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16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒和应用

2021-04-23 16:56:56

附图说明" src="/d/file/p/2020/11-23/f51c5877b5bdec8ece6ad7debe334d34.gif" />

16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒和应用

　　技术领域

　　本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒和应用。

　　背景技术

　　微生物菌种鉴定一直是生化检测领域的研究热点。如何快速有效的鉴定出微生物的门、纲、目、科、属或种信息是目前亟需解决的技术问题。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有原核生物基因组中，含量大约占基因组DNA的80％，分子大小约1540bp。16S rDNA包含10个保守区域(constant region)和9个高变区域(hypervariable region)，其中，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。这样的特点使得16S rDNA成为微生物菌种鉴定的标准识别序列。随着新一代测序(NGS)技术的快速发展，越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，以16S rDNA作为目标序列进行微生物菌种鉴定，所得分类结果更为可靠。然而，传统的微生物菌种鉴定方法普遍存在耗时长的问题，限定了应用。

　　发明内容

　　基于此，有必要提供一种能够提高检测效率的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒和应用。

　　一种16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统，包括第一引物组和第二引物组；所述第一引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第一上游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第一上游特异性序列，所述第一引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第一下游接头序列以及第一下游特异性序列；所述第二引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第二上游接头序列以及第二上游特异性序列，所述第二引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第二下游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第二下游特异性序列。

　　在其中一个实施例中，所述第一上游接头序列与所述第二下游接头序列相同；

　　所述第一下游接头序列与所述第二上游接头序列相同；

　　所述第一引物组和所述第二引物组中的所述key序列及所述gap序列均相同。

　　在其中一个实施例中，所述第一上游接头序列与所述第二下游接头序列均如序列表中SEQ ID NO.1所示；

　　所述第一下游接头序列与所述第二上游接头序列均如序列表中SEQ ID NO.2所示；

　　所述key序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

　　所述barcode序列选自序列表中SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.99中的任一种；

　　所述gap序列如序列表中SEQ ID NO.100所示。

　　在其中一个实施例中，所述第一引物组和所述第二引物组中相同的barcode序列对应的所述第一上游特异性序列与所述第二上游特异性序列相同，且相同的barcode序列对应的所述第一下游特异性序列与所述第二下游特异性序列相同。

　　在其中一个实施例中，所述第一上游特异性序列与所述第二上游特异性序列均如序列表中SEQ ID NO.101所示；

　　所述第一下游特异性序列与所述第二下游特异性序列均如序列表中SEQ ID NO.102所示。

　　一种16S rDNA微生物菌种鉴定用试剂盒，包括上述任一实施例所述的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统。

　　在其中一个实施例中，所述16S rDNA微生物菌种鉴定用试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA浓度测定试剂、多重PCR扩增试剂、扩增产物纯化试剂、Emulsion PCR试剂及模板富集试剂中的至少一种。

　　一种16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库的构建方法，使用上述任一实施例所述的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统，所述16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库的构建方法包括如下步骤：

　　提取微生物基因组DNA；

　　以提取的微生物基因组DNA为模板，以含有所述第一引物组和所述第二引物组的引物混合物为扩增引物进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；

　　纯化所述多重PCR扩增产物，得到16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库。

　　在其中一个实施例中，所述多重PCR扩增的条件是：先95℃预变性5min；再95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸60s，共35个循环；再72℃彻底延伸10min；于10℃保温备用。

　　一种16S rDNA微生物菌种鉴定方法，包括如下步骤：

　　使用上述任一实施例所述的16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库的构建方法构建测序文库；

　　对构建的测序文库进行Emulsion PCR，并进行模板富集反应；

　　将所述模板富集反应后的产物进行PGM上机测序；

　　对测序结果进行比对分析，得到微生物的菌种信息。

　　上述16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒及应用，其第一引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第一上游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第一上游特异性序列，第一引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第一下游接头序列以及第一下游特异性序列，第二引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第二上游接头序列以及第二上游特异性序列，第二引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第二下游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第二下游特异性序列，因而，在PCR扩增时，可以将该第一引物组和第二引物组混合，直接进行一步多重PCR扩增，扩增后无需再进行末端修复、加接头等操作及相应的纯化步骤，就可以得到所需要的测序文库，因而可以优化菌种鉴定的过程的复杂度，提高菌种鉴定的效率。

