一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及宫膜干细胞的分离提取和宫膜干细胞库的建立。
背景技术
1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，但这两种来源都存在着部分局限性，因此寻找一种克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学争议等弊端的干细胞来源具有重要意义。近年来，美国Musina领导的研究小组从健康女性的月经血中得到分离的干细胞。宫膜干细胞(MenSCs)避免了其他干细胞的不足，成为一种全新的具有重大研究和应用潜力的干细胞。
然而，经对现有技术文献和专利的检索发现(如中国专利申请号201110085328.4和201210116237.7)，现有报道的宫膜干细胞获取方法中主要使用密度梯度离心的方法，但是会过滤去除组织块，传统的密度梯度离心收获到的仅为白膜层的单个核细胞，而脱落的组织块则会沉淀在底部废弃掉，该方法收获到的细胞数量较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法，以解决现有技术中的宫膜干细胞分离提取方法产量较低的缺陷。
本发明的发明人根据宫膜干细胞来源于脱落的宫膜组织，但并非所有宫膜干细胞都会变为单个核细胞，还存在脱落的宫膜组织块的原理，通过不断摸索，将底部沉淀洗涤后贴壁培养，宫膜组织块中的宫膜干细胞会呈克隆状贴壁，由此收获的干细胞的数量约为传统方法收获到的数量的10倍左右，大大提高了宫膜干细胞分离提取的效率，为宫膜干细胞建库提供大量的宫膜干细胞资源。
本发明的技术方案如下：
一种高效的宫膜干细胞分离提取方法，将月经血样品经过密度梯度离心后得到的底部沉淀洗涤后贴壁培养，收获宫膜干细胞。
优选地，所述密度梯度离心，其方法是在人淋巴细胞分离液上缓慢添加等体积的月经血样品，15℃-25℃的温度下，300-500g的转速，离心20-40分钟。
优选地，所述底部沉淀的洗涤，其方法是使用10倍体积的缓冲液冲洗，重复三次。
优选地，所述的月经血样品，是指女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含一种或多种抗菌物质的缓冲液。所述缓冲液也称为月经血保存液。
优选地，所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素中的一种或几种。
优选地，所述贴壁培养包括原代培养和传代扩增。
优选地，宫膜干细胞的原代培养方法为：将分离洗涤后得到的底部沉淀中的目标细胞用10ml含10％-20％的血清的α-MEM重悬，放在平皿中在37℃、5％CO2的条件下静置培养，24小时后，用10ml缓冲液洗涤3次，更换10ml新鲜的培养液，以后每3天全换液一次；细胞长满约80％-90％时，消化，之后进行传代。
优选地，宫膜干细胞的传代扩增步骤包括：原代培养方法中传代后的宫膜干细胞，每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化，并继续传代。
一种高效的宫膜干细胞的建库方法，包含月经血采集、宫膜干细胞分离提取、原代培养和传代扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，其中，所述月经血采集、宫膜干细胞分离除菌提取、原代培养和扩增采用上述任一所述的方法。
优选地，所述分析检测包括无菌性检测、流式细胞仪检测、核型检测和分化能力检测；所述定期检测的项目包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
第一，本发明采用密度梯度离心废弃的底部沉淀分离提取宫膜干细胞，收获的宫膜干细胞数量是传统白膜层的十倍左右，收获的大量宫膜干细胞扩增培养后可建立宫膜干细胞库；
第二，本发明采用了密度梯度离心、洗涤、在月经血保存液中加入抗菌物质等多种手段保证了除菌的彻底性，使得到的宫膜干细胞产品不被污染。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
图1是本发明实施例的密度梯度离心提取宫膜干细胞的照片；
图2(a)和图2(b)是作为对比例的传统的宫膜干细胞分离提取后贴壁照片(1天)；
图3(a)和图3(b)是本发明实施例的高效的宫膜干细胞分离提取后贴壁照片(1天)；
图4(a)和图4(b)是作为对比例的传统宫膜干细胞分离提取方法的原代细胞照片(8天)；
图5(a)和图5(b)是本发明实施例的高效宫膜干细胞分离提取方法的原代细胞照片(8天)；
图6(a)和图6(b)是作为对比例的传统方法的宫膜干细胞分离提取的P1代细胞照片(13天)；
图7(a)和图7(b)是本发明实施例的高效方法的宫膜干细胞分离提取的P1代细胞照片(11天)。
具体实施方式
