一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组、PCR芯片及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组、PCR芯片及其应用。
背景技术
肿瘤细胞与正常细胞相比，肿瘤细胞的代谢改变和异常是肿瘤的又一重要特征，其与肿瘤的发生发展互为因果。肿瘤细胞即使在供养充足情况下，线粒体功能发生缺陷与三羧酸循环代谢改变导致氧化还原代谢失调，从而通过糖酵解途径大量吸收葡萄糖产生能量，满足快速生长需求，此即著名的Warburg效应。肿瘤代谢的改变已成为新的肿瘤特征之一(Hallmarks of Cancer)。因此，从新的角度(如肿瘤代谢)去探索肿瘤细胞与正常细胞关键性不同的生物学特性，并针对该靶点进行特异性精准干预是肿瘤研究领域的重大科学问题。肿瘤代谢异常及其异于正常细胞的调控机制的研究是国际肿瘤研究领域的新热点，被认为是未来十年生物医学领域最具有突破性进展的重要学科之一。该领域的研究对进一步认识肿瘤的生物学特性和确定关键干预靶点以期更有效防治癌症具有重大意义。
目前使用比较广泛的基因表达检测手段依然是PCR和基因芯片技术。PCR一次只能检测单个或少量基因，而基因芯片虽然可以检测大量基因及其表达，但是假阳性率高，准确性不足。新一代测序具有高通量、准度高的优点，既可以一次性检测大量基因，准确率又高于基因芯片，但是其成本昂贵，结果分析复杂，周期长等缺点。而目前RT2ProfilerTMPCR芯片既可以进行特定的信号通路的研究，也可以作为验证芯片结果的方法，其特异性高，灵敏度高和重复性好。但是其往往仅含有某个代谢通路的基因，如葡萄糖代谢PCR芯片检测葡萄糖和糖原代谢相关的调控和酶通路的84个关键基因，因此有一定的局限性，而且其价格较昂贵，约4800元/板/样，如要检测大量样品及数个通路时，成本会极高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的基因表达检测技术手段在研究检测肿瘤样品方面的缺陷和不足，提供一种操作简便，结果可靠，成本低廉的代谢型PCR芯片用于检测肿瘤代谢通路基因的异常表达，所述PCR芯片基于SYBR green的实时定量PCR方法，通过检测肿瘤细胞或者组织中mRNA水平的表达来发现代谢通路中异常表达的基因，以发现与临床预后、耐药等相关的异常表达基因，进一步研究该基因在肿瘤发生、发展中的作用及与预后的相关性，有望发现关键代谢蛋白靶标而实现对特定肿瘤发生或预后的精准诊断，以及实现个体化干预治疗。
本发明的目的是提供一种检测肿瘤代谢通路基因的引物组。
本发明的另一目的是提供一种代谢型PCR芯片。
本发明再一目的是提供上述代谢型PCR芯片在肿瘤研究中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组，包括分别特异性扩增肿瘤代谢通路相关的168个基因的引物对，所述引物对序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.336所示。
本发明的难点在如何在同一次实验中，相同的PCR反应条件下保证不同的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。因此本发明首先设计筛选出最佳的候选引物，接着通过实验，在不同反应条件下，检测PCR反应体系与PCR引物的组合，最终获得了优化的引物和PCR反应体系，能够同时特异性扩增出目的168个基因，适应PCR芯片的要求。该PCR芯片能够通过检测不同组织(或细胞)中代谢基因的表达，而发现异常表达的基因。
本发明所使用的引物的CG含量，解链温度(Tm)，以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件(尤其是相同退火温度)下，所有不同的基因都能扩增出特异性产物；而且引物扩增的片段大小均在100到200bp左右，确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
优选地，所述检测引物组还包括至少一对特异性扩增内参基因β-actin、PRKG1、GAPDH、GUSB、HMBS的引物对，所述引物对序列依次如SEQ ID NO.337～SEQ ID NO.346所示。
优选地，所述引物组还包括有能特异性的检测非转录的基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染的“基因组DNA参照(GDC)”引物，其序列如SEQ ID NO.347～SEQ ID NO.348所示。
优选地，所述引物组还包括用于检测RT反应的效率的“反转录参照(RTC)”引物，其序列如SEQ ID NO.349～SEQ ID NO.350所示。
优选地，所述引物组还包括用于检测PCR反应效率的“阳性PCR参照(PPC)”引物，其序列如SEQ ID NO.351～SEQ ID NO.352所示。
一种代谢型PCR芯片，所述PCR芯片包含上述任一所述引物组。
优选地，所述引物组中的引物对每对都单独存在于PCR板孔中。
更优选地，所述PCR板孔中的引物为液体，其引物浓度为1.2～1.6pMol。
更优选地，引物浓度为1.4pMol。
优选地，所述PCR芯片包括特异性扩增肿瘤代谢通路相关的168个基因的引物对，所述引物对序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.336所示；还包括特异性扩增内参基因β-actin、PRKG1、GAPDH、GUSB、HMBS的引物对，所述引物对序列依次如SEQ ID NO.337～SEQ IDNO.346所示；还包括检测是否存在DNA污染的引物，其序列如SEQ ID NO.347～SEQ IDNO.348所示；还包括检测反转录效率的引物，其序列如SEQ ID NO.349～SEQ ID NO.350所示；还包括检测PCR扩增效率的引物，其序列如SEQ ID NO.351～SEQ ID NO.352所示。
优选地，所述PCR芯片的PCR反应程序为95℃预变形30s；95℃变形5s，60℃退火延伸30s，重复40个循环；65℃，1min；95℃15s。
优选地，所述PCR芯片的制备方法包括如下步骤：
S1.引物稀释：将合成的引物采用无RNA酶水(RNase-free水)溶解，终浓度为10μMol。冰上操作，负20℃，保存备用。
S2.PCR芯片母板的制备：按照PCR芯片基因引物相对应的孔将步骤S1稀释的引物(正向和反向引物混合)加入进圆底96孔板，200μl/孔。
S3.PCR芯片工作板的制备：采用高通量自动移液系统将母板的引物80μl分装进含有无RNA酶水160μl的圆底96孔板中；进一步采用高通量自动移液系统将该96孔板中的引物10.5μl分装进PCR板中，负20℃，保存备用。
上述PCR芯片包含有可分别特异性扩增与肿瘤代谢通路相关的168个基因的引物组，因此可将所述PCR芯片应用到肿瘤研究当中。
优选地，所述应用为筛选肿瘤耐药株异常表达的代谢基因或/和与临床预后相关的异常表达的代谢基因。
