一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法及其应用。
背景技术
乳腺癌、卵巢癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤。不同国家女性乳腺癌的发病率显著不同，以美国和北欧发病率最高。乳腺癌的发生、发展与多种因素有关，是由环境因素和遗传因素共同作用的结果。BRCA1、BRCA2是Breast Cancer Susceptibility Gene 1、2的缩写，即乳腺癌易感基因1/2。其中，BRCA1基因定位于人类染色体17q21，由23个外显子构成；BRCA2基因定位于人类染色体13q12.3，由27个外显子构成。BRCA1、BRCA2基因同为抑癌基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥着重要作用。
数据表明，约2％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在BRCA1、BRCA2基因突变。BRCA1、BRCA2基因突变状态与家族性乳腺癌发病关系十分密切，基因突变表型往往具有诱发乳腺癌和卵巢癌的趋向。研究显示，BRCA1和BRCA2基因突变携带者是发生乳腺癌、卵巢癌的高危人群，其终生乳腺癌患病风险显著增加：突变携带者罹患乳腺癌的概率为40-80％，罹患卵巢癌的概率为16-60％(一般人群患癌风险分别为12％和1％)。BRCA2基因突变亦会造成男性乳癌(发生率6％)。
据乳腺癌信息中心(Breast Cancer Informationcore,BIC)报道，BRCA1、BRCA2基因突变已达到3000多种，这些突变分布于整个编码区，最常见的致病性突变为移码突变、无义突变等，没有明显的突变热点。大多突变导致截短蛋白的形成，使BRCA1、BRCA2蛋白质功能丧失，从而导致肿瘤发生。
BRCA1、BRCA2基因突变不存在高频率的突变热点，这意味着，基因测序不能只检测BRCA1、BRCA2基因某几个固定的位点，而是要进行全基因测序。本试剂盒对BRCA1/2基因全外显子进行扩增文库制备，于高通量测序仪上进行测序反应，可以快速地检测BRCA1/2基因编码区外显子的共计193个突变位点(点突变，小片段插入、缺少、重复)，具体信息参见表1。通过检测BRCA1、BRCA2基因突变，可以反映乳腺癌的发生发展，也可筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群；通过对携带BRCA1、BRCA2 基因突变的高危人群进行严密的随访和监测，有助于乳腺癌的及早发现、及早诊断和及早治疗，从而获得更好的治疗效果。有报道指出，尚未患乳腺癌的女性BRCA基因突变携带者可通过干预措施(比如预防性乳腺切除术或服用他莫昔芬)、筛查或二者结合进行预防、以及辅助指导个体化用药。
现有的肿瘤基因检测主要采用荧光定量PCR法，检测通量低，对于BRCA1和BRCA2基因全外显子检测时，费用高及样本量需求大，导致临床收费高及样本量不足。而目前行业公认的基因突变检测金标准是Sanger测序法，这类技术操作复杂，通量较低，灵敏度低，具有一定的漏检风险，难以满足大量肿瘤患者的检测需求。因此，发展一种准确率高、通量大、安全的肿瘤BRCA1和BRCA2基因全外显子检测方法，是对现有肿瘤个体化诊疗的有效补充和完善。
高通量测序(High-Throughput Sequencing)又名下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)，能够实现一次并行对几十万到几百万条目标核酸分子进行序列测定，具有高输出量与高解析度的特性，不仅提供了丰富的序列变异信息，而且使得测序的费用和时间大大缩短，迅速获得认可。在癌症多通路多靶标研究中发挥显著作用，凸显出这一全新技术手段的临床重要性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法。
本发明的另一目的在于提供基于上述构建方法的试剂盒。
本发明的具体技术方案如下：
一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法，覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变，具体包括如下步骤：
(1)针对目的基因BRCA1/2设计第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组，该第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组的所有正向引物和反向引物的5’端均设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，该第二基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；
(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不 对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃；
(3)将模板、上述第一基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的第一PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第一扩增产物；将模板、上述第二基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的第二PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第二扩增引物；
