一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法
技术领域
本发明涉及分子生物学实验技术领域，更特别地，涉及一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法。
背景技术
20世纪50年代，DNA双螺旋结构的分子模型的建立，奠定了分子生物学的基础。由此，跟DNA相关的各种基因工程、酶工程等工程技术应运而生，尤其是DNA工具酶的发现，促使只能在细胞内完成的各种DNA为底物的酶反应能够在体外完成。随着二代测序技术的发展，将各种工具酶得到充分应用。不仅测序过程由酶反应来完成，测序前的各种各样的文库构建，更是由多种酶，多个酶反应来完成。
多步酶反应过程之间缓冲液等的不兼容性，导致每次酶促反应后需要将 DNA纯化。目前主要的纯化方式分磁珠纯化和硅胶柱纯化，市面上磁珠纯化以简便，通量大，操作简单，洗脱体积小等优势在酶反应后的DNA纯化基本替代硅胶柱纯化。见图1，目前以磁珠来纯化的多步酶反应的过程如下：向酶反应体系中加入磁珠，混匀后，将反应管放在磁力架上，移除液体，加入乙醇洗涤，然后洗脱磁珠上吸附的核酸；洗脱物转移至新反应管，在新管中配制第二步酶反应体系，再次加入磁珠，重复上述洗涤和洗脱步骤。
在多步酶反应中，每步酶反应都需要进行加入磁珠吸附核酸和从磁珠上洗脱核酸的的步骤，这种方式费时费力，还增加的磁珠成本，此外，在转移过程中容易造成交叉污染。
因此，需要一种新的多步酶反应方法。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法，其包括在从上一步酶反应体系转换为下一步酶反应期间直接将下一步酶反应体系与上一步分离的挂载有核酸磁珠混合的步骤。
本发明的方法省去了传统方法中每步酶反应结束后从磁珠洗脱核酸，然后在下次反应中再次加入磁珠的步骤，大幅节省了磁珠的用量，减少了操作步骤，缩短了操作时间。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：
S1：向装有第一步酶反应体系的反应管中加入磁珠悬液，混匀；
S2：第一步酶反应结束后，将所述反应管放置于磁力架上，待磁珠固定后，移除所述第一步酶反应体系；
S3：洗涤所述反应管和所述磁珠，从所述磁力架上取下所述反应管，并干燥；
S4：向所述反应管中加入第二步酶反应体系，混匀；
S5：第二步酶反应结束后，加入磁珠结合液,混匀，重复S2-S4，直至所有酶反应结束；
S6：用洗脱液从所述磁珠上洗脱核酸。
在一个优选实施方案中，S1中，添加的所述磁珠悬液的体积为所述第一步酶反应体系体积的0.6-3.8倍。
在一个实施方案中，S3中，使用70-85％的乙醇洗涤所述反应管和磁珠。 70-85％的乙醇中核酸不会溶解，但是可以去除其他杂质。
优选地，S3中洗涤2-5次。
在一个实施方案中，S3中在室温下干燥所述反应管及其中的磁珠。
在一个优选实施方案中，，S5中加入的磁珠结合液为PEG/NaCl磁珠结合液。
在一个实施方案中，S5中所加入的PEG/NaCl磁珠结合液的体积为当时的酶反应体系体积的0.6-3.8倍。
在一个实施方案中，所述核酸为DNA或RNA。
附图说明
图1为传统方法的流程图；
图2为本发明的方法的文库构建时间和磁珠用量与传统方法的比较柱状图；
图3为不同操作人构建的文库浓度统计图；
图4为不同操作人构建的文库片段分布图；
图5为不同操作人GC含量、唯一比对率、重复率、可用数据率统计图；
图6为本发明的方法与传统方法胎儿浓度比较；
图7本发明的方法与传统方法GC含量比较；
图8为本发明的方法与传统方法的数据可用率比较；
图9为本发明的方法与传统方法的重复率比较；
图10为本发明的方法与传统方法的唯一比对率比较；
图11为本发明的方法和传统方法构建的文库测序片段分布图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的方法流程如下：