优选地，所述应用为筛选以异常表达的基因为靶点的抗肿瘤药物。
优选地，所述肿瘤为淋巴瘤或/和白血病。
更优选地，所述淋巴瘤为淋巴瘤细胞株SU-DHL-2，Raji或Jeko-1等；所述白血病为白血病细胞株MV411。
进一步，所述PCR芯片是研究一组特异性基因表达水平的理想方法，基于SYBRgreen的实时定量PCR方法，适用面广，简单方便，具有广泛的应用前景。
进一步，所述PCR芯片包括特异性扩增代谢通路的168个基因的引物对，芯片中所包含的基因更完整，更精确。
本发明的具体实施中，检测确认引物人全基因组中的高度特异性，有效避免非特异性产物产生。并且引物不会扩增E.coli基因组，后者是Taq DNA多聚酶的常见污染源。
本发明的具体实施中，所使用的引物的CG含量，解链温度(Tm)，以及其他一些化学的和物理的特性都相似，以保证在相同的PCR条件(尤其是相同退火温度)下，芯片中的不同的基因都能扩增出特异性产物。
本发明的具体实施中，引物扩增的片段大小均在100到200bp左右，确保在相同的反应时间内，不同的基因均能扩增出完整片段；并增强引物3’端的铆定能力，减少引物二聚体和非特异性退火的发生。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的引物组可分别特异性扩增与肿瘤代谢通路相关的168个基因，且特异性好、准确度高、重复性好。
(2)本发明的代谢型PCR芯片，可用于检测代谢通路的基因表达且基因范围相对集中，节省了在数据分析方面所花费的时间，相对更简洁、针对性更强，所得到的信息也有利于接下来的更深入、更准确的研究。
(3)本发明的代谢型PCR芯片操作简便，涵盖基因广泛、特异性好、准确度高、重复性好，耗时短，成本低廉。
(4)本发明的代谢型PCR芯片可用于发现异常肿瘤(高转移、高恶性、预后差、耐药等)中代谢通路异常表达的基因，有望发现关键代谢蛋白靶标而实现对特定肿瘤发生或预后的精准诊断，以及实现个体化干预治疗。
附图说明
图1为代谢型PCR芯片的Plate 1和Plate 2的示意图；Plate 1 A1-G12和Plate 2A1-G12孔包含了代谢通路的168个相关基因的引物。
图2为代谢型PCR芯片的各个引物的特异性(熔解曲线)图。
图3为代谢型PCR芯片的重复性试验图。
图4为代谢型PCR芯片的灵敏性试验图；当总RNA量低至50ng时，使用PCR芯片实验体系仍能获得很高的阳性信号比例。
图5为索拉菲尼耐药株构建的过程及耐药株的成功建立图。
图6为代谢型PCR芯片在耐药细胞株MV411R中对异常表达基因的筛选图。
图7为代谢型PCR芯片筛选结果的可靠性和准确性验证图。
图8为索拉菲尼耐药株对其他FLT3抑制剂存在交叉耐药性的验证图。
图9为代谢型PCR芯片筛选异常表达的基因为靶点药物的抗肿瘤应用结果。
图10为代谢型PCR芯片检测11株淋巴瘤细胞中异常基因的表达情况结果。
图11为代谢型PCR芯片筛选出的异常表达的基因与临床淋巴瘤预后的关系。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1肿瘤代谢通路相关基因的PCR扩增引物设计
1.本发明人团队通过大量前期研究，确定了与肿瘤代谢通路相关的168个基因，其基因名及功能分类如表1所示。
表1本发明的168个与肿瘤代谢通路相关基因及其功能分类
2.本发明团队通过大量研究，设计和筛选出了肿瘤代谢通路相关的168个基因相对应的特异性扩增引物，所述引物扩增效率高，引物的CG含量均在35～65％之间，退火温度(Tm)均为60～68℃之间，引物长度均为10～23bp，扩增的片段大小都在100～200bp。
3.选定β-actin、PRKG1、GAPDH、GUSB和HMBS作为内参基因。
同时还设计了以下三种引物：
(1)“基因组DNA参照(GDC)”引物：能特异性的检测非转录的基因组DNA重复片段，从而检测样品中是否存在DNA污染；
(2)“反转录参照(RTC)”引物：用于检测RT反应的效率；
(3)“阳性PCR参照(PPC)”引物：检测PCR反应效率。
4.上述基因及其引物序列见表2
表2代谢型PCR芯片扩增的各个代谢通路的基因的特异性引物序列
实施例2制备代谢型PCR芯片
1、将实施例1设计出的引物组由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2、将合成的引物采用无RNA酶水(RNase-free水)溶解，终浓度为10μMol。冰上操作，负20℃，保存备用。
3、PCR芯片母板的制备：按照PCR芯片基因引物相对应的孔将引物(正向和反向引物混合)加入进圆底96孔板，200μl/孔。
PCR芯片工作板的制备：采用高通量自动移液系统将母板的引物80μl分装进含有无RNA酶水160μl的圆底96孔板中；进一步采用高通量自动移液系统将该96孔板中的引物10.5μl分装进PCR板中，负20℃，保存备用。
经过验证，所述基因对应的引物在制备的PCR芯片中的分布如图1所示。
实施例3肿瘤细胞RNA提取及逆转录
1、细胞培养：淋巴瘤细胞株SU-DHL-2、Raji、Jeko-1等及白血病细胞株MV411按照说明进行培养。
2、RNA提取及逆转录
(1)预处理：玻璃仪器用0.1％DEPC水处理过夜，240℃烘烤4h。塑料器材用0.1％DEPC水处理过夜，1.034×10Spa，121℃高压灭菌20min，烘干。
(2)收集细胞以及总RNA的提取：
a.细胞收集(5×106～107)弃培养基，PBS(DEPC水处理)洗涤，向细胞中中加入1mlTrizol，吹打数次，将细胞悬液转移到1.5ml eppendorf管中，室温静置5min；
b.向细胞匀浆液中按每1ml Trizol加0.2ml氯仿，用力振摇15sec，室温放置2min，4℃，12,000x g离心15min。离心后液体分三层，下层为红色的酚-氯仿相，中间层，上层为无色的水相(约占溶液总体积的60％)，RNA几乎完全在水相中；
c.将上层水相转至一干净1.5ml eppendorf管中，按每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min，4℃12,000x g离心10min；
d.弃上清，加入1ml 75％乙醇后涡旋震荡，7,500x g，4℃离心5min。弃上清，空气中干燥RNA 5～10min，加入适量DEPC水溶解RNA。
e.测RNA的浓度及纯度,A260/280 1.8-2.0左右。
(3)cDNA第一链的合成：在无RNA酶的PCR管中依次加入以下组分：
a.去除RNA中的DNA
混匀，甩下，42℃，2min，室温5min
b.反转录反应(冰上进行，普通PCR仪进行)
c.反转录后，负20℃，保存备用。
实施例4验证代谢型PCR芯片的引物特异性、重复性及不同量的RNA扩增后的阳性比例
1、将实施例3逆转录后的cDNA采用无RNA酶水稀释10倍(重复性验证)，或稀释10倍，20倍(不同浓度的阳性比例)。
2、取SYBR green 1250μl+稀释后的cDNA 192μl混匀。