本发明提供一种高效的宫膜干细胞分离提取方法，该方法选用月经血样品密度梯度离心后的底部沉淀(即宫膜组织)，对其进行洗涤后贴壁培养，可获得大量的宫膜干细胞。
密度梯度离心的原理是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。密度梯度离心的目的是去除部分细菌、真菌和支原体。
所述密度梯度离心使用密度为1.077的细胞分离液(如人淋巴细胞分离液)，以300-500×g的转速，在15℃-25℃下离心20-40分钟。
所述月经血样品是指女性月经周期第二天或第三天的月经血，并添加等体积的含多种抗生素的缓冲液，所述缓冲液也称为月经血保存液。
所述月经血保存液中还可添加抗菌物质；其中所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素中的一种或几种。进一步地，所述月经血保存液中添加的抗菌物质优选为两性霉素、青霉素、链霉素中的一种或几种。
所述对底部沉淀进行洗涤的方法为：使用10倍体积的缓冲液冲洗，1000rpm-1500rpm离心5-10分钟，弃除废液。该过程重复3次，以去除残留的细菌、真菌和支原体等物质。
所述贴壁培养包括宫膜干细胞的原代培养和传代扩增。
其中，宫膜干细胞的原代培养方法为：将分离洗涤后得到的底部沉淀中的目标细胞用10mlα-MEM(含10％-20％的血清)重悬，放在平皿中在37℃、5％CO2的条件下静置培养，24小时后，用10ml缓冲液洗涤3次，更换10ml新鲜的培养液，以后每3天全换液一次。细胞长满约80％-90％时，消化，之后进行传代。
宫膜干细胞的传代扩增步骤包括原代培养方法中传代后的宫膜干细胞，每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化，并继续传代。
本发明还提供一种高效的宫膜干细胞的建库方法，包括：月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤。
本发明的建库方法中的月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增与上述宫膜干细胞分离提取方法中相同。
本发明的建库方法中的分析检测包括无菌性检测、流式细胞仪检测、核型检测和分化能力检测。
本发明的建库方法中的宫膜干细胞的长期保存包括将细胞以1×106至1×107细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到-196℃液氮中长期保存。
在长期保存过程中，进行宫膜干细胞的定期检测，该定期检测包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。
其中，细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检测细胞存活率。
流式细胞仪检测包括细胞表面抗原CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、HLA的检测。
分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的检测。
本发明的宫膜干细胞的建库方法中，扩增后的分析检测和冻存过程中的定期检测都要进行无菌性检测，包括真菌的检测和细菌的检测。
本发明的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法的一个具体实施方式包括以下步骤：
1、月经血的收集
利用月事杯收集月经血，将月经血保存在月经血保存液中，将得到的月经血样品于2-8℃条件下运送到GMP车间，其中，月经血保存液是含肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。此外，月经血保存液中还可以添加抗菌物质。
2、宫膜干细胞的分离和除菌
在人淋巴细胞分离液中缓慢添加等体积的月经血样品，15℃-25℃的温度下，300-500g的转速，离心20-40分钟；之后收集底部沉淀，将其进行洗涤后得到宫膜组织中的干细胞。
3、宫膜干细胞的原代培养
将分离得到的宫膜干细胞在细胞培养液中培养，24小时后更换新鲜培养液。在显微镜下拍40倍和100倍照片，观察底部沉淀分离得到的干细胞数量和形态。以后每3天全换液一次，每天拍照记录细胞形态。细胞长满约80％-90％时，消化对比原代收获的细胞数量，继续传代。所述培养液为α-MEM含10％-20％血清。
4、宫膜干细胞的传代扩增
传代后的宫膜干细胞，每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化对比P1代收获的细胞数量，继续传代。该步骤所用培养液为α-MEM(含10％血清)。
5、宫膜干细胞的检测
将传代的细胞进行无菌性检测，流式细胞仪检测，核型检测，成骨分化检测等一系列检测。