1)纯化磁珠室温平衡，颠倒混匀，在第一步酶反应体系中加入0.6-3.8 倍体积的磁珠，吹打混匀10次；室温放置5-10min；
2)将反应管放置在磁力架上，静置5min，吸出和磁珠分离的废液，加入200ul新鲜配制的80％乙醇，放置30sec；
3)用加样器吸出乙醇，重复步骤2洗涤1次；最后吸出多余的乙醇，室温干燥2-10min，确保磁珠完全干燥没有乙醇残留；
4)将配置好的第二步酶反应液直接加入磁珠，混匀，适宜温度孵育；
5)第二步酶反应完成后加入0.6-3.8倍的PEG/NaCl磁珠结合液,，吹打混匀10次；室温放置5-10min；
6)重复步骤3-5，直至不再进行酶反应后，用洗脱液洗脱所需DNA/RNA。
本实施例的方法可以应用于各种RNA和DNA测序文库的构建，为验证该方法对文库构建的影响，以149例孕妇血浆游离DNA样本构建文库详细描述多步酶反应方法的优点。
1.孕妇血浆游离DNA文库构建
1)从孕妇血浆中抽提游离DNA，1-10ng；
2)按照表1所示配制末端修复反应液，20℃孵育30min。孵育完成后加入45μlXPBeads，混匀，室温静置5min，放置于磁力架吸附磁珠3min，用移液器吸取废液丢弃，注意不要吸到磁珠，造成损失；加入200μl80％乙醇，移液器吹打8次，静置30s，吸取废液丢弃，再加入200μl80％乙醇重复洗涤1次，吸取废液丢弃，此处将废液吸取干净，容易干燥，但不要吸到磁珠；37℃烘干3min。
表1末端修复反应液配制表
3)按照表2所示配制末端加A反应液，待上一步磁珠烘干后，立即加入末端加A反应液，37℃孵育30min，孵育完成后加入45μlPEG/NaCl 磁珠结合液混匀，静置5min，放置于磁力架吸附磁珠3min，用移液器吸取废液丢弃，注意不要吸到磁珠，造成损失；加入200μl80％乙醇，移液器吹打8次，静置30s，吸取废液丢弃，再加入200μl80％乙醇重复洗涤 1次，吸取废液丢弃，此处将废液吸取干净，容易干燥，但不要吸到磁珠； 37℃烘干3min。
表2末端加A酶反应液配制表
4)按照表3所示配制接头连接反应液，待上一步磁珠烘干后，立即加入接头连接反应液，20℃孵育20min，孵育完成后加入37.5μlPEG/NaCl 磁珠结合液混匀，静置5min，放置于磁力架吸附磁珠3min，用移液器吸取废液丢弃，注意不要吸到磁珠，造成损失；加入200μl80％乙醇，移液器吹打8次，静置30s，吸取废液丢弃，再加入200μl80％乙醇重复洗涤 1次，吸取废液丢弃，此处将废液吸取干净，容易干燥，但不要吸到磁珠； 37℃烘干3min。
表3接头连接反应液配制表
5)按照表4所示配制PCR富集反应液，待上一步磁珠烘干后，立即加入PCR富集反应液，94℃，2min；15cycs(94℃,30s；60℃,30s；72℃,30s)，孵育完成后加入22.5μlPEG/NaCl磁珠结合液混匀，静置5min，放置于磁力架吸附磁珠3min，用移液器吸取废液丢弃，注意不要吸到磁珠，造成损失；加入200μl80％乙醇，移液器吹打8次，静置30s，吸取废液丢弃，再加入200μl80％乙醇重复洗涤1次，吸取废液丢弃，此处将废液吸取干净，容易干燥，但不要吸到磁珠；37℃烘干3min。加入22μlddH2O混匀，静置5min，置于磁力架上3min，吸取21μl洗脱文库转移至新的离心管保存。
表4 PCR富集反应缓冲液
6)Qubit2.0检测文库浓度，Caliper检测文库条带。
7)按照illuminaNextseq500操作说明进行文库Pooling和上机测序。
8)测序信息分析符合质检要求。
将该方法和传统方法构建的149例孕妇血浆游离DNA样本文库进行比较，结果如表5所示，该方法的各项质检指标正常，符合无创产前筛查的质检要求，实验过程可靠，可信度高。
表5本实施例的方法构建的文库于传统文库质控指标比较
2.时间与成本的节约