3、采用连续分液器将上述混匀的液体加入制备的PCR芯片(96孔PCR板)，每孔14.5μl。终体积即为25μl。
(1)所述PPC孔中为阳性PCR参照(PPC)引物，用于检测PCR反应的效率，其序列为：
forward(5‘-3’)：AACTCCATCATGAAGTGTGACG；
reverse(5‘-3’):GATCCACATCTCGCTGGAAGG；
加入扩增阳性的β-actin产物(PCR产物)，以检测PCR扩增的效率。
(2)所述RTC孔中为反转录参照(RTC)引物，用于检测RT反应的效率，其序列为：
forward(5‘-3’)：AACTCCATCATGAAGTGTGACG；
reverse(5‘-3’):GATCCACATCTCGCTGGAAGG
加入RT后的产物，以检测RT反应的效率。
(3)所述GDC孔中为基因组DNA参照(GDC)，该引物能特异性的检测非转录的基因组DNA重复片段，引物序列为：
forward(5‘-3’)：AACTCCATCATGAAGTGTGACG；
reverse(5‘-3’):GATCCACATCTCGCTGGAAGG；
加入提取的RNA(未进行RT)，以检测扩增中有无基因组DNA污染。
4、采用荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX96，进行PCR反应。
扩增条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40个循环；65℃15sec；95℃15sec。
5、结果
结果如图2、3、4所示：
如图2所示，代谢型PCR芯片plate 1和plate 2的目的基因引物的熔解曲线。结果显示168个目的基因的引物特异性强。
如图3所示，代谢型PCR芯片plate 1和plate 2的目的基因扩增的重复性。结果显示代谢型PCR芯片重复性好(RSD<0.01)。
如图4所示，代谢型PCR芯片plate 1和plate 2的目的基因引物的在不同浓度下的阳性Ct值。结果显示代谢型PCR芯片灵敏度好，可用于下一步的试验。
实施例5代谢型PCR芯片在肿瘤研究中的应用
1、采用代谢型PCR芯片筛选耐药株异常表达的代谢基因
(1)构建索拉菲尼耐药的白血病MV411细胞株。构建流程如图5A所示：最终耐药株MV411R培养于含有500n M的Sorafenib的含有10％FBS的1640培养基中；
(2)如图5B所示，构建的索拉菲尼耐药株对索拉菲尼有显著的耐药性；
(3)采用制备的代谢型PCR芯片检测耐药株MV411R的肿瘤代谢相关基因的表达；
(4)采用2-△△Ct法行数据统计，计算各个基因的相对表达量。
(5)结果
结果如图6所示，TXNRD3，PDK1基因在索拉菲尼耐药的白血病细胞株MV411R中显著高表达；
因为PDK1基因在肿瘤耐药中的作用已有多篇文章报道，因此本专利未进一步验证与检测，也进一步说明了本专利发明的PCR芯片的可靠性和可利用性。
2、异常表达基因的准确性验证
(1)采用RT-QPCR的方法检测TXNRD3基因在耐药株MV411R中的表达；
(2)采用WesternBlot的方法检测TXNRD3基因在耐药株MV411R中的表达，按照说明进行操作；
(3)结果
结果如图7所示，TXNRD3mRNA和蛋白水平在索拉菲尼耐药的白血病细胞株MV411R中显著升高，证明所述代谢性PCR准确性高。
实施例6代谢型PCR芯片在肿瘤研究中的应用：代谢型PCR芯片筛选出异常表达的基因TXNRD3为靶点的药物对耐药株的作用
1、前期研究表明对索拉菲尼耐药的细胞对其他FLT3抑制剂均有交叉耐药性，如图8所示，研究表明Auranofin可以抑制硫氧还蛋白还原酶的活性而抑制肿瘤细胞的生长；
2、检测索拉菲尼耐药的细胞株MV411R对Auranofin的敏感性；
3、结果
结果如图9所示，敏感株MV411和耐药株MV411R对Auranofin均有较好的敏感性，两者的IC50无差异。
实施例7代谢型PCR芯片在肿瘤研究中的应用：采用代谢型PCR芯片检测淋巴瘤肿瘤样品异常表达的代谢基因与临床预后的关系
1、采用代谢型PCR芯片检测11株淋巴瘤细胞中代谢基因的表达；
2、采用2-△△Ct法行数据统计，计算各个基因的相对表达量。
3、结果
结果如图10所示，GLT1D1基因在临床疗效好的弥漫大B淋巴瘤中表达低，而在恶性度高、难治疗的伯基特和套细胞淋巴瘤中表达相对较高。
4、进一步验证淋巴瘤肿瘤样品中GLT1D1基因的表达与临床预后的关系
(1)采用代谢型PCR芯片检测临床淋巴瘤肿瘤样品中GLT1D1基因的表达；
(2)采用ΔCt法行数据统计(本发明相对应的excel表计算，直接输入Ct值即可)，计算各个基因的相对表达量；
(3)结果
结果如图11所示，GLT1D1基因在临床中高表达与临床预后差相关。
综上所述，制备的代谢型PCR芯片在耐药的肿瘤细胞中可以成功、有效的筛选出异常表达的代谢基因。进一步验证筛选结果，也显示了制备芯片的可靠性和准确性。而且针对筛选出异常表达的基因做为靶点，选用相应的药物可以有效的发挥抗肿瘤作用。而且该芯片用于临床肿瘤的检测也可以发现与临床预后差相关的基因。进一步研究该基因在肿瘤发生、发展中的作用及与预后的相关性。有望发现关键代谢蛋白靶标而实现对特定肿瘤发生或预后的精准诊断，以及实现个体化干预治疗。充分显示了制备的代谢型PCR芯片在肿瘤研究中的应用价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学肿瘤防治中心
<120> 一种检测肿瘤代谢通路基因表达的引物组、PCR芯片及其应用
<130> 2017
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
<400> 37
ggtggaggtc ctatcagcag t 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cagaaagaag ctgcaatcaa gc 22
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
acggggttag ggagattgtg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gcctgcaata gctccgaaga 20
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tgacaattct catctgaggt cca 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
cagggatacc ctttagcagt ttt 23
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
atcaatcgga ctctggaaac gg 22
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tcagggagta gcgcatggt 19