6、宫膜干细胞的冻存
将传代后的宫膜干细胞通过程序降温法保存，即将细胞以1×106-至1×107细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，然后转移到-196℃液氮中长期保存。
7、宫膜干细胞的定期检测
每隔一定的时间(例如：12个月)，将宫膜干细胞复苏，进行细胞活率、无菌性、流式细胞仪、分化能力等各项检测，对保存的宫膜干细胞的质量进行监控。
在本文中，由「一数值至另一数值」表示的范围，是一种避免在说明书中一一列举该范围中的所有数值的概要性表示方式。因此，某一特定数值范围的记载，涵盖该数值范围内的任意数值以及由该数值范围内的任意数值界定出的较小数值范围，如同在说明书中明文写出该任意数值和该较小数值范围一样。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例提供了一种具体的宫膜干细胞分离提取和建库的方法步骤，同时该方法步骤还包括将传统的宫膜干细胞分离提取方法作为对比例进行干细胞的分离提取。
本实施例包括以下步骤：
步骤1、月经血的采集
供者签署知情同意书后采集月经周期第二天或第三天的月经血，将利用月事杯收集到的5ml-15ml月经血保存在等体积的月经血保存液(含肝素钠的PBS盐缓冲溶液，并添加100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)中，2-8℃的条件下48小时内运送到国家认证的GMP车间。
步骤2、
对比例：传统的宫膜干细胞分离提取
将5ml月经血混合液缓慢加入含5ml Ficoll分离液的15ml离心管中，利用密度梯度离心的方法，加速度和降速度均设为1,转速为300-500×g，离心20-40分钟后收集白膜层，即单个核细胞(PBMC)。密度梯度离心照片见图1。
其中，白膜层可收获单个核细胞，从而收获单个的宫膜干细胞；底部沉淀可收获宫膜组织块。
将PBMC用10ml PBS冲洗，1000rpm-1500rpm离心5-10分钟，弃除废液。该过程重复3次，去除残留的细菌等物质。
将分离得到的目标细胞用3mlα-MEM(含10％的血清)重悬，放在六孔板中在37℃、5％CO2的条件下静置培养，24小时后，用10ml缓冲液洗涤3次，更换3ml新鲜的培养液，显微镜下观察贴壁细胞，可见到细胞呈梭形，细胞照片见图2(a)和图2(b)。对弃除的上清液进行无菌性检测。
本实施例：高效的宫膜干细胞分离提取
将5ml月经血混合液缓慢加入含5ml Ficoll分离液的15ml离心管中，利用密度梯度离心的方法，加速度和降速度均设为1,转速为300-500×g，离心20-40分钟后收集废弃的底部沉淀，底部沉淀中含宫膜组织块。将底部沉淀用10ml PBS冲洗，1000rpm-1500rpm离心5-10分钟，弃除废液。该过程重复3次，去除残留的细菌等物质。
将分离得到的目标细胞用10mlα-MEM(含10％的血清)重悬，放在平皿(表面积是六孔板的6倍)中在37℃、5％CO2的条件下静置培养，24小时后，用10ml缓冲液洗涤3次，更换10ml新鲜的培养液，显微镜下观察到贴壁细胞，细胞呈克隆状梭形，细胞照片见图3(a)和图3(b)。对弃除的上清液进行无菌性检测。
步骤3、
对比例：宫膜干细胞的原代培养及传代
步骤2的对比例的六孔板每3天全换液一次，细胞约在8天左右长满约80％-90％，用1ml PBS洗涤3次，在37℃下消化3-5分钟，离心后去除胰酶，用10mlα-MEM(含10％的血清)重悬于平皿中。之后每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化，并继续传代。图4(a)和图4(b)、图5(a)和图5(b)所示为对比例和本实施例的原代细胞照片(8天)。图6(a)和图6(b)、图7(a)和图7(b)所示分别为对比例和本实施例的P1代细胞照片(13天)和P1代细胞照片(11天)。
本实施例：高效分离提取获得的宫膜干细胞的原代培养
将步骤2的平皿每3天全换液一次，细胞约在8天左右长满约80％-90％，用5ml PBS洗涤3次，在37℃下消化3-5分钟，离心后去除胰酶，用10mlα-MEM(含10％的血清)重悬于平皿中，在37℃，5％CO2的条件下静置，进行传代培养。之后每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化，并继续传代。图5(a)和图5(b)所示为本实施例的原代细胞照片(8天)。
对传统方法(对比例)和本发明的高效方法(实施例)原代培养和P1代培养收获的宫膜干细胞的数量进行统计，并列入下表1。
表1
从上表1可见，本发明的高效方法收获的宫膜干细胞数量是传统方法的大约6.5-10倍。
步骤4、宫膜干细胞检测
1)无菌性检测
