快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域中快速构建双元载体的方法，尤其涉及一种快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法。
背景技术
基于CRISPR/Cas9系统的便捷性和高效性，已经被成功用于真核生物和原核生物的基因组定点编辑，尤其是在植物和动物中。通过进一步地改善优化该系统，该系统已被成功用于基因转录调控、细胞追踪、荧光标记、表观修饰和单碱基突变等。在该系统用于基因突变、大片段删除和非编码基因功能研究的时候，往往需要同时表达两个sgRNA。要进行大规模应用的时候需要构建sgRNA的表达文库。之前的研究提出一种应用于人类细胞的快速构建配对sgRNA的Cas9的载体文库的方法。该方法首先需要合成一条还有两个sgRNA的110bp的DNA片段，然后用另外两条引物进行PCR，将得到的PCR产物连接到中间载体中，然后使用BbsI进行酶切，最后使用T4DNA连接酶将配对的sgRNA表达盒连接到含有Cas9的载体中。但目前为止没有用于植物的构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法。在进行蛋白互做研究筛选的时候，往往需要建立多基因之间两两组合的双突变体，这就需要建立一个多基因间的随机配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法，该方法快速、高效和价格低廉。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
在构建CRISPR-Cas9双元表达载体基础上，根据特定的基因设计靶标序列设计对应的正反引物，引物具有两个BsaI酶切位点；通过一步PCR得到靶标序列和两个BsaI位点的目的片段，然后通过简单酶切和连接的方式将上述片段构建进入带有Cas9基因的双元表达载体中，形成配对的sgRNA的Cas9载体。
具体地说，本方法包括以下步骤：
①利用pYLCRISPR/Cas9P-35S-N载体为原始载体骨架，经过PCR和同源重组的方法构建出新的Cas9双元表达载体pHLW-gRNA-Cas9-AtU3b(图1.1)；
②利用pYLsgRNA-AtU3b为原始载体骨架，经过重设计改造为本方法使用的中间载体pYLsgRNA-AtU3b(图1.2)；
③根据特定基因设计出基因编辑位点，并根据所使用的载体设计出带有基因编辑位点的正反sgRNA引物；
④将所有的正向sgRNA引物等量混合形成正向sgRNA引物混合物，将所有的反向sgRNA引物等量混合形成反向sgRNA引物混合物；
⑤以sgRNA中间载体pYLsgRNA-AtU3b为模板，用步骤④的正反向sgRNA引物混合物作为正反向引物进行PCR扩增，对扩增的产物进行纯化回收；
⑥将步骤⑤的产物和Cas9双元表达载体pHLW-gRNA-Cas9-AtU3b混合使用BsaI进行酶切反应，接着在反应液中加入T4DNA连接酶进行边切边连的反应。
本发明具有下列优点和积极效果：
1、能够高效建立随机文库和非随机文库，可以用于植物中基因功能的大规模筛选，同时可以用于多基因间基因互做网络的构建和研究；
2、实验结果证明本方法成功高效地构建了14个靶点(来自14个基因)的随机配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库。
附图说明
图1.1是使用改造之后的Cas9双元表达载体的示意图，
图1.2是使用改造之后的sgRNA中间载体的示意图；
图2是使用混合引物PCR得到的胶图；
图3是经过边切边连的反应和转化之后得到的克隆平板图；
图4.1是得到Cas9双元载体的表达盒测序峰图(gRNA1)；
图4.2是得到Cas9双元载体的表达盒测序峰图(gRNA2)。
英译汉：
1、sgRNA：向导RNA(guide RNA，gRNA)，也称为小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，由两部分组成—tracRNA和crRNA，两部分融合表达后，即sgRNA能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。
2、CRISPR/Cas9：英文全称为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas 9(CRISPR-Associated 9)，是一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。此系统的工作原理是通过人工优化的具有引导作用的单链gRNA(Guide RNA)引导核酸酶Cas蛋白在与gRNA配对的靶位点处剪切双链DNA，引起DNA双链断裂(DSB)，进而利用生物体内非同源末端修复机制(NHEJ)或同源重组机制(HR)修复DNA，导致基因移码突变、替换或删除，致使基因功能丧失。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：
本发明生物材料的来源：
1、载体pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU3b：Ma，X.，Zhang，Q.，Zhu，Q.，Liu,W.，Chen，Y.，Qiu,R.(2015)A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant,8,1274–1284，这两个载体有华南农业大学刘耀光教授赠送给本发明申请人；