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cctgctacat ggcaactgct a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
agaggtgccc aatgatggga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
atgggaatgc gccccttatg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
aggtggcgga tgtagtcttt t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
cagggacaaa tggcgagact a 21
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ggggtgtgtt ccccaatctt 20
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ggcagttccg agaaatcctc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ctccttggtc taacttgatt ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
atgcctcact cgtacccag 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tttccacccc aatttggctc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
gcgtctaaat gagcgtcact at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
ggaggcgggg ttacattgta g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tggtgtctat cgaagatccc tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ccttggcgat cctctttgg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
ccgggaactc agacctcatc 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ctctgcacct agtcgcatgg 20
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ggccacttgg acctccttc 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gccattagac tgagccagtt tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
actttggagc agttattggg ag 22
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gacgccattt gacagcacc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gcagaaggga acaatgtcgt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
cgtagtagca ggagatcatc gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggagaccatc acgaatgcag a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caaccgcatc aggacctca 19
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<213> 人工序列
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ggacaggagc accctcattt c 21
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<213> 人工序列
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cctccgaatg gcatctctca g 21
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaagcaccc ctactacaac tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctggggaac aatctcctcg t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacaaggtt aaagccgagc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaactggatg ttagagggaa gcg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggccgaccta gatgactcat aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gatggggatc gaaacatgat tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctggaaata cggaatgctg aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagctgctat gggacctgga 20
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<213> 人工序列
<400> 84
gctcgggcgt caaaactga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gcagagagtg cttattgaca tca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
tgtgaaagtt tctcactgct gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
