嗜铬细胞致病基因二代测序建库用PCR引物及建库方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种嗜铬细胞致病基因二代测序建库用PCR引物及建库方法。
背景技术
DNA测序已经成为生物学研究中不可缺少的一项重要技术，从根本上改变了人们研究生命蓝图的方式。随着测序平台硬件及相应软件的优化，阻碍研究进展的亦非测序技术本身而是与其相关的文库构建以及数据的分析和解释。
454 Life Sciences公司(Roche)首先推出了革命性的基于焦酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。二代测序又叫高通量测序技术，基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学研究方面都有着广泛的应用。
二代测序的检测流程简单分为建库和测序两部分组成。对于建库部分，现有的方法分为PCR扩增和probe探针两种。无论对于现有的PCR扩增，还是probe探针，目前主要由国外的生产厂家所霸占，如果要做相关的实验，必须提供要做的基因给相应的公司，例如：life technology，illumina等国外公司，然后这些国外公司设计合成好相应的试剂之后，再卖给国内厂家，极大制约了国内相关技术的开发和研究的开展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嗜铬细胞致病基因二代测序建库用PCR引物及建库方法；具体为嗜铬细胞瘤7个致病基因(SDHB,SDHC,SDHD,MAX,VHL,TMEM127,RET)的基因检测自行设计用于二代测序中的建库方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种用于嗜铬细胞致病基因二代测序建库的PCR引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:70所示的核苷酸。
优选的，所述嗜铬细胞致病基因为SDHB、SDHC、SDHD、MAX、VHL、TMEM127、RET。
优选的，与SDHB基因相对应的PCR引物由8组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:1的E1-F和序列号为SEQ ID NO:1的E1-R，序列号为SEQ ID NO:3的E2-F和序列号为SEQ ID NO:4的E2-R，序列号为SEQ ID NO:5的E3-F和序列号为SEQ ID NO:6的E3-R，序列号为SEQ ID NO:7的E4-F和序列号为SEQ ID NO:8的E4-R，序列号为SEQ ID NO:9的E5-F和序列号为SEQ ID NO:10的E5-R，序列号为SEQ ID NO:11的E6-F和序列号为SEQ ID NO:12的E6-R，序列号为SEQ ID NO:13的E7-F和序列号为SEQ ID NO:14的E7-R，以及序列号为SEQ ID NO:15的E8-F和序列号为SEQ ID NO:16的E8-R。
优选的，与SDHC基因相对应的PCR引物由6组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:17的E1-F和序列号为SEQ ID NO:18的E1-R，序列号为SEQ ID NO:19的E2-F和序列号为SEQ ID NO:20的E2-R，序列号为SEQ ID NO:21的E3-F和序列号为SEQ ID NO:22的E3-R，序列号为SEQ ID NO:23的E4-F和序列号为SEQ ID NO:24的E4-R，序列号为SEQ ID NO:25的E5-F和序列号为SEQ ID NO:26的E5-R，以及序列号为SEQ ID NO:27的E6-F和序列号为SEQ ID NO:28的E6-R。
优选的，与SDHD基因相对应的PCR引物由4组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:29的E1-F和序列号为SEQ ID NO:30的E1-R，序列号为SEQ ID NO:31的E2-F和序列号为SEQ ID NO:32的E2-R，序列号为SEQ ID NO:33的E3-F和序列号为SEQ ID NO:34的E3-R，以及序列号为SEQ ID NO:35的E4-F和序列号为SEQ ID NO:36的E4-R。
优选的，与VHL基因相对应的PCR引物由4组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:37的E1-1F和序列号为SEQ ID NO:38的E1-1R，序列号为SEQ ID NO:39的E1-2F和序列号为SEQ ID NO:40的E1-2R，序列号为SEQ ID NO:41的E2-F和序列号为SEQ ID NO:42的E2-R，以及序列号为SEQ ID NO:43的E3-F和序列号为SEQ ID NO:44的E3-R。