(4)将第一扩增产物、第二扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序的肿瘤BRCA1/2基因变异文库；
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一扩增引物组包括BA2-001-F、BA2-001-R、BA1-001-F、BA1-001-R、BA2-002-F、BA2-002-R、BA1-002-F、BA1-002-R、BA2-003-F、BA2-003-R、BA2-004-F、BA2-004-R、BA1-003-F、BA1-003-R、BA1-004-F、BA1-004-R、BA1-005-F、BA1-005-R、BA1-006-F、BA1-006-R、BA1-007-F、BA1-007-R、BA1-008-F、BA1-008-R、BA1-009-F、BA1-009-R、BA1-010-F、BA1-010-R、BA1-011-F、BA1-011-R、BA1-012-F、BA1-012-R、BA2-005-F、BA2-005-R、BA2-006-F、BA2-006-R、BA2-007-F、BA2-007-R、BA2-008-F、BA2-008-R、BA2-009-F、BA2-009-R、BA1-013-F、BA1-013-R、BA2-010-F、BA2-010-R、BA2-011-F、BA2-011-R、BA2-012-F、BA2-012-R、BA2-013-F、BA2-013-R、BA2-014-F、BA2-014-R、BA2-015-F、BA2-015-R、BA2-016-F、BA2-016-R、BA2-017-F、BA2-017-R、BA2-018-F、BA2-018-R、BA2-019-F、BA2-019-R、BA2-020-F、BA2-020-R、BA2-021-F、BA2-021-R、BA2-022-F、BA2-022-R、BA2-023-F、BA2-023-R、BA2-024-F、BA2-024-R、BA2-025-F、BA2-025-R、BA2-026-F、BA2-026-R、BA2-027-F、BA2-027-R、BA2-028-F、BA2-028-R、BA2-029-F、BA2-029-R、BA2-030-F、BA2-030-R、BA2-031-F、BA2-031-R、BA2-032-F、BA2-032-R、BA2-033-F、BA2-033-R、BA2-034-F、BA2-034-R、BA2-035-F、BA2-035-R、BA2-036-F、BA2-036-R、BA2-037-F、BA2-037-R、BA2-038-F、BA2-038-R、BA2-039-F、BA2-039-R、BA2-040-F、BA2-040-R、BA2-041-F、BA2-041-R、BA2-042-F、BA2-042-R、BA2-043-F、BA2-043-R、BA2-044-F、BA2-044-R、BA2-045-F、BA2-045-R、BA2-046-F、BA2-046-R、BA2-047-F、BA2-047-R、BA2-048-F、BA2-048-R、BA2-049-F、BA2-049-R、BA2-050-F、BA2-050-R、BA2-051-F、BA2-051-R、 BA2-052-F、BA2-052-R、BA2-053-F、BA2-053-R、BA2-054-F、BA2-054-R、BA2-055-F、BA2-055-R、BA2-056-F、BA2-056-R、BA2-057-F、BA2-057-R、BA2-058-F、BA2-058-R、BA2-059-F、BA2-059-R、BA1-014-F、BA1-014-R、BA1-015-F、BA1-015-R、BA1-016-F、BA1-016-R、BA1-017-F、BA1-017-R、BA1-018-F、BA1-018-R、BA1-019-F、BA1-019-R、BA1-020-F、BA1-020-R、BA1-021-F、BA1-021-R、BA1-022-F、BA1-022-R、BA1-023-F、BA1-023-R、BA1-024-F、BA1-024-R、BA1-025-F、BA1-025-R、BA1-026-F、BA1-026-R、BA1-027-F、BA1-027-R、BA1-028-F、BA1-028-R、BA1-029-F、BA1-029-R、BA1-030-F、BA1-030-R、BA1-031-F、BA1-031-R、BA1-032-F、BA1-032-R、BA1-033-F、BA1-033-R、BA1-034-F、BA1-034-R、BA1-035-F、BA1-035-R、BA1-036-F、BA1-036-R、BA2-060-F、BA2-060-R、BA2-061-F、BA2-061-R、BA1-037-F、BA1-037-R、2-BA2-062-F、2-BA2-062-R、2-BA1-038-F和2-BA1-038-R、，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 