一种辣椒抗病基因鉴定方法
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种辣椒抗疫病基因鉴定方法。
背景技术
辣椒疫病在我国于20世纪50年代发现以来，已在全国各省普遍发生危害，使辣椒产量和品质降低，严重时导致植株死亡绝产。而防御辣椒疫病最根本的办法是培育出抗疫病辣椒品种，在育种和生产过程中，最常见的鉴定辣椒抗疫病性能的方法是对田间种植辣椒进行模拟疫菌毒素的接种试验，观察被检测辣椒的发病或抗病情况，但这种传统田间鉴定方法耗费时间较长，而且受田间土壤、气候环境因素和人为经验影响较大，鉴定结果容易出现随机性，导致准确率不高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷或不足，创建一种辣椒抗疫病基因鉴定新方法。
一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，包括以下步骤：
S1：供试抗疫病辣椒品种和幼苗的准备。搜集不同产地抗疫病共20个品种的辣椒种子，选取每种辣椒种子100粒，然后播种于温室盘钵中进行育苗（20～30℃），待生长至3～4片幼叶时，将其移栽至营养盆中继续进行培养，待再生长至7～8片叶片时即获得辣椒壮苗材料；
S2：供试疫病菌株的收集和荧光素标记毒素的制备。辣椒疫病菌株由淮安市农科院辣椒课题组馈赠，将荧光素与所述疫病菌株在培养皿中共浸染40min，然后于25℃光照培养5～6 d后即获得含有荧光标记毒素作接种用的疫病菌株；
S3：用带荧光标记毒素的疫菌离体接种辣椒叶片。从培育的20个品种辣椒幼苗中，每个品种选取10株壮苗，采用离体叶片全叶接种法接种含有荧光标记毒素的疫菌（浸菌处理24h），PBS漂洗残余菌液，然后将接种后的辣椒叶片在培养基上培养10d，每品种幼苗设置3个重复实验组；
S4：辣椒抗疫病基因数据库的构建。将上述接种带有荧光标记的毒素并培养10d后的供试辣椒，取叶片提取DNA，琼脂糖凝胶电泳质量检测后并进行测序，获得抗疫病辣椒DNA片段数据库，同时根据上述辣椒品种在荧光显微镜下抗疫菌毒素荧光标记与辣椒抗疫病表现型鉴定结果，通过关联分析法确立辣椒抗疫病毒素荧光标记鉴定与辣椒抗疫病基因片段之间对应关系，将荧光显示抗疫病辣椒品种中所获得的抗疫病相关基因片段登记入Genbank数据库上，从而建成辣椒抗疫病基因数据库；
S5：待检辣椒抗疫病基因的鉴定。提取待检测辣椒植株叶片DNA并委托公司进行测序，然后与S4步骤中建立的辣椒抗疫病基因数据库，在Genbank上通过Blast软件进行DNA序列比对分析，若出现匹配片段，则表明待检辣椒植株含有抗疫病基因即为抗疫病辣椒品种。该鉴定结果准确可靠，简便直观，灵敏快捷。
优选的，所述荧光标记毒素的制备方法为将荧光素与所获得的疫病菌株共浸染40min，于25℃光照培养5～6 d后即得含荧光标记毒素用于接种的疫病菌株。
优选的，所述离体叶片全叶接种法是指取辣椒幼苗生长至7～8片叶龄一致的生长良好完整幼叶，用无菌水进行清洗，并将表面水吸干，将叶片正面朝上放入含有荧光标记毒素疫菌的培养皿中，于25℃，相对湿度为75%～85%的恒温箱中进行接种24h，并将接种后的叶片在辣椒培养基上培养10d，于第10d记录统计发病情况，同时在荧光显微镜下观察叶片荧光标记现象的有无及强弱，从而建立通过观察毒素荧光标记确定辣椒品种抗疫病性结果的一种快速灵敏鉴定方法。
优选的，所述辣椒抗疫病基因数据库的建立与待检辣椒抗疫病基因鉴定方法，是根据所述S3鉴定结果，通过将辣椒抗疫病植株DNA提取和测序后片段信息登记入Genbank数据库，即建立辣椒抗疫病DNA数据库，将待检辣椒品种叶片提取DNA并测序后,与Genbank上辣椒抗疫病基因数据库运用Blast软件进行序列比对分析，若找到抗疫病基因匹配片段则表明该辣椒植株或品种含有抗疫病基因即具有抗疫病性能，并将鉴定结果反馈给电脑客户端查询者，简便快捷。
