一种用于微量DNA高效建库的方法
技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，特别涉及一种用于微量DNA高效建库的方法。
背景技术
针对微量DNA样本(＜50ng)，常用的NEB、KAPAbiosystems和Illumina的建库试剂盒的建库转化效率偏低，如其中KAPAbiosystems的KAPA hyper建库试剂盒对与25ng170bp的DNA片段的建库转化效率为2.21％-8.84％，对于50ng170bp的DNA片段的建库转化效率为4.43％-8.84％。对于微量DNA样本，高建库转化效率是提高测序检测中对低频变异分析效率的关键参数之一，因此开发提高微量DNA样本建库转化效率的实验技术十分重要和必要。
发明创造内容
本发明所要解决的技术问题旨在提供一种保留传统测序文库构建优势的基础上，通过减少损耗提高效率，以提高对微量DNA样本原始DNA拷贝的转化效率，并可以使之高效用于cfDNA(循环游离DNA)等微量DNA样品的测序文库构建中的用于微量DNA高效建库的方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一种用于微量DNA高效建库的方法，包括如下步骤：
(1)使用超纯T4DNA聚合酶用于DNA末端补平和切平，提高末端修复效率。超纯T4DNA聚合酶采用Enzymatics Inc.产的P7080L，其具备的5’-3’聚合酶活性可以补平5’粘性末端，其3’-5’外切酶活性可以切平3’粘性末端，具备更高的纯度，更好的活性保证末端异质的DNA片段能形成均一的平末端；
(2)使用Klenow(3’-5’exo-)代替Taq DNA聚合酶用于DNA末端加A尾，提高加A效率；Klenow(3’-5’exo-)采用Enzymatics Inc.产的P7010-HC-L，其为经改造而缺乏3’-5’外切酶活性和5’-3’切口平移核酸酶活性的常温DNA聚合酶，可以在平末端DNA片段3’端加dA尾；
(3)使用超纯T4DNA连接酶用于DNA和接头之间的A/T连接，提高连接效率；超纯T4DNA连接酶采用Enzymatics Inc.产的L6030-HC-L，可以高效酶促连接5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，高效连接dT尾接头和dA尾的样品DNA片段，并修复样品DNA片段中的缺刻；
(4)使用高效高保真酶进行扩增；
上述每一步都在同一个PCR管中进行，均使用AMpure磁珠通过携珠法(with-beads)纯化回收每一步产物，减少样本换管损耗。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
针对微量DNA样本，本方法建库效率提升，样本建库转化效率＞10％。
附图说明
图1为本发明的血浆游离DNA样品2100生物分析仪分析结果示意图。
图2为本发明的以血浆游离DNA为样品所构文库2100生物分析仪分析结果。
具体实施方式
下面以1-100ng片段化DNA(如超声打断的DNA片段、酶消化的DNA片段、血浆游离DNA片段等)为样本，用于构建文库检测分析以此来详细说明本发明。
用于微量DNA高效建库的方法，包括如下步骤：
1.ER(End Repair)末端补平：按浓度吸取35ng血浆游离DNA(附图一，血浆游离DNA是以170bp片段为主和340bp片段为次的，游离于血液循环系统的天然片段化DNA)于200ul PCR管中，用PCR级水补齐至43ul，加入5ul 10xER缓冲液(500mM NaCl、100mM Tris-HCl、100mM MgCl2、10mM DTT，pH 7.9@25℃)，加入2ul T4 DNA聚合酶，漩涡震荡3秒混匀，旋转离心3秒将溶液聚集于管底，于PCR仪中进行孵育反应，反应设置如表一：
表一：DNA平末端化反应设置
2.AT(dA tailing)加dA尾：于上述反应产物中加入0.5ul dATP(10mM)和2ul Klenow(exo-)，漩涡震荡混匀3秒，旋转离心3秒，于PCR仪中开始孵育反应，反应条件见表二：
表二：DNA片段加dA尾反应设置
3.ER-AT后纯化：于上述反应中加入1.8x(94.5ul)AmPure磁珠，按纯化步骤纯化DNA片段，并用20ul洗脱DNA片段(保留磁珠)；
4.Ligation样品DNA片段-接头连接：于上述洗脱产物中加入3ul 10x连接缓冲液(500mM Tris-HCl、100mM MgCl2、50mM DTT、10mM ATP，pH 7.6@25℃)，按比例加入接头量和1.5ul超纯连接酶，用PCR级水补齐至30ul，漩涡震荡混匀3秒，旋转离心3秒，于PCR仪中开始孵育反应，反应条件见表三：
表三：样品DNA片段-接头连接反应设置
5.连接后纯化一：于上述反应中加入1.0x(24ul)PEG/NaCl，按纯化步骤纯化DNA片段，并用30ul洗脱DNA片段(保留磁珠)；
6.连接后纯化二：于上述反应中加入1.0x(24ul)PEG/NaCl，按纯化步骤纯化DNA片段，并用20ul洗脱DNA片段(保留磁珠)；
7.PCR扩增DNA片段：于上述洗脱产物中加入5ul引物(Illumina P5/P7通用引物)和25ul 2xKAPA热启动高保真聚合酶预混液，漩涡震荡混匀3秒，旋转离心3秒，进行PCR反应，反应条件见表四：
表四：
8.PCR后纯：于上述反应中加入1.0x(24ul)PEG/NaCl，按纯化步骤纯化DNA片段，并用30ul洗脱DNA片段，文库构建完成；
9.取1ul上述文库用于TBS-380荧光计检测浓度和2100生物分析仪分析文库质量，其余保存于-20℃备用。使用picogreen荧光染料于TBS-380荧光计检测出文库总量为480ng，根据2100生物芯片分析结果显示文库质量良好，根据此结果显示本建库方法的转化效率为：12.1％。
本技术方法中建库效率计算公式为：
其中n为PCR扩增循环数，本例中的具体计算为：
