一种检测猪细小病毒的基因芯片的制备方法及使用方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体是一种检测猪细小病毒的基因芯片的制备方法及使用方法。
背景技术
现有的猪细小病毒检测方法有病毒分离法、血清学鉴定及分子生物学检测等。病毒分离鉴定法是根据病毒在细胞上生长增殖所造成的细胞形态等发生病变。在倒置显微镜下观察到细胞发生了病变，有细胞聚集、圆缩、细胞碎片附着在其细胞上等现象。血清学检测方法包括血凝和血凝抑制试验、中和试验、酶联免疫吸附试验，其中血凝和血凝抑制试验最常用的检测方法。分子生物学检测方法包括普通的PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR等检测方法都有很强的特异性和高度的敏感性。
基因芯片作为检测手段，有高灵敏性、高度精确性、高信息量等优点，被应用于多种病原的检测中，已建立有针对猪病病毒的基因芯片的检测方法，但需要对已点样的芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪细小病毒的基因芯片的制备方法及使用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，误差大，投入大的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测猪细小病毒的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
(1)设计特异性引物和探针：以猪细小病毒的VP2蛋白基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示；下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示；探针如序列表中SEQ ID NO：3所示；
(2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针；
(3)基因芯片的制备：用TE缓冲液溶解合成探针，在醛基基片上接触式点样，干燥后即得基因芯片。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中，特异性引物的浓度为10μmmol/L。
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中，探针的浓度为5μmmol/L-20μmmol/L。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中，接触式点样的环境参数为相对湿度55-65％，温度15-30℃。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中，干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。
一种检测猪细小病毒的基因芯片的使用方法，包括以下步骤：
(1)提取待测猪细小病毒细菌的基因组DNA；
(2)杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分，然后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增制得杂交用PCR产物；所述的反应体系为：5×Buffer为5.0μl，上游引物为1.0μl，下游引物为2.0μl，dNTP为2.0μl，模板DNA为1.0μl，Prime STAR为0.3μl，ddH2O为13.7μl，总体积为25μl；扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环，72℃延伸5min；
(3)杂交用PCR产物与基因芯片杂交：将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加于离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于47℃水浴锅中避光杂交1h；
(4)基因芯片的洗涤与干燥：在暗室中，将杂交完毕的基因芯片放置在玻片架上，立即用洗液洗涤三次，每次2min，离心干燥；
(5)基因芯片的结果分析：将基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。
作为本发明进一步的方案：dNTP的浓度为10mmol/μl。
作为本发明进一步的方案：所述的基因芯片三次洗涤所用洗液依次分别为1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC。
作为本发明进一步的方案：所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下：
(1)模板DNA的PCR扩增效果良好；
(2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；
(3)检测基因芯片的杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需1小时，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。
附图说明
图1是猪细小病毒基因芯片点样示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明设计并合成引物和探针，用TE buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基基片上接触式点样，制备用于检测猪细小病毒的基因芯片。使用时，提取待测的猪细小病毒基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果。
经试验证明，此方法灵敏可靠。应用效果好，有关资料如下：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标准菌株来源
猪细小病毒菌株由河南农业大学惠赠。
1.1.2芯片材料
基因芯片基片采用醛基化基片，购自博奥经典生物技术有限公司。
1.1.3试验仪器
1.1.4主要试剂和溶液
5×电泳储存液(5×TBE)、1.5％琼脂糖凝胶、20×SSC、10％SDS、洗脱液均由本实验室配制。
1.2方法
1.2.1猪细小病毒的培养
按照常规细胞培养方法，以含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基(pH7.2)为营养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养增殖PK-15细胞24h；细胞传代时用0.25％的胰酶消化细胞，分瓶传3代后接种PPV病毒继续培养。
1.2.2猪细小病毒基因组DNA的提取
对上述培养的病毒采用上海生物工程股份有限公司的Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒提取，具体步骤如下：
(1)样品处理：在1.5ml离心管中加入0.2ml病毒液样品。将1.5ml液体在4℃24000g冷冻离心机下离心60min，移弃1.3ml后剩下的0.2ml第(2)步备用。
(2)在第一步得到的0.2ml样品中加入0.6ml溶液A，震荡混匀30s，随后室温放置10min。
(3)将短暂离心过的500μl溶液小心的用枪移到吸附柱内，室温下放置2min。
(4)12000rpm室温下离心1min，弃掉穿透液，重新把吸附柱放回收集管中。