200所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二扩增引物组包括2-BA2-063-F、2-BA2-063-R、2-BA2-064-F、2-BA2-064-R、2-BA2-065-F、2-BA2-065-R、2-BA2-066-F、2-BA2-066-R、2-BA2-067-F、2-BA2-067-R、2-BA2-068-F、2-BA2-068-R、2-BA2-069-F、2-BA2-069-R、2-BA2-070-F、2-BA2-070-R、2-BA1-039-F、2-BA1-039-R、2-BA1-040-F、2-BA1-040-R、2-BA1-041-F、2-BA1-041-R、2-BA1-042-F、2-BA1-042-R、2-BA1-043-F、2-BA1-043-R、2-BA1-044-F、2-BA1-044-R、2-BA1-045-F、2-BA1-045-R、2-BA1-046-F、2-BA1-046-R、2-BA2-071-F、2-BA2-071-R、2-BA2-072-F、2-BA2-072-R、2-BA2-073-F、2-BA2-073-R、2-BA2-074-F、2-BA2-074-R、2-BA2-075-F、2-BA2-075-R、2-BA1-047-F、2-BA1-047-R、2-BA2-076-F、2-BA2-076-R、2-BA1-048-F、2-BA1-048-R、2-BA2-077-F、2-BA2-077-R、2-BA2-078-F、2-BA2-078-R、2-BA2-079-F、2-BA2-079-R、2-BA2-080-F、2-BA2-080-R、2-BA2-081-F、2-BA2-081-R、2-BA2-082-F、2-BA2-082-R、2-BA2-083-F、2-BA2-083-R、2-BA2-084-F、2-BA2-084-R、2-BA2-085-F、2-BA2-085-R、2-BA2-086-F、2-BA2-086-R、2-BA2-087-F、2-BA2-087-R、2-BA2-088-F、2-BA2-088-R、2-BA2-089-F、2-BA2-089-R、2-BA2-090-F、2-BA2-090-R、2-BA2-091-F、2-BA2-091-R、2-BA2-092-F、2-BA2-092-R、2-BA2-093-F、2-BA2-093-R、2-BA2-094-F、2-BA2-094-R、2-BA2-095-F、2-BA2-095-R、2-BA2-096-F、2-BA2-096-R、2-BA2-097-F、2-BA2-097-R、2-BA2-098-F、2-BA2-098-R、2-BA2-099-F、2-BA2-099-R、2-BA2-100-F、2-BA2-100-R、2-BA2-101-F、2-BA2-101-R、2-BA2-102-F、2-BA2-102-R、2-BA2-103-F、2-BA2-103-R、2-BA2-104-F、2-BA2-104-R、2-BA2-105-F、2-BA2-105-R、2-BA2-106-F、2-BA2-106-R、2-BA2-107-F、 2-BA2-107-R、2-BA2-108-F、2-BA2-108-R、2-BA2-109-F、2-BA2-109-R、2-BA2-110-F、2-BA2-110-R、2-BA2-111-F、2-BA2-111-R、2-BA2-112-F、2-BA2-112-R、2-BA2-113-F、2-BA2-113-R、2-BA2-114-F、2-BA2-114-R、2-BA2-115-F、2-BA2-115-R、2-BA2-116-F、2-BA2-116-R、2-BA2-117-F、2-BA2-117-R、2-BA2-118-F、2-BA2-118-R、2-BA2-119-F、2-BA2-119-R、2-BA2-120-F、2-BA2-120-R、2-BA2-121-F、2-BA2-121-R、2-BA1-049-F、2-BA1-049-R、2-BA1-050-F、2-BA1-050-R、2-BA1-051-F、2-BA1-051-R、2-BA1-052-F、2-BA1-052-R、2-BA1-053-F、2-BA1-053-R、2-BA1-054-F、2-BA1-054-R、2-BA1-055-F、2-BA1-055-R、2-BA1-056-F、2-BA1-056-R、2-BA1-057-F、2-BA1-057-R、2-BA1-058-F、2-BA1-058-R、2-BA1-059-F、2-BA1-059-R、2-BA1-060-F、2-BA1-060-R、2-BA1-061-F、2-BA1-061-R、2-BA1-062-F、2-BA1-062-R、2-BA1-063-F、2-BA1-063-R、2-BA1-064-F、2-BA1-064-R、2-BA1-065-F、2-BA1-065-R、2-BA1-066-F、2-BA1-066-R、2-BA1-067-F、2-BA1-067-R、2-BA1-068-F、2-BA1-068-R、2-BA1-069-F、2-BA1-069-R、2-BA1-070-F、2-BA1-070-R、2-BA1-071-F、2-BA1-071-R、2-BA1-072-F、2-BA1-072-R、2-BA1-073-F、2-BA1-073-R、2-BA1-074-F和2-BA1-074-R，其序列依次如SEQ ID 201～SEQ ID 390所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF、Ion-BC8-RR、Ion-BC9-FF、Ion-BC9-FR、Ion-BC9-RF、Ion-BC9-RR、Ion-BC10-FF、Ion-BC10-FR、Ion-BC10-RF、Ion-BC10-RR、Ion-BC11-FF、Ion-BC11-FR、Ion-BC11-RF、Ion-BC11-RR、Ion-BC12-FF、Ion-BC12-FR、Ion-BC12-RF、Ion-BC12-RR、Ion-BC13-FF、Ion-BC13-FR、Ion-BC13-RF、Ion-BC13-RR、Ion-BC14-FF、Ion-BC14-FR、Ion-BC14-RF、Ion-BC14-RR、Ion-BC15-FF、Ion-BC15-FR、Ion-BC15-RF、Ion-BC15-RR、Ion-BC16-FF、Ion-BC16-FR、Ion-BC16-RF和Ion-BC16-RR，其序列依次如SEQ ID 391～SEQ ID 454所示，上述BC1～16分别表示八种不同的标签序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述通用引物为C-primer，其序列如SEQ ID 455所示。
