一种糖基化检测的人凝集素/类人凝集素芯片及制备方法
技术领域
本发明涉及生物科学领域，特别涉及一种糖基化检测的人凝集素/类人凝集素芯片及制备方法，该芯片可通过其上的人凝集素/类人凝集素蛋白与糖基或糖结构特异性识别和结合，来分析生物样本的糖基化情况及糖基化水平的变化。
背景技术
糖基化是生物体中最重要的翻译后修饰，50％以上的蛋白质存在糖基化修饰。糖基化在蛋白质折叠，细胞生长、分裂、分化中起关键作用，能够作为受体识别细胞外信号，也能够激活生物体中的免疫反应等等。一些生理病理过程也与糖基化密切相关，例如，精子细胞表面的糖能够影响精子的运动及受精能力，癌细胞表面的唾液酸增加能够促进癌细胞的迁移。
与无脊椎动物相比，脊椎动物的糖谱更加复杂。了解人体中糖基的组成，结构以及发生的改变能够使我们更好的了解糖基化的功能以及它们在疾病中起的作用，进而指导疾病的诊断和治疗。传统的糖基化分析方法主要有液相色谱、质谱等技术，但是这些方法人力物力消耗大，并且无法进行快速、系统、实时的糖基化分析。
作为一种高通量的糖基化分析检测平台，凭借其独特的优势，如体积小、通量高、分析检测速度快、样品需求量少等，植物凝集素芯片已被广泛的应用于原核、真核微生物糖基化的分析，精子细胞表面糖基化的研究以及癌细胞表面糖基化的鉴定等等。植物凝集素芯片可以很好的解析样品的糖型结构及糖基化水平或糖链结构的改变，但是植物凝集素芯片有时无法解析哺乳动物，尤其是人体中的复杂糖型。
人体中也存在一类凝集素或类凝集素蛋白质，大多数是整合在细胞膜上的跨膜蛋白质，也有部分是可溶性蛋白质和分泌蛋白质。人凝集素蛋白在调节人体内细胞的黏附，糖蛋白的合成以及控制血液中蛋白的水平中起着关键作用，作为一种内源性的蛋白质，人凝集素或类凝集素能够更特异的识别人体中的复杂糖链，并且它们之间的结合力更强。因此，与植物凝集素芯片比较，人凝集素芯片能够更好的帮助我们对人体生理或病理情况下的糖组学进行研究。
因大部分人凝集素或类人凝集素为膜蛋白，具有重组表达量少，分离纯化效率低、易失活等缺点，阻碍了其研究进程。目前未见有人凝集素芯片的报道。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，为了弥补质谱等技术在蛋白质糖基化研究领域的不足，强化凝集素芯片的优势，本发明的目的在于构建一种糖基化检测的人凝集素类人凝集素芯片及制备方法，该芯片包含60种人凝集素/类人凝集素蛋白质，芯片质检及人凝集素活性验证表明，该人凝集素芯片可用于生物样本的糖基化分析。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种糖基化检测芯片，所述芯片上的糖基化检测蛋白为人凝集素/类人凝集素蛋白质。
优选地，所述人凝集素/类人凝集素蛋白质的种类数为60种；其中，所述60种人凝集素/类人凝集素蛋白质的基因名称分别为B3GNT3，CD207，SELE，CHODL，CLEC1A，CLEC1B，CLEC2B，CLEC2Dv1，SELL，CLEC2Dv2，SELPLG，CLEC3A，CLEC3B，CLEC4A，CLEC4D，CLEC4E，CLEC5A，SIGLEC12，CLECSF12，CLEC7Av6，SIGLEC6，CLEC7A，CLEC9A，COLEC10，COLEC11v1，DAD1，FCN1，FCN2，FCN3，GALNT4，GALNT6，GALNT9vB，HSPC159，KLRC1v1，KLRC1v2，KLRF1，SIGLEC8，KLRG1，KLRK1，OLR1，LAMP1，LAMP2，LGALS1，LGALS12，LGALS13，LGALS14，LGALS14V2，LGALS2，MASP2v2，MASP2v1，LGALS7，LGALS8，LGALS8v2/3，LMAN1，LMAN2，LMAN2L，MAG，MASP1v3，MASP1，REG3A。
优选地，所述人凝集素/类人凝集素蛋白质的制备具体为：将连接有所述蛋白基因序列的克隆质粒转入酿酒酵母过表达、通过融合标签亲和纯化即可得到。所述纯化的重组蛋白质是浓度大于或等于10μg/mL。
优选地，所述芯片包括若干矩阵，每个矩阵中包括所述人凝集素/类人凝集素蛋白质及对照。
优选地，所述矩阵中，每种人凝集素/类人凝集素蛋白质、对照设置3个重复点。
进一步优选地，所述矩阵的数量为12个，所述对照包括阳性对照、阴性对照、空白对照。具体到本发明，所述阳性对照为荧光的ConA，所述阴性对照包括谷胱甘肽S转移酶、BSA；所述空白对照包括洗脱缓冲液、点样缓冲液。可形成12个检测窗，可同时检测12个样品。
由本发明的一个实施例可知，每个矩阵包含60个人凝集素和类人凝集素蛋白质，1个谷胱甘肽S转移酶和1个BSA作为阴性对照，1个带荧光的ConA作为阳性对照，洗脱缓冲液和点样缓冲液作为空白对照。
