一种DNA编码分子库及化合物筛选方法
技术领域
本发明涉及DNA编码分子库技术领域，特别是涉及了一种DNA编码分子库及DNA编码分子库化合物的筛选方法。
背景技术
当代药物研发中，针对疾病的药物靶点，通过构建大型的候选药物分子库，进行高通量、大规模筛选是新药研发中不可或缺的手段。当今世界上主要的制药公司均拥有大型的分子库和大规模的筛选平台用于新药研发。然而，传统的分子库和筛选平台成本高昂、技术门槛高、管理运行复杂，成为高通量筛选发展和应用中的严重制约。近5年来，DNA编码分子库技术逐渐发展起来，成为药物研发中的新兴筛选方法。在DNA编码分子库中，每一个化合物与一个特异性的DNA链相连接，成为一个特异的条形码，实现对化合物的特异性编码。DNA编码分子库能够在极小的体系中，实现千万乃至上亿级的高通量筛选。筛选结果可以通过PCR扩增和DNA测序进行解码分析，已获得先导化合物用于进一步药物研发。近年来，DNA编码分子库已经得到新药研发领域中的广泛认可和应用，成为新药研发中的一种重要支撑技术。
使用DNA编码分子库进行药物筛选，所使用的靶点大多为纯化后的蛋白质。蛋白质靶点经修饰后，固载在磁珠之类的固相之上，再与分子库进行孵育。不能与靶点蛋白结合的小分子被洗脱，与结合在蛋白靶点上的小分子相分离。再在蛋白质变性条件下，对结合的小分子进行洗脱，PCR扩增，以及DNA测序，从而读出编码序列，获得与靶点结合的小分子的化学结构(如图1所示)。然而，使用纯化、固载的蛋白靶点限制了DNA编码分子库的应用范围，很多其它类型的药物靶点，例如膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织等，由于较难或无法纯化和固载，并不能够用于DNA编码分子库的筛选，成为本领域中的一个瓶颈问题。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明提供了一种DNA编码分子库及化合物筛选方法。使用本发明的DNA编码分子库的筛选方法，使得蛋白质靶点不需纯化和固载，并且能够直接应用于膜蛋白、蛋白质复合体、活细胞、病理组织等其它方法无法应用的药物靶点。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种DNA编码分子库，其引入一具有8～12个碱基的短链DNA，所述短链DNA一端具有光交联基团。
在本发明中，所述光交联基团为苯基叠氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的一种。
一种DNA编码分子库化合物筛选方法，其包括以下步骤：
步骤A、将如权利要求1所述的DNA编码分子库与蛋白质靶点孵育，其中分子库中的部分小分子与蛋白质靶点结合，使得所述短链DNA上所带的光交联基团处于蛋白质靶点附近，在光照条件下，光交联基团与蛋白质靶点发生交联反应以保护能与蛋白质靶点结合的小分子的DNA标签；
步骤B、往步骤A中的体系加入DNA外切酶，没有和所述蛋白质靶点交联的分子库化合，其所带的DNA标签被所述DNA外切酶所降解，和所述蛋白质靶点交联的分子库化合物，其所带的DNA标签被蛋白质靶点本身所保护，不被所述DNA外切酶所降解；在DNA外切酶处理后，体系中余下的DNA为能与所述蛋白质靶点结合的小分子的DNA标签；
步骤C、进行PCR扩展和DNA测序，即可读出被选择的小分子的化学结构，完成筛选。
在本发明中，所述蛋白质靶点为非固载、无修饰的蛋白质靶点。
在本发明中，所述光交联基团为苯基叠氮、二苯甲酮、丙基吖啶中的一种。
本发明具有如下有益效果：使用本DNA编码分子库的筛选方法彻底摆脱了传统DNA编码分子库筛选中对蛋白靶点纯化和固载的要求。本方法不再依赖于物理洗脱来分离结合靶点和不结合靶点的化合物，而是利用配体诱导的选择性酶降解的方法从体系中去除不与靶点结合的化合物。因此从原理上讲，本方法能够应用于任何蛋白质靶点。本方法已经通过实验证明能够用于非固载蛋白质、蛋白质复合体、活细胞表面膜蛋白、细胞裂解液等多种复杂体系的DNA编码分子库的筛选，具有良好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为传统DNA编码分子库化合物筛选方法，其中蛋白质靶点进行纯化修饰；
图2为本发明所述的短链DNA；
图3为本发明引入所述短链DNA的DNA编码分子库化合物的筛选方法的流程示意图；
图4a为本发明选取的小分子化合物，其均分别连接到所述短链DNA上；
图4b为本发明验证能与蛋白质靶点结合的小分子所带的DNA编码不会被酶切水解的流程示意图；
图4c为图4b所获得的数据表格，其中Kd：解离常数，Ki：抑制常数，两者均为定量表示小分子与蛋白质结合或抑制能力的常数；nM指nanomolar，纳摩尔的意思；
图5a为本发明合成的具有1027个不同系列的分子库，该分子库除了大量的背景序列之外，包含了一个GLCBS、一个CBS、一个CBM；其中GLCBS为蛋白质靶点CA-II的高结合力小分子，CBS为中等结合了小分子，而CBM则不与蛋白质靶点CA-II相结合，用作于阴性对照；