一种基于上述构建方法的试剂盒，包括：
一第一DNA富集反应组件，包括第一扩增引物组；
一第二DNA富集反应组件，包括第二扩增引物组；
一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；
一Barcode1～16反应组件，包括不对称连接探针组和通用引物，具体包括连在一起的十六个反应孔，每个反应孔分别装有对应的标签序列的不对称连接探针和通用引物；
一阳性质控品；
和一阴性质控品。本发明的有益效果是：
1、本发明的构建方法针对BRCA1和BRCA2基因全外显子序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上肿瘤疾病中在少量的临床样本基础上需要对基因全外显子检测这一难点，且成本低廉。
2、本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台。
3、本发明的构建方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自外周血的样品所获得的DNA依然适用，基于其的检测方法依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
附图说明
图1为本发明的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图。
图2为本发明的实施例检测BRCA1/2基因突变的检测均一性结果图。
图3为本发明的实施例检测BRCA1/2基因突变的检测突变结果之一。
图4为本发明实施例检测BRCA1/2基因突变的检测突变结果之二。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中的HotStar-Taq酶、T4DNA连接酶、DNA末端修饰酶、RingCap buffer、MgCl2和dNTPs均购自中国大连宝生物公司。
实施例1
一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法，覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变，具体外显子突变的信息如下表1：
表1
具体包括如下步骤：
一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法，覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变，具体包括如下步骤：
(1)针对目的基因BRCA1/2设计第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组，该第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组的所有正向引物和反向引物的5’端均设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，该第二基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；具体的，所述第一扩增引物组包括BA2-001-F、BA2-001-R、BA1-001-F、BA1-001-R、BA2-002-F、BA2-002-R、BA1-002-F、BA1-002-R、BA2-003-F、BA2-003-R、BA2-004-F、BA2-004-R、BA1-003-F、BA1-003-R、BA1-004-F、BA1-004-R、BA1-005-F、BA1-005-R、BA1-006-F、BA1-006-R、BA1-007-F、BA1-007-R、BA1-008-F、BA1-008-R、BA1-009-F、BA1-009-R、BA1-010-F、BA1-010-R、BA1-011-F、BA1-011-R、BA1-012-F、BA1-012-R、BA2-005-F、BA2-005-R、BA2-006-F、BA2-006-R、BA2-007-F、BA2-007-R、BA2-008-F、BA2-008-R、 BA2-009-F、BA2-009-R、BA1-013-F、BA1-013-R、BA2-010-F、BA2-010-R、BA2-011-F、BA2-011-R、BA2-012-F、BA2-012-R、BA2-013-F、BA2-013-R、BA2-014-F、BA2-014-R、BA2-015-F、BA2-015-R、BA2-016-F、BA2-016-R、BA2-017-F、BA2-017-R、BA2-018-F、BA2-018-R、BA2-019-F、BA2-019-R、BA2-020-F、BA2-020-R、BA2-021-F、BA2-021-R、BA2-022-F、BA2-022-R、BA2-023-F、BA2-023-R、BA2-024-F、BA2-024-R、BA2-025-F、BA2-025-R、BA2-026-F、BA2-026-R、BA2-027-F、BA2-027-R、BA2-028-F、BA2-028-R、BA2-029-F、BA2-029-R、BA2-030-F、BA2-030-R、BA2-031-F、BA2