA样品纯度(要求A260/280在1.8-20之间)；然后使用Qubit2.0测定DNA浓度(总量在5-15ng之间)，使用D1000chip(安捷伦)检测DNA样本片段分布(160-200bp左右)使用数字PCR(Bio-rad)测定肿瘤样本EGFR基因T790M位点突变率(1.9％，0.8％，0.18％，0.12％和1.44％)。
文库构建：使用KAPA DNA建库试剂盒建库，所有DNA样本全部用来建库。
KAPA HTP Library Preparation Kit
DNA样本末端修复(加入7ul 10×末端修复buffer，5ul末端修复酶，20℃，30min；)，产物纯化后用A-taling酶加A尾(5ul 10×末端修复buffer，3ul末端修复酶30℃，30min)，产物纯化后均分成两份，在加接头步骤中分别使用普通的建库接头和双标签接头(按照10:1的摩尔比向加A尾的片段中加入双标签接头(其序列为SEQ ID NO：1通过I5 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示；及FFFFFEEEEEDDDDDNNNNNNNNNNNN依次连接在SEQ ID NO：3的5’段；SEQ ID NO：3再通过I7 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示)或普通的建库接头(其序列如SEQ ID NI：24和25所示)，加入10ul 5×连接buffer+5ul T4DNA连接酶，20℃，20min连接)，连接产物经两步1×Ampure磁珠纯化，纯化产物使用KAPA高保真酶mix(25ul)及上下游扩增引物(25uM)各1ul进行扩增；
其中加入普通的建库接头，作为对照。实验组为加入双标签接头；对照与实验组的步骤相同，只是用的接头序列不同。
普通的建库接头样品组使用的上下游扩增引物组合为通用引物(SEQ ID NO:5)和Index引物(SEQ ID NO:6)，双标签接头样品组使用的上下游引物组合为PCR-P5引物+PCR-P7引物；
普通的建库接头序列信息：
5′-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3′SEQ ID NO:24
3′-CTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAG-p-5′ SEQ ID NO:25
普通的建库接头对应的上下游引物序列：
通用引物：
5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC-s-T-3′
(-s-表示硫代，以下均同此)SEQ ID NO:26
Index引物：SEQ ID NO：27通过I7 index序列连接SEQ ID NO：28所得序列所示，
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT SEQ ID NO:27
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3′ SEQ ID NO:28
其中I7Index序列选自SEQ ID NO:12-23。
双标签接头对应的P5引物和P7引物序列：当使用双标签接头加完接头后进行PCR，则用以下引物序列：
PCR-P5：AATGATACGGCGACCACCG-s-ASEQ ID NO:29
PCR-P7：CAAGCAGAAGACGGCATACG-s-A SEQ ID NO:30
捕获：按照Roche SeqCap EZ custom kit(250k)进行文库靶向捕获，捕获文库质检合格后(安捷伦2100/2200判断文库片段大小分布，如建库时插入片段(模板)大小为200-350bp，加上两端接头即P5，P7后增加140bp，文库大小分布应该在340bp-490bp；QPCR判断捕获效果——平均富集倍数小于10时说明捕获失败，需要重新捕获)进行测序。
结果：每个样本的测序深度为20000×，测序后得到的样品raw data为，clean data(Q20，Q30)，mapping rate，coverage，检出结果方面，普通接头样本组可以准确检测出1.9％，1.44％两个样本的突变位点，而双标签接头样本组可以检测出1.9％，0.8％，0.18％，0.12％和1.44％所有样本突变位点(根据建库前的样本数字PCR检测到的突变位点及突变率信息，高通量测序的数据通过软件分析(FastQC，samtools，BWA/bowtie2，GATK，Freebayes/picard等)分析这些位点是否有突变及突变率，与数字PCR的结果进行比较，确定检出率)，检出率为100％(跟数字PCR的检测结果比较，假如数字PCR在这5个样本中检测到10个低频突变位点，如果高通量测序可以检测到全部10个位点，那么检出率就是100％，如果检测到5个位点，那么检出率就是50％)。
实施例3：细胞系突变率检测
选择NCI-H1650和HCT两个细胞系DNA做为实验材料，NCI-1650细胞DNA分别按照10％，1％，0.1％的质量比例掺入到HCT细胞DNA中，另外NCI-1650和HCT细胞100％DNA分别做为两个样本，分别对应记为10％，1％，0.1％，NCI-1650和HCT组。(NCI-1650和HCT组只是为了确定用来混比例的细胞系DNA的遗传背景——即等位基因位点信息，如杂合纯合等，通过这两个样本的测序信息，找出一些纯合碱基位点，然后挑出同一位点碱基不同的位点做为其它样本组的分析统计位点)。
