肠道菌群在儿童反复呼吸道感染诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及肠道菌群在儿童反复呼吸道感染中的应用。
背景技术
反复呼吸道感染(recurrent respiratory tract infections，RRTI)是一种重要的临床疾病，尤其是儿科，表现为常见和多发。RRTI的临床特点为上、下呼吸道感染反复发作，且患儿感染持续时间较正常儿童长，一旦治疗不及时，则迅速蔓延，加重病情。一些患儿每月发作数次，一些患儿病程达几年之久。本病病情反复，迁延难愈，可导致多种并发症。
近年来其发病率呈逐年上升趋势，RRTI约占呼吸道感染的病例中的10-20％。根据世界卫生组织统计，RRTI是5岁以下儿童死亡的主要原因。在东南亚和非洲等高死亡率的国家，RRTI的死亡率达到了23％，涉及到二百万人；在发达国家中，该病占医生访问的20％，其治疗消耗了全球75％的抗生素。目前，RRT的的发病机制尚不明确。其发病被认为与多种因素相关，包括免疫功能、营养状况、环境因素、致病微生物、先天性疾病、遗传因素、精神因素及慢性疾病等。
人体肠道中的微生物群落与宿主之间的关系极为密切，据研究，肠道菌群失调与多种临床疾病密切相关。除免疫功能和营养状况的原因，近年来，越来越多的研究表明肠道和或呼吸道菌群失调与呼吸系统疾病的发生息息相关。肠道菌群在儿童反复呼吸道感染的疾病过程中的作用并不明确，探究肠道菌群在RRTI疾病过程中的作用机制，寻找可用来进行儿童RRTI早期诊断的微生物标志物具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种早期诊断儿童反复呼吸道感染疾病的手段和产品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测样本中微生物的试剂在制备诊断儿童反复呼吸道感染疾病的产品中的应用，其特征在于，所述微生物为Fusicatenibacter。在儿童反复呼吸道感染疾病中，Fusicatenibacter的水平降低。
进一步，所述微生物还包括Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)中的一种或几种。其中，Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)在患者中水平降低，梭菌属(Clostridium)在患者中水平增加。
进一步，所述微生物为Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)。
进一步，所述试剂包括检测所述微生物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
进一步，所述特异性的引物是能够检测所述微生物16SrRNA的引物。
本发明提供了一种诊断儿童反复呼吸道感染疾病的产品，所述产品包括检测Fusicatenibacter丰度的试剂。
进一步，所述产品还包括检测Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)中至少一种微生物丰度的试剂。
进一步，所述试剂为检测所述微生物16SrRNA的引物。
本发明提供了一种诊断儿童反复呼吸道感染疾病的试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)16SrRNA的引物对。
进一步，所述试剂盒可以包含测试管或其他合适的容器、反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶等酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水等。
本发明提供一种诊断儿童反复呼吸道感染疾病的芯片，所述芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)16SrRNA。
在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为粪便。
术语“丰度差异”是指，与正常或对照用靶的体内水平相比，在患有儿童反复呼吸道感染疾病的患者体内得到更高或更低水平的微生物。从本发明的目的出发，将“丰度差异”视为从正常的或患有疾病的受试者中，或从患有疾病的受试者的各分期中的取得的微生物水平1.5倍或以上、约4倍或以上、约6倍或以上、约10倍或以上的差异时存在的现象。
在本发明中，术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。在本申请中，术语“16s rRNA”指构成原核生物核糖体的30S小亚单位的rRNA，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16SrRNA的序列，能够有效鉴定原核生物。
作为一个实施方式，在本发明中，上述引物可以用于扩增相应微生物中保留的16SrRNA的序列，扩增序列后，通过期望的产物的生成与否，能够检测出微生物的存在或测定微生物水平。利用引物的序列扩增方法可以使用本领域已知的多种多样的方法。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、降落(touchdown)PCR、热启动(hot start)PCR、巢式(nested)PCR、增效(booster)PCR、实时(real-time)PCR、差示PCR(differential display PCR：DD-PCR)、cDNA末端快速扩增(rapid amplificationof cDNA ends：RACE)、反向(inverse)聚合酶链式反应、载体介导(vectorette)PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR))、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制(self-sustainedsequence replication)、目标碱基序列的选择性扩增反应，但本发明的范围不限于此。
此外，在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA，enzyme linkedimmunosorbent asay)、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation assay)、补体结合分析法(ComplementFixation Assay)、荧光活化细胞分选器(FACS，Fluorescence activated cell sorter)、蛋白芯片(protein chip)等，上述方法只是对抗体-抗原免疫反应的说明，本发明不限于上述方法。
除此之外，可以将本领域广泛使用的分子免疫学方法用于本发明的检测微生物或测定微生物水平。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了菌群在儿童反复呼吸道感染疾病中的水平变化，通过检测菌群的变化，可以实现儿童反复呼吸道感染疾病的早期诊断，使用本发明的微生物标志物进行诊断，特异性高、敏感性强。
附图说明
图1是随机森林分析菌群在儿童反复呼吸道感染患者中的重要性图；
图2是相关菌群在儿童反复呼吸道感染患者中的ROC曲线图，图A～I分别是Fusicatenibacter、Butyricimonas、Roseburia、Clostridium、Enterococcus、Fusicatenibacter+Butyricimonas、Fusicatenibacter+Roseburia、Fusicatenibacter+Clostridium+Roseburia、Fusicatenibacter+Butyricimonas+Roseburia在儿童反复呼吸道感染患者中的ROC曲线图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与儿童反复呼吸道感染相关的肠道菌群