-031-R、BA2-032-F、BA2-032-R、BA2-033-F、BA2-033-R、BA2-034-F、BA2-034-R、BA2-035-F、BA2-035-R、BA2-036-F、BA2-036-R、BA2-037-F、BA2-037-R、BA2-038-F、BA2-038-R、BA2-039-F、BA2-039-R、BA2-040-F、BA2-040-R、BA2-041-F、BA2-041-R、BA2-042-F、BA2-042-R、BA2-043-F、BA2-043-R、BA2-044-F、BA2-044-R、BA2-045-F、BA2-045-R、BA2-046-F、BA2-046-R、BA2-047-F、BA2-047-R、BA2-048-F、BA2-048-R、BA2-049-F、BA2-049-R、BA2-050-F、BA2-050-R、BA2-051-F、BA2-051-R、BA2-052-F、BA2-052-R、BA2-053-F、BA2-053-R、BA2-054-F、BA2-054-R、BA2-055-F、BA2-055-R、BA2-056-F、BA2-056-R、BA2-057-F、BA2-057-R、BA2-058-F、BA2-058-R、BA2-059-F、BA2-059-R、BA1-014-F、BA1-014-R、BA1-015-F、BA1-015-R、BA1-016-F、BA1-016-R、BA1-017-F、BA1-017-R、BA1-018-F、BA1-018-R、BA1-019-F、BA1-019-R、BA1-020-F、BA1-020-R、BA1-021-F、BA1-021-R、BA1-022-F、BA1-022-R、BA1-023-F、BA1-023-R、BA1-024-F、BA1-024-R、BA1-025-F、BA1-025-R、BA1-026-F、BA1-026-R、BA1-027-F、BA1-027-R、BA1-028-F、BA1-028-R、BA1-029-F、BA1-029-R、BA1-030-F、BA1-030-R、BA1-031-F、BA1-031-R、BA1-032-F、BA1-032-R、BA1-033-F、BA1-033-R、BA1-034-F、BA1-034-R、BA1-035-F、BA1-035-R、BA1-036-F、BA1-036-R、BA2-060-F、BA2-060-R、BA2-061-F、BA2-061-R、BA1-037-F、BA1-037-R、2-BA2-062-F、2-BA2-062-R、2-BA1-038-F和2-BA1-038-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 200所示；所述第二扩增引物组包括2-BA2-063-F、2-BA2-063-R、2-BA2-064-F、2-BA2-064-R、2-BA2-065-F、2-BA2-065-R、2-BA2-066-F、2-BA2-066-R、2-BA2-067-F、2-BA2-067-R、2-BA2-068-F、2-BA2-068-R、2-BA2-069-F、2-BA2-069-R、2-BA2-070-F、2-BA2-070-R、2-BA1-039-F、2-BA1-039-R、2-BA1-040-F、2-BA1-040-R、2-BA1-041-F、2-BA1-041-R、2-BA1-042-F、2-BA1-042-R、2-BA1-043-F、2-BA1-043-R、2-BA1-044-F、2-BA1-044-R、2-BA1-045-F、2-BA1-045-R、2-BA1-046-F、2-BA1-046-R、2-BA2-071-F、2-BA2-071-R、2-BA2-072-F、2-BA2-072-R、2-BA2-073-F、 2-BA2-073-R、2-BA2-074-F、2-BA2-074-R、2-BA2-075-F、2-BA2-075-R、2-BA1-047-F、2-BA1-047-R、2-BA2-076-F、2-BA2-076-R、2-BA1-048-F、2-BA1-048-R、2-BA2-077-F、2-BA2-077-R、2-BA2-078-F、2-BA2-078-R、2-BA2-079-F、2-BA2-079-R、2-BA2-080-F、2-BA2-080-R、2-BA2-081-F、2-BA2-081-R、2-BA2-082-F、2-BA2-082-R、2-BA2-083-F、2-BA2-083-R、2-BA2-084-F、2-BA2-084-R、2-BA2-085-F、2-BA2-085-R、2-BA2-086-F、2-BA2-086-R、2-BA2-087-F、2-BA2-087-R、2-BA2-088-F、2-BA2-088-R、2-BA2-089-F、2-BA2-089-R、2-BA2-090-F、2-BA2-090-R、2-BA2-091-F、2-BA2-091-R、2-BA2-092-F、2-BA2-092-R、2-BA2-093-F、2-BA2-093-R、2-BA2-094-F、2-BA2-094-R、2-BA2-095-F、2-BA2-095-R、2-BA2-096-F、2-BA2-096-R、2-BA2-097-F、2-BA2-097-R、2-BA2-098-F、2-BA2-098-R、2-BA2-099-F、2-BA2-099-R、2-BA2-100-F、2-BA2-100-R、2-BA2-101-F、2-BA2-101-R、2-BA2-102-F、2-BA2-102-R、2-BA2-103-F、2-BA2-103-R、2-BA2-104-F、2-BA2-104-R、2-BA2-105-F、2-BA2-105-R、2-BA2-106-F