优选地，所述矩阵上，每个人凝集素/类人凝集素蛋白质点样点的点样量约0.3-0.5nL。
优选地，所述芯片上的点样点是采取生物芯片点样仪点样于芯片基片上的。
第二方面，本发明提供一种所述糖基化检测芯片的制备方法，具体包括：将所述人凝集素/类人凝集素蛋白质及对照点样于芯片基片上，即可。
优选地，所述制备方法还包括对所得芯片进行质检、活性验证的步骤。
第三方面，本发明还提供一种所述糖基化检测芯片的活性验证方法，具体包括：将DyLight 550NHS Ester荧光标记的THP-1细胞裂解液、DyLight 550NHS Ester荧光标记的去除N-连接糖基化THP-1细胞裂解液与封闭的所述糖基化检测芯片孵育反应，洗涤、干燥后GenePixTM4200A扫描仪观察，芯片上的人凝集素/类人凝集素与所述细胞裂解液结合且信噪比达到4以上的，或者芯片上的人凝集素/类人凝集素能够跟细胞结合的，即证明有活性。
优选地，所述封闭采用BSA；所述孵育反应的时间为2h；所述洗涤具体包括：PBST洗涤3次，每次5min；超纯水清洗1次，1min；所述干燥的方式为甩干。
但是，芯片上不跟细胞裂解液结合，也不跟细胞结合的人凝集素蛋白也不认为没有生物活性，因为用此种方法没办法做到逐一的确定每一种人凝集素的活性，只能进行全局性的验证。
通过细胞裂解液与芯片孵育，确定人凝集素芯片上面大部分人凝集素和类人凝集素蛋白质均有生物学活性。通过去N-连接糖基化酶PNGase F处理过的细胞裂解液与芯片孵育，确定芯片上的人凝集素或类人凝集素可识别和结合细胞裂解液中的N-连接糖链。
通过不同细胞系与芯片孵育，确定不同的细胞系有不同的人凝集素芯片结合谱，说明细胞表面的糖型存在差别。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明构建的人凝集素芯片，经验证其上的人凝集素和类人凝集素具有良好的生物学活性，并且具有识别和结合哺乳动物复杂糖链的特性。本发明构建的人凝集素芯片继承了植物凝集素芯片的优势，能够分析复杂样本的糖基化，如细胞裂解液；能够实时对活细胞表面的糖基化进行分析；还能够实现同时12个样本的检测。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为人凝集素/类人凝集素蛋白质芯片制备流程图；
图2为所纯化的人凝集素和类人凝集素蛋白的银染结果，其中★表示目标蛋白质所在的位置；
图3为所制备人凝集素蛋白质芯片的质检结果；
其中，A是人凝集素芯片的扫描结果图和芯片点制模式图；B是人凝集素芯片的信号强度统计结果。
图4为芯片上人凝集素和类人凝集素蛋白质的活性验证结果；
其中，A是用或不用PNGaseF处理的细胞裂解液与人凝集素芯片孵育后的对比结果；B是芯片信号的定量结果。
图5为三种细胞系与人凝集素芯片孵育后的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本实施例提供一种人凝集素/类人凝集素蛋白质芯片及活性验证方法，芯片的构建流程见图1。以下为整个流程的详细流程及参数：
1、获得人凝集素和类人凝集素蛋白质的酵母表达库
60种人凝集素和类人凝集素的入门克隆库来源于约翰霍普金斯大学的朱衡教授。
测序正确后，通过Gateway系统的LR反应，将人凝集素和类人凝集素入门克隆的编码序列连接到目的载体pEGH-A上，构建出表达克隆质粒。
最后将所述表达克隆质粒转入酿酒酵母Y258的感受态细胞中，得到人凝集素和类人凝集素蛋白质的酵母表达库。
2、人凝集素和类人凝集素蛋白质的表达和纯化
a.表达人凝集素和类人凝集素蛋白质：挑取单菌落在1mL SC-URA/Dextrose(含葡萄糖缺尿嘧啶的完全合成培养基)培养基中培养至OD600(波长600nm时的吸光值)达到3.0，按1：2000的比例接种到120mL SC-URA/Raffinose(含棉籽糖缺尿嘧啶的完全合成培养基)培养基中培养至OD600值为0.6-0.8。加入13mL 20％的半乳糖(过滤除菌)培养4-6个小时后，收菌，保存于-80℃冰箱中。
b.纯化人凝集素和类人凝集素蛋白质：于-80℃冰箱里取出所述收集的菌，加入氧化锆珠和裂解缓冲液，4℃环境中震荡30s，后置冰上2min，重复4次；将4次得到的细胞裂解液集中到15ml离心管中，加入适量的还原型谷胱甘肽琼脂糖珠，补充裂解缓冲液到12ml，4℃孵育2小时后，离心去掉上清。将琼脂糖珠用清洗缓冲液1和2分别洗3次后，用1.5ml洗脱缓冲液与琼脂糖珠孵育15min，离心收集上清。然后用Millipore的超滤管4℃，6000rpm离心使体积浓缩至大约20-40μL，取4μL与1μL 5×的上样缓冲液混匀后，进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳)电泳，电泳结束后，用碧云天的印染试剂盒进行银染。银染定量的结果如图2所示，纯化出来的重组蛋白质浓度均大于等于10μg/mL。