(5)将剩余的溶液短暂离心后全部转移到第(3)步中的吸附柱内，室温下放置2min。
(6)12000rpm室温下离心1min后，弃掉穿透液，把吸附柱放回收集管内。
(7)在吸附柱中加入0.7ml的洗柱液，12000rpm室温离心1min，弃掉穿透液，把吸附柱放回收集管中。
(8)12000rpm室温下离心1min，舍弃含穿透液的离心管。
(9)将吸附柱套入一个新的1.5ml的离心管中后，在吸附柱的滤膜的中部加入30-100μl DNA洗脱液，室温下放置2min。
(10)12000rpm室温下离心1min，管底溶液即提取的DNA溶液，可立即使用或放-20℃冰箱长期保存。
1.2.3引物的设计与合成
参照文献，以猪细小病毒(GenBank序列号为NC-001718)的VP2蛋白基因序列为靶序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物和探针。上游引物：PPV：上游引物：5’-CAAACAGATCTCTAGGACTGC-3’，下游引物：5’-Cy3-GTGGTTAAGTGTCCATGTTGG-3’，探针：5’-NH2-TTTTTTTT-CAGCAATTAGGCCAGCTC-3’。在下游5’端进行Cy3荧光标记，探针的5’端氨基化修饰，并在氨基和探针之间加上8个T。引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成。用TEbuffer将合成好的冻干引物稀释为10μM/L的浓度置于-20℃冻存备用。
1.2.4基因芯片的制备
先用灭菌水将合成好的冻干探针稀释成100μM/L的母液，再依次稀释成5μM/L(5μl探针+45μl灭菌水+50μl点样缓冲液)、10μM/L(10μl探针+40μl灭菌水+50μl点样缓冲液)、15μM/L(15μl探针+35μl灭菌水+50μl点样缓冲液)、20μM/L(20μl探针+30μl灭菌水+50μl点样缓冲液)。
在96孔U形板的A1孔加入100μl点样缓冲液作阴性对照，A4孔加入100μl含荧光的PCR产物作阳性对照，A2、A3、A5、A6孔分别加入100μl 5μM/L、10μM/L、15μM/L、20μM/L的探针。
使用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样。点样环境参数为相对湿度55-65％，温度20-30℃，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定为六个矩阵，每个矩阵点样为5×3，点样完毕的基因芯片静置于80℃烘箱干燥2h备用。
基因芯片点样示意图见图1。
1.2.5杂交用PCR产物的制备与鉴定
对反应条件和参数逐个进行优化，确立最佳浓度和扩增反应条件，杂交用产物需采用不对称PCR。反应总体积为25μl，其组成如下：
试验时先预混合上述反应体系中除下游引物以外的所有成分，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，制得杂交用PCR产物。
PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，(94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环)72℃延伸5min。
取杂交用PCR产物6μl与1μl 6×Lording Buffer，用10μl移液器混合均匀后，将枪头小心深入到加样孔中，注意不要伸到孔底部，以免穿透加样孔而导致样品外溢，缓慢推出使样品垂直落入加样孔中。
加样结束后，盖上电泳槽盖，调节电压为110V，关闭电泳室灯光，避光电泳30min。待电泳结束后，小心取出凝胶放置于凝胶成像系统中，观察并拍照保存结果。
1.2.6基因芯片的杂交
将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加于离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将基因芯片放入杂交盒内，置于47℃恒温箱中避光杂交1h。
1.2.7基因芯片的洗涤和干燥
基因芯片的洗涤应在暗室中完成。杂交完毕的基因芯片放置在玻片架上，立即用1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC各洗涤2min，离心干燥后即可用于扫描分析。
1.2.8基因芯片的扫描及扫描结果分析
将基因芯片置于InnoScan 700A高性能激光共聚焦扫描仪上扫描，如果背景较高可用洗液3(1×SSC)再洗涤一次，以TIF格式保存图像，然后再另存为JPG格式图片。用MAPIX软件分析Cy3荧光信号的强度和比值，用以下三个条件作为基因芯片杂交结果判定的依据：
(1)模板DNA的PCR扩增效果良好；
(2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰(清晰程度和杂交条件有很大关系)；
(3)检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR≥1.5。
本发明工艺简单，能对猪细小病毒进行快速、灵敏的检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下：
1、PCR扩增结果
以猪细小病毒基因组DNA为模板，与其特异性引物进行不对称PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段大小约为313bp，与预计目的片段相同，特异性较好。
2、基因芯片杂交结果
不对称的杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即冰浴5min，取该产物40μl和杂交缓冲液160μl加于离心管中充分混合均匀，将该混合液全部加到基因芯片点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于47℃恒温箱避光杂交1h。杂交结果经扫描仪扫描，各杂交斑点的SNR值均大于1.5。
结果表明，采用5μM/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，从而降低了检测成本，可用于大规模检测。
本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需1小时，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μM/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于规模化猪场细小病毒病的排查工作。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背 离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人
<120> 一种检测猪细小病毒的基因芯片的制备方法及使用方法
<130> 2017
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知
<400> 1
caaacagatc tctaggactg c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知
<400> 2
cygtggttaa gtgtccatgt tgg 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
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