、2-BA2-106-R、2-BA2-107-F、2-BA2-107-R、2-BA2-108-F、2-BA2-108-R、2-BA2-109-F、2-BA2-109-R、2-BA2-110-F、2-BA2-110-R、2-BA2-111-F、2-BA2-111-R、2-BA2-112-F、2-BA2-112-R、2-BA2-113-F、2-BA2-113-R、2-BA2-114-F、2-BA2-114-R、2-BA2-115-F、2-BA2-115-R、2-BA2-116-F、2-BA2-116-R、2-BA2-117-F、2-BA2-117-R、2-BA2-118-F、2-BA2-118-R、2-BA2-119-F、2-BA2-119-R、2-BA2-120-F、2-BA2-120-R、2-BA2-121-F、2-BA2-121-R、2-BA1-049-F、2-BA1-049-R、2-BA1-050-F、2-BA1-050-R、2-BA1-051-F、2-BA1-051-R、2-BA1-052-F、2-BA1-052-R、2-BA1-053-F、2-BA1-053-R、2-BA1-054-F、2-BA1-054-R、2-BA1-055-F、2-BA1-055-R、2-BA1-056-F、2-BA1-056-R、2-BA1-057-F、2-BA1-057-R、2-BA1-058-F、2-BA1-058-R、2-BA1-059-F、2-BA1-059-R、2-BA1-060-F、2-BA1-060-R、2-BA1-061-F、2-BA1-061-R、2-BA1-062-F、2-BA1-062-R、2-BA1-063-F、2-BA1-063-R、2-BA1-064-F、2-BA1-064-R、2-BA1-065-F、2-BA1-065-R、2-BA1-066-F、2-BA1-066-R、2-BA1-067-F、2-BA1-067-R、2-BA1-068-F、2-BA1-068-R、2-BA1-069-F、2-BA1-069-R、2-BA1-070-F、2-BA1-070-R、2-BA1-071-F、2-BA1-071-R、2-BA1-072-F、2-BA1-072-R、2-BA1-073-F、2-BA1-073-R、2-BA1-074-F和2-BA1-074-R，其序列依次如SEQ ID 201～SEQ ID 390所示；
(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增 序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃；具体的，所述不对称连接探针组包括Ion-BC1-FF、Ion-BC1-FR、Ion-BC1-RF、Ion-BC1-RR、Ion-BC2-FF、Ion-BC2-FR、Ion-BC2-RF、Ion-BC2-RR、Ion-BC3-FF、Ion-BC3-FR、Ion-BC3-RF、Ion-BC3-RR、Ion-BC4-FF、Ion-BC4-FR、Ion-BC4-RF、Ion-BC4-RR、Ion-BC5-FF、Ion-BC5-FR、Ion-BC5-RF、Ion-BC5-RR、Ion-BC6-FF、Ion-BC6-FR、Ion-BC6-RF、Ion-BC6-RR、Ion-BC7-FF、Ion-BC7-FR、Ion-BC7-RF、Ion-BC7-RR、Ion-BC8-FF、Ion-BC8-FR、Ion-BC8-RF、Ion-BC8-RR、Ion-BC9-FF、Ion-BC9-FR、Ion-BC9-RF、Ion-BC9-RR、Ion-BC10-FF、Ion-BC10-FR、Ion-BC10-RF、Ion-BC10-RR、Ion-BC11-FF、Ion-BC11-FR、Ion-BC11-RF、Ion-BC11-RR、Ion-BC12-FF、Ion-BC12-FR、Ion-BC12-RF、Ion-BC12-RR、Ion-BC13-FF、Ion-BC13-FR、Ion-BC13-RF、Ion-BC13-RR、Ion-BC14-FF、Ion-BC14-FR、Ion-BC14-RF、Ion-BC14-RR、Ion-BC15-FF、Ion-BC15-FR、Ion-BC15-RF、Ion-BC15-RR、Ion-BC16-FF、Ion-BC16-FR、Ion-BC16-RF和Ion-BC16-RR，其序列依次如SEQ ID 391～SEQ ID 454所示，上述BC1～16分别表示十六种不同的标签序列；所述通用引物为C-primer，其序列如SEQ ID 455所示；
(3)将模板、上述第一基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的第一PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第一扩增产物；将模板、上述第二基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的第二PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第二扩增引物；
(4)将第一扩增产物、第二扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序的肿瘤BRCA1/2基因变异文库；
上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；
(5)通过Ion torrent PGM高通量测序仪进行文库上机检测，获得目标序列信息，通过VC软件进行数据信息比对分析，得到样本突变状态。