将扩增后的宫膜干细胞送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测(根据《中国药典》2010版三部附录XIIA无菌性检测的方法，检测分离得到的宫膜干细胞是否被细菌或真菌污染)。
2)流式细胞仪检测
取对数生长期的第3代MenSCs，用0.25％胰酶-EDTA消化后，以含10％-20％胎牛血清的α-MEM中和，1000-1500rpm离心3-5min，PBS清洗3遍以除去血清。调整细胞密度至106个细胞/ml，以1ml体积分装至无菌离心管中。分别按照说明书上的量加入鼠抗人CD14-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD29-PE、CD90-PE、HLA-PE抗体，混匀，4℃避光孵育30min。同时以未加抗体的细胞作为阴性对照，以相应的鼠抗人IgG1作为同型对照。孵育结束后，PBS清洗3遍除去未结合的抗体，BD流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况，CellQuest软件处理结果。
处理结果显示，其中CD14、CD29、CD90呈阳性，CD14、CD45、HLA呈阴性。
3)成骨分化检测
0.25％胰酶-EDTA将细胞消化下来，以104个细胞/ml的密度分别接种至3块六孔板，待细胞贴壁后更换成骨诱导液(α-MEM添加10％FBS、100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠和0.05mM抗坏血酸)诱导分化28天。每周更换2次成骨诱导液。之后进行如下检测。
3.1碱性磷酸酶(ALP)检测
消化获得的MenSCs在成骨诱导液诱导分化14天时，进行ALP活力测定：吸去六孔板中的培养液，PBS洗3遍，加入400μl裂解缓冲液(1.5M Tris-HCl，1mM ZnCl2，1mM MgCl2，1％Triton-X100，pH 9.2)，37℃裂解30min，13,000rpm离心10min，取20μl上清用ALP试剂盒检测碱性磷酸酶活性，酶标仪读取405nm处吸光值。
经计算ALP检测值是10IU/106个细胞。
3.2茜素红矿化节染色
MenSCs细胞成骨诱导分化28天时，进行茜素红染色以观察矿化节形成。具体步骤为：六孔板中的细胞用PBS洗三次，加入70％的冷乙醇，4℃固定1小时，去离子水洗3遍除去残留的乙醇，加入3ml 0.1％茜素红溶液(pH 8.3)室温下染色15min，间歇晃动，去离子水洗5次除去未结合的茜素红，37℃，PBS清洗15min。经显微镜观测，观测到红色矿化节。
步骤5、宫膜干细胞冻存
本实施例的细胞长满约80％-90％时，利用胰酶(含EDTA)消化后，PBS冲洗3次，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测，支原体检测，细胞计数和活力测定，以确定其是否到达合格标准。经过检测符合标准的宫膜干细胞按1×106～2×107个细胞/ml的密度在冻存液(DMSO、胎牛血清和α-MEM培养液1:2:7)中重悬，分装入冻存管。在冻存管外贴标签，标签上记录细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整记录每一样本的真实冷冻状况，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，完成细胞库信息录入和构建。冻存管放入程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，次日将冻存管转移到-196℃液氮罐中相应的空格中长期保存。冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，并符合国家相关文件规定。
步骤6、宫膜干细胞定期检测
每隔12个月，将冻存的一部分宫膜干细胞复苏，取50μl细胞悬液添加50μl台盼蓝染液，染色3min，将细胞混合液加入细胞计数板中，显微镜下观察，计算并未染成蓝色的细胞比例即细胞存活率，细胞存活率需大于等于95％。并按照上述方法进行无菌性检测、流式细胞仪检测、成骨分化检测等各项检测，以便对保存的宫膜干细胞进行质量监控。定期将检测报告交给供者。
本发明的发明人经过研究开发，提供了高效的宫膜干细胞的细胞分离提取及建库的方法，在获得月经血样本后，经过密度梯度离心将传统方法中废弃的底部沉淀洗涤后贴壁培养获得大量宫膜干细胞。通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。
在本发明及上述实施例的教导下，本领域技术人员很容易预见到，本发明所列举或例举的各原料或其等同替换物、各加工方法或其等同替换物都能实现本发明，以及各原料和加工方法的参数上下限取值、区间值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