aggagtcttc cccttgcttt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
cctgtcacca caatcaccag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tccaccaaac aataaagagt gct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
gatgtcccgt tgccttattc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
tgtaactcct ttccccactc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
ggagcatttc tcgcgctaca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
tgaagtcaca gggctactgt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
ccttccgttc actacgattt cct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
atcggttcaa gtatgctcgg g 21
<210> 100
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaccaagttt tccacgacgt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacccattcg cacaccttg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
atggtaagcg cccatatctt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
ccctacagcc tactggtgac t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgtactcgtt gggctcaaag t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
tgcttcctcc acgaatttga aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccaccataca tcatgtccac ag 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cggaactcca cgagtgacc 19
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<213> 人工序列
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ccccgccata ccctgtagt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaaatgtccg aagttcgctt ga 22
<210> 110
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
tcagctttcg tagcagtgac t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
gaactgccct ctagggagac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
aaccttcctg ctgttagggt a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggaggtgtga cagaacgcat 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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catctgctgc cttcattatt gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
caccaaatgg caccatacga a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccccataagc atgacgacct at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
cccgtattat ctggcagttc atc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
atcagtctgg tcacggtttg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgctgccaaa gcacctattc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
gtgaccggct gctattggg 19
<210> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
tagtgcagaa tacgcagtct ttg 23
<210> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
cagcatgttg gaagccgac 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
aaacaattcc tccgtccgct a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggcattgc gaatgtcctc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
tttggatcac aaccgagcta aag 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
acatctggat actgagtcga gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
ctagcatgac gactgaactg atg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
agaggcactg gtgatccaga 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