DNA样本充分混匀后各取2ug进行DNA文库制备(KAPA DNA建库试剂盒)，其中片段加A尾步骤之后10％，1％，0.1％样本各均分为两份后分为两组，分别在加接头步骤中添加普通接头(如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列)和双标签接头(如SEQ ID NO：9和10所示序列)，然后进行后续的文库制备步骤和捕获步骤，捕获使用Roche SeqCap EZ customkit(250k)，最后进行上机测序，测序深度为2000×，测序结果以过滤的Q30 uniquemapping reads进行SNP检出。
其中双标签接头序列为：
Duplex-P5序列为SEQ ID NO：1通过I5 index序列连接SEQ ID NO：2所得序列所示；
Duplex-P7的序列为FFFFFEEEEEDDDDDNNNNNNNNNNNN连接在SEQ ID NO：3的5’端，SEQ ID NO：3又通过I7 index序列连接SEQ ID NO：4所得序列所示；
其中FFFFF为TCTTCT；
EEEEE为ACAGT；
DDDDD为AGT；与上述的EEEEE序列重叠。
NNNNNNNNNNNN为BDHVBDHV所示序列，其中B表示该位置是除A外的碱基，D位置表示该位置是除C外的碱基，H表示该位置是除G外的碱基，V表示该位置是除T外的碱基。
结果：首先分析NCI-1650和HCT两个样本的数据，根据SNP检出信息找到在Roche捕获芯片250K bp捕获区域中的碱基MAF(次要等位碱基频率)，筛选出MAF为0％的碱基位点(SNP纯合阴性)及100％的碱基位点(SNP纯合阳性)(实际判断标准为规定一个阈值，如0.1％，如果某个位点的MAF值低于0.1％即认为该位点为0％碱基位点，即SNP纯合阴性位点；100％位点依次类推)；筛选出两个细胞系中对应的位点(基因组中同一位置)一个为纯合阳性，另一个为纯合阴性的位点，这些位点做为后续的其它样本组的分析位点分样本统计检出率及假阳性、假阴性等信息。
NCI-1650和HCT组(100％)总共检测出178个纯合等位SNP位点(即每个位点在一个细胞系中为纯合阴性，在另一个细胞系中为纯合阳性)，然后不同接头的10％，1％，0.1％样本分别分析这178个位点，178个位点在不同比例样本中的突变率(杂合比例)分别为10％，1％和0.1％，结果显示普通接头在10％样本组的阳性检出率为100％，在1％组的检出率为98.86％，在0.1％组的检出率为81.29％；双标签接头在10％，1％和0.1％组的检出率均为100％；假阳性率：在1％的灵敏度下，普通接头的假阳性率为0.01％，在0.1％灵敏度下，普通接头的假阳性率在5％以上；而双标签接头的假阳性率在0.1％灵敏度下则为0.001％(灵敏度值超过某个阈值的碱基变异频率的位点即认为是检出的突变位点，例如1％灵敏度是指碱基变异频率阈值为1％，大于1％的位点认为就是检测出的突变位点)。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110>厦门艾德生物医药科技股份有限公司
<120>一种用于检测肿瘤突变的双标签接头序列及检测方法
<130>P12920
<160>31
<170>PatentIn version 3.3
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<213>人工合成
<400>19
ctgaagct 8
<210>20
<211>8
<212>DNA
<213>人工合成
<400>20
taatgcgc 8
<210>21
<211>8
<212>DNA
<213>人工合成
<400>21
cggctatg 8
<210>22
<211>8
<212>DNA
<213>人工合成
<400>22
tccgcgaa 8
<210>23
<211>8
<212>DNA
<213>人工合成
<400>23
tctcgcgc 8
<210>24
<211>8
<212>DNA
<213>人工合成
<400>24
agcgatag 8
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(33)
<223>硫代
<400>25
acactctttccctacacgacgctcttccgatct 33
<210>26
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(31)
<223>磷酸化
<400>26
ctgacctcaagtctgcacacgagaaggctag 31
<210>27
<211>58
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(58)
<223>硫代
<400>27
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct 58
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>28
caagcagaagacggcatacgagat24
<210>29
<211>34
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<223>硫代
<400>29
gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct34
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>硫代
<400>30
aatgatacggcgaccaccga20
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>硫代
<400>31
caagcagaagacggcatacga21