1、样本的采集
分别收集健康儿童和儿童反复呼吸道感染疾病患者的粪便各20例，将标本冰冻并保存在-80℃冰箱内。记录样本详细的临床信息，包括性别、年龄、上下呼吸道感染次数等，本研究经伦理委员会审核与批准，并获得患者及其监护人的知情同意。
2、16S rRNA测序
2.1 DNA的提取
使用粪便基因组DNA提取试剂盒自粪便标本中提取细菌DNA，操作步骤按说明书进行。
2.2 DNA样本纯度及浓度测定
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。
2.3 PCR扩增及产物纯化
采用TransGen AP221-02(TransStart Fastpfu DNA Polymerase)进行PCR扩增反应，全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。
2.4荧光定量
将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
2.5 Miseq文库构建
使用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit进行文库的构建，具体步骤按照说明书进行。
2.6 Miseq测序
以DNA片段为模板，PCR合成目标待测DNA片段，cBot上进行桥式PCR扩增，生成DNA簇，Hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。
3、数据分析
3.1数据预处理
使用FLASH、Trimmomatic等软件对Miseq测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤；使用Usearch软件进行聚类操作，将序列按照彼此的相似性归为许多OUT，采用RDP classifier贝叶斯算法在97％的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，并使用Silva数据库进行比对。
3.2肠道菌群物种差异分析
使用wilcox秩和检验对两组的不同水平上的物种水平进行检验，估算每个物种丰度对差异效果影响的大小。
3.3肠道菌群的随机森林分析
使用R包randomForest(随机森林)，输入各样本的分组信息，以及每个样本的属的丰度，设置决策树为500，分析属在疾病中的重要性。
4、结果
结果显示，与健康儿童相比，Fusicatenibacter、Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)的水平在儿童反复呼吸道感染患者中呈现显著性差异(P<0.05)，同时随机森林(如图1所示)也显示了上述相关菌群在疾病中起着重要的作用。
实施例2荧光定量PCR验证相关菌群
1、对上述菌群进行大样本QPCR验证，按照实施例1中的样本收集方式收集健康儿童和儿童反复呼吸道感染患者的粪便样本各60例。
2、粪便细菌DNA的提取与定量
使用粪便基因组DNA提取试剂盒自粪便标本中提取细菌DNA，操作步骤按说明书进行；
利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA测定所提粪便细菌总DNA浓度与纯度，并将所有样品DNA的质量浓度统一至100mg/L。
3、实时荧光定量PCR
1)引物设计与合成
根据细菌16SrRNA基因的V3-V4区序列，对Fusicatenibacter、Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)和肠球菌属(Enterococcus)设计特异性引物，并以16SrRNA通用引物作为参考基因，引物合成于上海生工生物工程有限公司。
2)QPCR扩增检验
配置20μl反应体系：模板DNA 2μl，FAST START UNIVERSAL SYBR GREEN MASTER(ROX)10μl，ddH2O 7μl，浓度为10μM待检测细菌的上下游引物各0.5μl；反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃2min，共35个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
3)ROC曲线分析
使用R语言中的pROC包分析Fusicatenibacter、Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。
4、相关菌群联合应用的ROC曲线分析
5、结果
结果显示，与健康人相比，儿童反复呼吸道感染患者中的Fusicatenibacter、Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)呈现显著性差异(P<0.05)，同16SrRNA测序结果一致。
相关菌群的ROC曲线如图2所示，Fusicatenibacter、Butyricimonas、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)的AUC值高于0.7。其中，Fusicatenibacter具有较高的特异性和敏感性，应用于儿童呼吸道反复感染疾病具有较高的准确性。
相关菌群的联合应用的AUC值如表1所示，Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)联合诊断相比单独应用具有较高的准确性。
表1相关菌群联合应用的AUC值
实施例3儿童反复呼吸道感染诊断试剂盒的制备
根据Fusicatenibacter、Roseburia与儿童反复呼吸道感染疾病的相关性，可以通过检测样本中Fusicatenibacter、Roseburia的丰度来诊断儿童反复呼吸道感染疾病，据此本发明提供了一种基于检测Fusicatenibacter、Roseburia丰度的诊断儿童反复呼吸道感染的试剂盒。试剂盒组分如下：DNA提取试剂、特异性检测Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)16SrRNA的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水、SYBR Green荧光染料。
实施例4儿童反复呼吸道感染诊断试剂盒的制备
根据Fusicatenibacter与儿童反复呼吸道感染疾病的相关性，可以通过检测样本中Fusicatenibacter的丰度来诊断儿童反复呼吸道感染疾病，据此本发明提供了一种基于检测Fusicatenibacter丰度的诊断儿童反复呼吸道感染的试剂盒。试剂盒组分如下：DNA提取试剂、特异性检测Fusicatenibacter和罗斯伯里氏菌属(Roseburia)16SrRNA的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水、SYBR Green荧光染料。
实施例5儿童反复呼吸道感染诊断试剂盒的制备
根据Fusicatenibacter、Roseburia、Butyricimonas与儿童反复呼吸道感染疾病的相关性，可以通过检测样本中Fusicatenibacter、Roseburia、Butyricimonas的丰度来诊断儿童反复呼吸道感染疾病，据此本发明提供了一种基于检测Fusicatenibacter、Roseburia、Butyricimonas丰度的诊断儿童反复呼吸道感染的试剂盒。试剂盒组分如下：DNA提取试剂、特异性检测Fusicatenibacter、Roseburia、Butyricimonas的16SrRNA的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水、SYBR Green荧光染料。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