c.保存人凝集素和类人凝集素蛋白质：纯化好的60种蛋白质按其体积，各加入30％的甘油，并保存于-80℃冰箱中。
3、制备人凝集素芯片
a.将每一蛋白质取出10μL，转移至384孔板中。同时，添加阳性对照(荧光标记的ConA：刀豆蛋白)、阴性对照(GST：谷胱甘肽S转移酶，BSA：牛血清蛋白)、洗脱缓冲液和点样缓冲液均作为空白对照(Elution buffer：洗脱缓冲液、Printing Buffer：点样缓冲液)。在冷库中，使用晶芯SmartArrayer 48微阵列芯片点样系统，在湿度45-50％条件下，按照图3A的模式，将蛋白质点制于高分子三维基片H表面，每张芯片有12个子阵列，每个阵列有65种样品(其中，包括60种人凝集素和类人凝集素蛋白质，5种对照)，每一样品有3个重复点。4℃，过夜固定蛋白质，即完成蛋白质芯片构建。保存于-80℃，待用。
b.质检
封闭：取0.15g牛血清蛋白溶于5mL TBST中作为封闭液，将芯片室温封闭1h，50rpm。
孵育一抗：按照1:1000的体积比，使用TBST稀释兔抗GST抗体。室温孵育1h，50rpm。使用TBST洗涤3次，每次5min。
孵育二抗：按照1:1000的体积比，使用TBST稀释Cy5偶联的羊抗兔抗体。室温孵育1h，50rpm。使用TBST洗涤3次，每次5min。使用超纯水清洗1min后，在SliderWasherTM8上甩干后，使用GenePixTM4200A扫描仪，扫描并记录结果。结果如图3A所示，其中人凝集素蛋白质信号强度的统计结果见图3B。
c.蛋白质活性验证
用裂解缓冲液NP-40处理THP-1细胞，将得到的细胞裂解液分成两份，一份直接用DyLight 550NHS Ester进行荧光标记，另一份用PNGaseF去除N-连接糖基化后，再用DyLight 550NHS Ester进行荧光标记。用脱盐柱去除多余的荧光染料后，将两份细胞裂解液同时跟BSA封闭好的人凝集素芯片孵育反应2小时，用PBST洗涤3次，每次5min。使用超纯水清洗1min后，在SliderWasherTM8上甩干后，使用GenePixTM4200A扫描仪，扫描并记录结果。两份样品的芯片结果如图4A所示，其中信号强度的统计结果见图4B。取信噪比大于等于4的值。由图4A可知，多数人凝集素可与THP-1细胞裂解液结合，当用PNGaseF去除THP-1细胞裂解液的N-连接糖基化后，裂解液与人凝集素芯片的结合谱发生变化；由图4B可知26个人凝集素与细胞裂解液有结合，去掉N-糖基的细胞裂解液与人凝集素结合的信号几乎都变弱。
收集三种培养的细胞(293T，MDA-MB-231和Yeast)，用CellTrackerTM Orange CMRA进行活细胞的荧光标记，每个检测窗加入1×106个细胞，室温孵育1小时后，手持芯片在PBST中进行清洗，室温避光晾干芯片后，使用GenePixTM4200A扫描仪，扫描并记录结果。三种细胞与人凝集素芯片的结合情况见图5。由图5可知不同的细胞与人凝集素芯片的结合谱不同，统计三种细胞系与凝集素芯片的结合情况，至少有30种人凝集素蛋白是有活性的。
上述实施例中，所有溶液的配方：(以下溶液的溶剂均为去离子水)
(1)SC-URA/葡萄糖培养基：YNB 1.7g，(NH4)2SO45g，URAmix 2g，葡萄糖20g，添加ddH2O至1L，121℃灭菌15min。
(2)SC-URA/Raffinose培养基：YNB 1.7g，(NH4)2SO45g，URAmix 2g，Raffinose20g，添加ddH2O至1L，121℃灭菌15min。
(3)裂解缓冲液pH 7.5(1L)
(4)清洗缓冲液1pH 7.5(1L)
(5)清洗缓冲液2pH 7.5(1L)
(6)洗脱缓冲液pH 7.5(1L)
(7)10×TBS缓冲液pH 7.4(1L)
(8)1×TBST缓冲液(1L)
10×TBS缓冲液100mL
吐温20 1mL
ddH2O定容到1L
(9)10×PBS缓冲液(1L)：
(10)1×PBST缓冲液(1L)
10×PBS缓冲液 100mL
吐温201mL
ddH2O 定容到1L
(11)5×SDS-PAGE电泳缓冲液(1L)：
三羟甲基氨基甲烷0.125M
甘氨酸0.96M
SDS 0.5％
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