本发明建立的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，关键在于建立好辣椒抗疫病基因数据库，在判断待检辣椒品种是否含有抗疫病基因时，仅需对被检辣椒叶片进行DNA提取与测序，并将被检辣椒DNA序列与所建辣椒抗疫病基因数据库进行Blast搜索比对，看是否与抗疫病DNA片段出现匹配，即可得知被检辣椒是否含有抗疫病基因和具有抗疫病性能。该鉴定方法结果准确、可靠、直观，操作简便，整个过程所需时间短，人力和物力耗费较少，而且对环境友好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明提出的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，包括以下步骤：
S1：供试抗疫病辣椒品种和幼苗的准备。搜集不同产地抗疫病共20个品种辣椒种子，选取每种辣椒种子100粒，然后播种于温室盆钵中进行育苗（20～30℃），待生长至3～4片幼叶时，将其移栽至营养盆中继续进行培养，待再生长至7～8片叶片时即获得辣椒壮苗材料；
S2：供试菌种的准备，即带有荧光标记毒素用于接种的疫菌准备。将荧光素与疫病菌株在培养皿中共浸染40min，然后于25℃光照培养5～6 d后即获得含有荧光标记毒素作接种用的疫病菌株；
S3：用带荧光标记毒素的疫菌离体接种辣椒叶片。从培育的20个品种辣椒幼苗中，每个品种选取10株壮苗，采用离体叶片全叶接种法接种含有荧光标记毒素的疫菌（浸菌处理24h），漂洗残余菌液，然后将接种后的辣椒叶片在培养基上培养10 d，每品种幼苗设置3个重复实验组；
S4：辣椒抗疫病基因数据库的构建。将上述接种带有荧光标记毒素并培养10 d后的供试辣椒，取叶片提取DNA，琼脂糖凝胶电泳质量检测后并进行测序，获得抗疫病辣椒DNA片段数据库，同时根据上述辣椒品种在荧光显微镜下抗疫菌毒素荧光标记与辣椒抗疫病表现型鉴定结果，通过关联分析法确立辣椒抗疫病毒素荧光标记鉴定与辣椒抗疫病基因片段之间对应关系，将荧光显示抗疫病辣椒品种所获得的抗疫病相关基因片段登记入Genbank数据库上，从而建成辣椒抗疫病基因数据库；
S5：待检辣椒抗疫病基因的鉴定。提取待检测辣椒植株叶片DNA并委托公司进行测序，然后与S4步骤中建立的辣椒抗疫病基因数据库，在Genbank上通过Blast软件进行DNA序列比对分析，若出现匹配片段，则表明待检辣椒植株含有抗疫病基因即为抗疫病辣椒品种。该鉴定结果准确可靠，简便直观，灵敏快捷。
本发明中，所述荧光标记的毒素的制备方法为将荧光素与所获得的疫病菌株共浸染40min，于25℃光照培养5～6 d后即得含荧光标记毒素用于接种的疫病菌株。
本发明中，所述离体叶片全叶接种法是指取辣椒幼苗生长至7～8片叶龄一致的生长良好完整叶片，用无菌水进行清洗，并将表面水吸干，将叶片正面朝上放入含有荧光标记毒素疫菌的培养皿中，于25℃，相对湿度为75%～85%的恒温箱中进行接种24h，并将接种后的叶片在辣椒培养基上培养10d，于第10d记录统计发病情况，同时在荧光显微镜下观察叶片荧光标记现象的有无及强弱，从而建立通过观察毒素荧光标记确定辣椒品种抗疫病性结果的一种快速灵敏鉴定方法。
本发明中，所述辣椒抗疫病基因数据库的建立与待检辣椒抗疫病基因鉴定方法，是通过将辣椒抗疫病植株DNA测序后片段信息登记入Genbank数据库，即建立辣椒抗疫病DNA数据库，将待检辣椒品种叶片提取DNA并测序后,与Genbank上辣椒抗疫病基因数据库进行Blast比对分析，若找到抗疫病DNA匹配片段则表明该辣椒植株或品种是含有抗疫病基因的即具有抗疫病性能，然后将鉴定结果反馈给电脑客户端查询者，简便快捷。
本发明建立的一种辣椒抗疫病基因鉴定方法，关键在于建立好辣椒抗疫病基因数据库，在判断待检辣椒品种是否含有抗疫病基因时，仅需对被测辣椒幼叶进行DNA提取与测序，并将被检辣椒DNA片段与辣椒抗疫病基因数据库进行Blast搜索比对，看是否与抗疫病DNA片段发生匹配，即可得知被检辣椒是否含有抗疫病基因和具有抗疫病性能。该鉴定方法结果准确、可靠、直观，操作简便，整个过程所需时间短，人力和物力耗费较少，而且对环境友好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