优选的，与MAX基因相对应的PCR引物由5组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:45的E1-F和序列号为SEQ ID NO:46的E1-R，序列号为SEQ ID NO:47的E2-F和序列号为SEQ ID NO:48的E2-R，序列号为SEQ ID NO:49的E3-F和序列号为SEQ ID NO:50的E3-R，序列号为SEQ ID NO:51的E4-F和序列号为SEQ ID NO:52的E4-R，序列号为SEQ ID NO:53的E5-F和序列号为SEQ ID NO:54的E5-R。
优选的，与TMEM127基因相对应的PCR引物由4组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:55的E1-F和序列号为SEQ ID NO:56的E1-R，序列号为SEQ ID NO:57的E2-F和序列号为SEQ ID NO:58的E2-R，序列号为SEQ ID NO:59的E3-1F和序列号为SEQ ID NO:60的E3-1R，序列号为SEQ ID NO:61的E3-2F和序列号为SEQ ID NO:62的E3-2R。
优选的，与RET基因相对应的PCR引物由4组引物对组成，分别是序列号为SEQ ID NO:63的E10-F和序列号为SEQ ID NO:64的E10-R，序列号为SEQ ID NO:65的E11-634-F和序列号为SEQ ID NO:66的E11-634-R，序列号为SEQ ID NO:67的E15-F和序列号为SEQ ID NO:68的E15-R，序列号为SEQ ID NO:69的E16-F和序列号为SEQ ID NO:70的E16-R。需要说明的是，其他6个基因都是全部检测，RET基因只是检测了10,15,16号外显子，还有11号外显子上的634位点。
第二方面，本发明涉及一种嗜铬细胞致病基因二代测序建库的试剂盒，包括有：针对不同样品的不同引物组，每组引物组中包含至少一对PCR引物对；所述PCR引物对选自前述与SDHB、SDHC、SDHD、MAX、VHL、TMEM127、RET基因相对应的PCR引物。
第三方面，本发明还涉及一种嗜铬细胞致病基因二代测序的建库方法，所述方法包括如下步骤：
S1、利用提取的人基因组DNA作为模板，采用前述的试剂盒中的引物作为引物的特异扩增部分进行第一轮PCR扩增；(真正引物还有后面的tag部分)
S2、将第一轮PCR产物，稀释100～1000倍，作为第二轮PCR扩增的模板；
S3、第二轮PCR扩增利用第一轮PCR扩增的通用引物再进行一轮PCR扩增，同时加上测序机器需要的index、特异引物识别区用于测序机器识别的碱基序列；
S4、第二轮PCR测序产物经过核酸纯化后，即可上机检测。
优选的，步骤S1中，所述PCR扩增的反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物终浓度为各0.2mM，各引物0.1～0.5μM，模板DNA 10～100ng，聚合酶0.5～2u，最后加双蒸水至50μl。
优选的，步骤S1中，所述PCR扩增的条件为：95℃预变性5～10min，95℃变性15～30s、56～64℃退火15～60s、72℃延伸15～60s，其中变性、退火至延伸共20～35个循环。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、自行设计，成本极低(对比购买国外试剂盒)；
2、美国公司Life Technologies Corporation提供的关于ampliseq方法的说明书中明确：平均插入8kb片段大小，77个扩增子，达到的覆盖率为98.7％，与之相比，本发明对应的是：10kb，35个扩增子，覆盖率是100％。可见，本发明的结果达到预期的效果，100％的扩增了目标区域，并且均一性也非常好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例涉及一种嗜铬细胞致病基因二代测序的建库方法，包括如下步骤：
1.利用提取的人基因组DNA作为模板进行PCR扩增
2.PCR扩增的条件和引物如下：
反应体系(以50ul为例)：
PCR反应条件：95℃预变性5～10min，95℃变性15～30s、56～64℃退火15～60s、72℃延伸15～60s，其中变性、退火至延伸共20～35个循环。
上述10×扩增缓冲液的配方可选用：100mM Tris-HCl,pH 8.3at 25℃、500mM KCl、25mM MgCl2、10mM EDTA、1mM Tween20。
引物序列见表1：
表1
3.回收扩增的PCR片段，进行测序建库。
上述步骤1、2完成了第一轮PCR扩增(本发明的特异引物+5’端通用引物扩增)；该步骤3具体包括以下步骤：
3.1将上述第一轮PCR产物，经过稀释，100-1000倍，作为第二轮扩增的模板；
3.2第二轮扩增利用第一轮扩增的通用引物再进行一轮PCR扩增，同时加上测序机器需要的index，特异引物识别区等用于测序机器识别的碱基序列；
3.3第二轮测序产物经过一般的核酸纯化后，就可以上机检测了。
实验结果如表2所示，
表2
本发明经过系统的研究和不断的实验摸索，已经完成该7个基因的建库方法体系工作，并且经过上海生工生物工程有限公司对建库方法进行检测后的数据显示，结果达到预期的效果，100％的扩增了目标区域，并且均一性也非常好。