将本实施例的方法与传统方法进行比较。与传统方法中每个酶反应步骤都需要加入磁珠不同，本实施例的方法仅在第一个酶反应步骤(即，末端修复步骤)中加入了磁珠，其后的三个酶反应步骤(末端加A、接头连接、PCR 富集)中均未加入新的磁珠，没有进行多次洗脱，减少了纯化时间和操作步骤。如表6和图2所示，与传统方法相比，本实施例的方法总体的纯化时间减少了32分钟，还节省了操作步骤及其所花费的时间，此外，磁珠用量减少95μl。
表6该方法与传统方法每批次文库构建时间和磁珠用量比较
3.本实施例构建的DNA文库的稳定性
为证明本实施例的方法应用在孕妇血浆游离DNA文库构建的实验流程稳定性，由三个不同的实验者利用本方法构建3批次孕妇血浆游离DNA文库， 3批次样本个数为8/8/9个，每批次的各项质控指标是否在正常范围内。
结果如图3-5所示，不同操作人3批次文本库浓度均在30-60ng/μl 之间(见图3)，3批次片段分布高度重合(见图4)，3批次文库GC含量、唯一重复率、可用数据率相对稳定，没有明显波动，且均在质检范围内(见图5)。
利用本实施例的方法构建149例孕妇血浆游离DNA文库平均浓度41.08 ng/μl，文库浓度变异系数0.186，与传统方法(38.84,0.265)比较，文库平均浓度提高2.24，文库浓度波动较小。可见，本实施例的方法应用在孕妇血浆游离DNA文库构建上，实验流程稳定性好。
4.本实施的方法构建的文库对胎儿DNA浓度的影响
149例孕妇血浆游离DNA，分别用本方法和传统方法构建文库，其中80 例男胎样本，以Y为基础计算胎儿浓度。80例样本的胎儿浓度如图6所示， 80例样本中1例样本的胎儿浓度中比传统方法低0.34％，其余79例样本的胎儿浓度均高于传统方法。本实施例的方法的平均胎儿浓度为11.40％，传统方法平均胎儿浓度为9.89％，平均胎儿浓度提高1.52％。胎儿浓度的提高有利于提高染色体异常信号，增加检出灵敏度。
5.本实施的方法构建的文库对GC含量的影响
149例孕妇血浆游离DNA采用本方法和传统方法两种方法构建文库，测序后的GC％含量作图。结果如图7所示，传统方法的平均GC含量为39.87％，本方法的平均GC含量为40.32％，本方法的平均GC含量提高0.45％,更加接近人基因组平均GC含量41％。
6.本实施的方法对文库测序数据可用率、数据比对率、数据重复率的影响
以149例孕妇血浆游离DNA为例，采用本实施例的方法和传统方法构建的文库，信息分析数据可用率，数据比对率，数据重复率。结果如图8和9 所示，与传统方法构建的文库相比，本实施例的方法的数据可用率没有明显的差别，重复率有所下降，平均数据重复率低0.33％；唯一比对率也没有明显的差别，同一样本在不同方法中是一一对应的。
7.本实施例的方法构建的文库在片段分布上的影响
结果如图10所示，本实施例的方法构建的文库片段分布体现在小片段上的提高，集中在80-150bp之间，文献表明血浆DNA在166bp有显著的峰，另外有一系列每10bp间隔的143bp等更小的峰。妊娠妇女血浆中胎儿来源的分子短于母体分子，胎儿和母体DNA最显著的差异是166bp的峰相对地减少和143bp等较小的峰相对地增加。本实施例的方法可以最大限度的减少DNA损耗，小片段是最容易在磁珠纯化过程中损耗，因此小片段比率比较传统方法要高，导致胎儿浓度比传统方法增加，胎儿浓度增加可以相对传统方法可以提高胎儿浓度检测限，提高胎儿染色体异常的灵敏度。
8.本实施例的方法构建的文库在13，18，21染色体结果判断样本一致性
测试本实施例的方法与传统方法构建的文库在13，18，21染色体结果判断样本一致性。结果如表7所示，13，18，21染色体结果阴阳性判断一致率为100％。13,18,21号染色体阳性样本各1个，剩余146个样本全部为阴性。本方法与传统方法阴阳性结果一致，不影响结果的判定。
表7样本一致性统计表
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