2、所有的引物均由本发明申请人自行设计并委托上海生物生工有限公司合成；
3、所有使用的PCR聚合酶均购买自北京全式金有限公司。
4、所有使用的限制性内切酶和T4DNA连接酶均购买自New England Biolabs。
本实施例用于说明快速构建适合于植物的配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法，包括：
1)挑取含有pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU3b质粒的单菌落，分别接种于含有50ng/ml Kan、50ng/ml Amp的50ml LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床过夜培养；
2)离心收集菌体，使用碱裂解法提取pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU3b质粒，通过Nanodrop 2000测定质粒浓度；
3)分别使用AscI、BamHI和HindIII对pYLCRISPR/Cas9P-35S-N、pYLsgRNA-AtU3b质粒进行酶切验证，同时使用引物SP-DL/SP-R对pYLCRISPR/Cas9P-35S-N质粒进行PCR和测序验证；
4)以质粒pYLsgRNA-AtU3b为模板，使用引物U3-1-F和U3-1-R-C扩增得到AtU3b、两个BsaI酶切位点的片段；
5)以质粒pYLsgRNA-AtU3b为模板，使用引物GF和GR扩增得到含有两个BsaI酶切位点、gRNA scaffold和终止子的片段；
6)使用AscI单酶切质粒pYLCRISPR/Cas9P-35S-N，并回收对应的片段，得到线性化的pYLCRISPR/Cas9P-35S-N；
7)将4)、5)和6)中的片段进行混合，使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit进行同源重组反应，取5ul反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态，并使用50ng/ml Kan的培养基进行过夜培养，挑取单菌落、摇菌、提取质粒，使用SP-DL/SP-R进行PCR得到的产物送样测序，鉴定得到质粒pHLW-gRNA-Cas9-AtU3b；
8)根据猕猴桃的14个基因设计了28个靶标并设计得到对应的正反引物(其中正向引物依次包含BsaI位点、gRNA1、gRNA scaffold的同源序列；反向引物依次包含BsaI位点、gRNA2、AtU3b启动子的同源序列)；
具体引物详情参见表1.
表1：猕猴桃目的基因引物设计列表
注：其中引物名字带有PF的表示正向引物，带有PR的表示反向引物；
9)第一次PCR：首先将需要构建的所有gRNA的引物等比例混匀(引物预先稀释到10μM)，接着按照下面的PCR体系进行PCR，其中要注意使用的酶必须是末端不添加A的高保真酶(比如transgen fastpfu)，模板是pYLsgRNA-AtU3b载体(约100ng/μL)；为了尽可能的扩增出各种组合的产物建议PCR多做几个重复；将所有的引物混匀可以一次操作可以产生所有基因的成对组合，同时包括单基因的两条gRNA的载体和两个基因的gRNA的载体；
表2：PCR反应体系
表3：PCR反应体系
10)回收纯化9)中的PCR产物并使用Nanodrop2000测定其浓度；
11)边切边连法：取约20-70ng PCR产物，加入约80-100ng未切割的pHLW-gRNA-Cas9-AtU3b质粒(预先稀释成约100ng/ul冷冻保存)，在15μl反应(1x Bsa I-内切酶Buffer)用10U BsaI 37℃酶切～10min(不要过多BsaI和过长时间，否则载体会产生破坏平滑末端而自连)；(不要失活Bsa I)加入ATP至终浓度0.2～1.0mM。如果实验室没有ATP，加0.3～0.5μl 10x NEB T4DNA ligase buffer(或1.5μl 10x Takara T4DNA ligase buffer)，和35U ligase(不要过多连接酶)；用变温循环酶切连接约10-15循环:37℃2min；10℃3min，20℃5min；最后37℃2min。此方法要点：由于没有去除Bsa I切出的13/17碱基小片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被Bsa I切除，而连接好的目标产物序列由于不存在Bsa I的识别位点不会被切断。
12)转化感受态及鉴定：取10μL连接产物转化DH5α，恢复培养1h，然后将菌液留下150ul，均分成3份涂板。挑取阳性克隆在10μL的ddH2O中打匀，其中3μL用作菌落PCR，7ul作为摇菌种子液。以SP-DL/SP-R为引物进行PCR鉴定并将产物测序检测；
13)我们的结果证明通过第一次的PCR我们可以到单一条带的PCR产物，且PCR产物长度(742bp)与预期的长度一致(具体参见附图3)。
14)通过挑取单克隆，我们发现其中出现假阳性的概率极低(2/100)，因此本方法可以高效的构建相关载体。同时我们可以发现引物之间可以进行随机组合，产生配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库。
序列表
<110> 中国科学院武汉植物园
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