tcggcccaga acaatgctaa a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcggctttgg tctcgatgt 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
tgccagcata ttggggtgg 19
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
ggaactcctc aaacctggtg g 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
gctggaggag aattacaccc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggatgttccc atactggtcc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
ttgagaaagc gttcaatgcc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
cacgtagggt gaatccgtca g 21
<210> 137
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
gccatcatgc cgtagcatc 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
agcctcagtt ccatcacaga t 21
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
tggtagcatc ccgtaatttt gc 22
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
attcggcgta cagtctgcat c 21
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
gcagcagtgc tatctaaaga agg 23
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
ccaggaaatt gaacgcagga c 21
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
caaacaggaa cccgaggttt t 21
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
cagcttggta acacatgctg tat 23
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
acagctcccc gtatcaagaa a 21
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
gcatgatctt cggaaggtca a 21
<210> 147
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
taggttcaaa ccgtcctctg t 21
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
gagagacccc tgcactcaaa g 21
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
catctctcca ctggactagc g 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
tccatcgcag agcaaggatt c 21
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
tctccgttcc caaaggatat gt 22
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
caccagctaa aacctgtgcc 20
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
gagcaacggc ttctgtcatt t 21
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
tgcttgactc gtaccatgtc c 21
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
tttgctatgg acgacaaatc aga 23
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
ctggcttccc accattaagg 20
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
cagggtaaga ccgtgatcca a 21
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
ccagctccac cgcatacttg 20
<210> 159
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
gccgagatgg accagatact c 21
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
ctgccgttgc accaatgag 19
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
cttggggcca aaaaggtgtt c 21
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaggtagcgg tcctcataca g 21
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tgctcaccta tcctctgatc g 21
<210> 164
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
gctgggagta ggacagcac 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
aatgaggtgg gcttaaagca ag 22
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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