上述模板所来自的样品适用范围包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋病例组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液等标本。
新鲜病理组织，取绿豆大小，约1g重，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。
蜡块样品切成5～8μm切片，取5片，或已经制成的5～8μm切片取5片，经过二甲苯脱蜡后，使用Qiagen公司石蜡包埋DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试 剂盒操作说明。
全血、血浆、血清以及胸腔积液样品，使用Qiagen公司组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取全血200μl，血浆、血清以及胸腔积液不少于800μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH 8.0)调整DNA浓度到100ng/μl或2ng/μl作为PCR扩增的模板。
基于上述构建方法的试剂盒包括：
一第一DNA富集反应组件，包括第一扩增引物组，该第一扩增引物组包括BRCA-primer-Mix1至BRCA-primer-Mix10，每人份的第一DNA富集反应组件的BRCA-primer-Mix1至BRCA-primer-Mix10的配方如下表所示：
BRCA-primer-Mix1配制配方表：
BRCA-primer-Mix2配制配方表：
BRCA-primer-Mix3配制配方表：
BRCA-primer-Mix4配制配方表：
BRCA-primer-Mix5配制配方表：
BRCA-primer-Mix6配制配方表：
BRCA-primer-Mix7配制配方表：
BRCA-primer-Mix8配制配方表：
BRCA-primer-Mix9配制配方表：
BRCA-primer-Mix10配制配方表：
一第二DNA富集反应组件，包括第二扩增引物组，该第二扩增引物组包括BRCA-primer-Mix11至BRCA-primer-Mix20，每人份的第二DNA富集反应组件的BRCA-primer-Mix11至BRCA-primer-Mix20的配方如下表所示：
BRCA-primer-Mix11配制配方表
BRCA-primer-Mix12配制配方表
BRCA-primer-Mix13配制配方表
BRCA-primer-Mix14配制配方表
BRCA-primer-Mix15配制配方表
BRCA-primer-Mix16配制配方表
BRCA-primer-Mix17配制配方表
BRCA-primer-Mix18配制配方表
BRCA-primer-Mix19配制配方表
BRCA-primer-Mix20配制配方表
一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，优选比例1:1:1；
一Barcode1～16反应组件，包括不对称连接探针组和通用引物，具体包括连在一起的十六个反应孔，每个反应孔分别装有对应的标签序列的不对称连接探针和通用引物，每人份的Barcode1～16反应组件的配方如下表所示：
一阴性质控品，无核酸水；
和一阳性质控品(阳性突变序列合成质粒)，浓度为2ng/μL。
将上述试剂盒用前述的构建方法进行实验，以BRCA1和BRCA2基因NM_000059:exon3:c.71_96del:p.L24fs突变为例来分析本发明的检测肿瘤BRCA1和BRCA2基因全外显子突变的方法。实验用细胞系3株和突变质粒序列，分别为BRCA-M1(带c.71_96del:p.L24fs突变)、H460(BRCA1/2基因野生型)、293T(BRCA1/2基因野生型)、SW480(BRCA1/2基因野生型)；100份乳腺癌家族遗传史的全血样品、20份临床乳腺癌样品(包括新鲜组织、石蜡切片、胸腔积液、全血)：
所述第一和第二PCR反应体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5μL，RingCap-Taq酶(具体由HotStar-Taq酶、T4DNA连接酶和DNA末端修饰酶以1:1:1的比例组成，物料浓度：5U/μL/每种)的加入量为0.25μL，其余组分如下表所示：
第一PCR反应体系
第二PCR反应体系
PCR扩增程序设置如下表：
上述第一和第二PCR反应体系所得的第一和第二扩增产物的纯化具体如下：
取出Agencourt AMPure XP试剂置于室温，同时要打散磁珠，同时配制新鲜的70％的乙醇(230μL无水乙醇+100μL无核酸酶水)，必须是新鲜配制的。
第一轮纯化步骤
(1)向每个样品反应管25μL产物中分别加入12.5μL(0.5x样本体积)的Agencourt AMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
(2)室温孵育5分钟；
(3)放置在磁力架上面，孵育5分钟，一直到溶液澄清；
(4)小心地吸取上清液置于新的离心管，不要扰动磁珠；注意：上清液中含有扩增产物不要丢弃。
第二轮纯化步骤
(1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPure XP 试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA；
(2)室温孵育5分钟；
(3)放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。
(4)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液；
(5)重复上述步骤4，进行第二次洗涤；