图5b为图5a的分子库按照本发明的筛选方法进行筛选后的数据结果；
图6a为本发明合成的另一分子库，该分子库包含4800个DNA编码的大环多肽化合物，以及一个GLCBS用于阳性控制；
图6b为图6a的分子库按照本发明的筛选方法进行筛选后的数据结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细的说明。
如图2所示，其显示了一种具有8～12个碱基的短链DNA(PC-DNA)，所述PC-DNA在一端具有光交联基团，如苯基叠氮、二苯甲酮、丙基吖啶等，但不局限于此。本发明所述的DNA编码分子库为引入该PC-DNA的常规DNA编码分子库。由于在分子库中，所有的DNA编码在两个末端具有相同的PCR引物区，所述PC-DNA能够结合在所有化合物的PCR引物区(图3)。
如图3所示，一种DNA编码分子库化合物的筛选方法包括以下步骤：
步骤A、将具有所述PC-DNA的DNA编码分子库与非固载、无修饰的蛋白质靶点孵育之后，该DNA编码分子库中的一部分小分子能够与所述蛋白质靶点结合，使得PC-DNA上所带的光交联基团处于蛋白质靶点附近，再在光照条件下，光交联基团能够与蛋白质靶点发送交联反应以保护能与蛋白质靶点结合的小分子的DNA标签；而如果小分子不与蛋白质靶点结合，则蛋白质靶点与PC-DNA的交联不能发生。
步骤B、在步骤A的体系中加入DNA外切酶exonuclease I(exoI)。其中，没有和蛋白质靶点交联的分子库化合物，其所带的DNA标签将被exoI所降解；而与蛋白质靶点交联的分子库化合物，其DNA标签被蛋白靶点本身所保护，不被exoI所降解。因此在exoI处理之后，体系中余下的DNA即为能够与蛋白靶点结合的小分子的DNA标签。
步骤C、最后进行PCR扩展和DNA测序，即可读出被选择的小分子的化学结构。
本方法彻底摆脱了传统DNA编码分子库筛选中对蛋白质靶点纯化和固载的要求。本方法不再依赖于物理洗脱来分离结合蛋白质靶点和不结合蛋白质靶点的化合物，而是利用配体诱导的选择性酶降解的方法从体系中去除不与蛋白质靶点结合的化合物。因此从原理上讲，本方法能够应用于任何蛋白质靶点。本方法已经通过实验证明能够用于非固载蛋白质、蛋白质复合体、活细胞表面膜蛋白、细胞裂解液等多种复杂体系的DNA编码分子库的筛选。
下面通过实验，验证是否本发明人所提出的末端保护的策略，能够在小分子和蛋白质靶点结合时，其所带的DNA编码不会被酶切水解。如图4a所示，本发明人选取了一系列的小分子化合物，将它们连接到所述PC-DNA上。将这些小分子-DNA偶合物与它们的已知蛋白质靶点相孵育结合之后，再按照图4b中的流程进行光照、酶切，以及实时定量PCR(qPCR)的分析。qPCR能够给出CT值，CT值越小，表明存留DNA越多；CT值越大，表明DNA已经被酶切水解，难以被PCR扩增出来。图4c中为所获得的数据表格，其中ΔCT值为：没有蛋白质靶点的CT值-有蛋白质靶点的CT值；该值越大，表明蛋白质靶点的保护作用越强。数据表明，对于多种类型的小分子，其与蛋白质靶点的结合都能够有效的实现对DNA编码的保护。即便是作用力较弱的4和5，也能有很好的效果。本数据在原理上验证了本发明人所提出的方法的可行性。
更进一步，本发明人合成了一个具有1027个不同序列的分子库。除了大量的背景序列之外，包含了一个GLCBS、一个CBS、一个CBM(图5a)，其中GLCBS为蛋白质靶点CA-II的高结合力小分子，CBS为中等结合了小分子，而CBM则不与蛋白质靶点CA-II相结合，用作于阴性对照。本发明人将所述PC-DNA引入至该分子库进行合成后，按照图3的方法，进行了与非固载、无修饰的蛋白质靶点CA-II的筛选。筛选出的分子库成员进行了PCR扩展和DNA测序，数据显示在图5b之中。可以看出，经过第一轮的筛选，强结合力的GLCBS被富集了38.4倍，中结合力的CBS被富集了7.2倍，而不结合CA-II靶点的CBM基本没有被富集。本筛选方法的一个特点是，第一轮筛选出来的分子库，能够直接进入下一轮进行二次筛选，实现进一步的富集。如图5b所示，经过第二轮的筛选，GLCBS和CBS得到了约200倍的富集。
更进一步，本发明人合成了一个更大、化学结构更复杂的分子库。该分子库包含4800个DNA编码的大环多肽化合物，以及一个GLCBS用于阳性控制(图6a)。经过分子库合成、对非固载无修饰的蛋白质靶点CA-II的筛选之后，进行PCR扩增和DNA测序来解码。最终数据以散点图的方式显示在图6b之中。可以看到阳性控制GLCBS被富集了近100倍(图6b，上)。而分子库中的其它化合物，由于缺乏和CA-II相结合的化学结构，基本没有被富集(图6b，下)。以上数据验证了本发明所提出来的分子库筛选方法针对于非固载、无修饰蛋白质靶点筛选的可行性。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