(6)确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。
(7)将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μL TE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。
将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增产物。取出20μL上清。
上述纯化所得的第一扩增产物和第二扩增产物制备用于高通量测序的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的PCR反应的模板量为5μL，RingCap-Taq酶(具体由HotStar-Taq酶、T4DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，物料浓度：5U/μL/每种)的加入量为0.25μL，其余组分如下表所示：
PCR扩增程序设置如下表：
分别按纯化第一扩增产物和第二扩增产物方法进行纯化，制得用于高通量测序的肿瘤 BRCA1/2基因变异文库。
上述用于高通量测序的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的检测具体如下：
如图1所示，本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台。且如图2至图4所示，本发明的构建方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品和来自外周血的样品所获得的DNA依然适用，基于其的检测方法依然具有与新鲜组织样品DNA同样的扩增和检测能力。
前述100份全血样品以及细胞系H460(BRCA1/2基因野生型)、293T(BRCA1/2基因野生型)、SW480(BRCA1/2基因野生型)，突变质粒(带c.71_96del:p.L24fs突变)经本发明的体系检测，只有突变质粒DNA有检测到突变序列，其他样品无突变序列，进一步证明了该方法的特异性。
灵敏度分析：将突变型质粒DNA从100ng/μL连续10倍梯度稀释，分别为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL。每次反应加入5μL DNA。结果表明本发明的文库构建方法的灵敏度高，50拷贝DNA基因组即可检出。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，100ng/反应和10ng/反应。先将突变质粒的DNA和野生型细胞系DNA浓度都调整为20ng/μL和2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为100ng/反应和10ng/反应。按下述方法配置模拟DNA模板。
A:50％即为100ng/μL突变细胞DNA。
B:30％取A液60μL后混入40μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
C:20％取A液40μL后混入60μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
D:15％取B液50μL后混入50μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
E:10％取C液50μL后混入50μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
F:5％取E液50μL后混入50μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
G:1％取F液20μL后混入80μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
H:0.5％取G液50μL后混入50μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
I:0.1％取H液20μL后混入80μL 100ng/μL野生型细胞DNA，震荡混均。
结果表明本发明的肿瘤BRCA1/2基因全外显子突变检测方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可以检出50拷贝的突变DNA，检测能力为1％。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行 高通量测序检测，10次结果一致，符合率100％。
收集手术切除的乳腺癌标本，全血标本标本共50例，其中20组织样品，30例全血。其中男性28例，女性22例。年龄为36-71岁，平均年龄为55岁。
对于肿瘤BRCA1/2基因，本发明检测结果与DNA测序结果完全一致：50例样品中有4例发生BRCA1基因突变，2例发生BRCA1基因突变，44例正常肺组织对照均为野生型。
由上可知，本发明肿瘤BRCA1和BRCA2基因文库构建反应就可以同时检测肿瘤BRCA1和BRCA2基因全外显子突变位点，文库构建时间仅需3小时，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。而且，高通量测序法和传统测序方法结果的符合率为100％，高通量测序法灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法，10ng样品DNA中含1％的突变DNA即可检出。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