　　附图说明

　　图1为PGM测序部分统计结果。

　　具体实施方式

　　为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

　　除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

　　一实施方式的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统包括第一引物组和第二引物组。其中，第一引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第一上游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第一上游特异性序列，第一引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第一下游接头序列以及第一下游特异性序列；第二引物组中上游引物的序列从5’端至3’端依次为第二上游接头序列以及第二上游特异性序列，第二引物组中的下游引物从5’端至3’端依次为第二下游接头序列、key序列、barcode序列、gap序列以及第二下游特异性序列。

　　在一个实施例中，第一上游接头序列与第二下游接头序列相同；第一下游接头序列与第二上游接头序列相同；第一引物组和第二引物组中的key序列及gap序列均相同。

　　具体地，第一上游接头序列与第二下游接头序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.1所示；第一下游接头序列与第二上游接头序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.2所示；key序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.3所示；barcode序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.99中的任一种；gap序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.100所示。

　　在引物设计时，可以针对16S rDNA高变区(如V3高变区或V4高变区等)的不同目的序列设计第一上游特异性序列、第一下游特异性序列、第二上游特异性序列与第二下游特异性序列。不同目的序列可以使用不同的barcode序列以区分标记。具体地，第一引物组和第二引物组中相同的barcode序列对应的第一上游特异性序列与第二上游特异性序列相同，且相同的barcode序列对应的第一下游特异性序列与第二下游特异性序列相同。如在一个实施例中，第一上游特异性序列、第一下游特异性序列、第二上游特异性序列与第二下游特异性序列为16S rDNA的高变区序列，如第一上游特异性序列与第二上游特异性序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.101所示；第一下游特异性序列与第二下游特异性序列可以是但不限于序列表中SEQ ID NO.102所示。

　　本实施方式还提供了一种16S rDNA微生物菌种鉴定用试剂盒，其包括上述任一实施例的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统。

　　进一步，在一个实施例中，16S rDNA微生物菌种鉴定用试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA浓度测定试剂、多重PCR扩增试剂、扩增产物纯化试剂、Emulsion PCR试剂及模板富集试剂中的至少一种。其中，DNA提取试剂如可以是但不限于与TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)或QIAamp DNA Mini Kit试剂盒中各试剂的组分及配方相同的试剂组合；DNA浓度测定试剂可以是但不限于与dsDNA HS Assay Kit试剂盒中各试剂的组分及配方相同的试剂组合，并配合2.0Fluorometer荧光仪进行荧光检测；多重PCR扩增试剂可以是但不限于与Multiplex PCR Kit试剂盒中各试剂的组分及配方相同的试剂组合；扩增产物纯化试剂可以是但限于XP Reagent试剂盒中各试剂的组分及配方相同的试剂组合；Emulsion PCR试剂与模板富集试剂可采用Ion公司的PGM测序相关试剂组合。

　　本实施方式还提供了一种16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库的构建方法，其使用上述任一实施例的16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统，具体包括如下步骤：

　　步骤S110，提取微生物基因组DNA；

　　步骤S120，以提取的微生物基因组DNA为模板，以含有第一引物组和第二引物组的引物混合物为扩增引物进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；

　　步骤S130，纯化多重PCR扩增产物，得到16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库。

　　在一个具体的实施例中，多重PCR系统中添加有Multiplex GC Enhancer。

　　在另一个具体的实施例中，多重PCR扩增的条件是：先95℃预变性5min；再95℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸60s，共35个循环；再72℃彻底延伸10min；于10℃保温备用。

　　此外，本实施方式还提供了一种16S rDNA微生物菌种鉴定方法，包括如下步骤：

　　使用上述任一实施例的16S rDNA微生物菌种鉴定用测序文库的构建方法构建测序文库；

　　对构建的测序文库进行Emulsion PCR，并进行模板富集反应；

　　将模板富集反应后的产物进行PGM上机测序；

　　对测序结果进行比对分析，得到微生物的菌种信息。

　　在一个具体的实施例中，该鉴定方法基于半导体测序基本原理，先采用PCR扩增技术对16S rDNA的高变区(如V3高变区或V4高变区等)进行一步多重PCR扩增，纯化后完成测序文库的构建；再利用乳液PCR(Emulsion PCR)技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，对测序模板进行富集后将其固定在芯片的微孔中，在微孔中DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原理合成互补链，DNA链每延伸一个碱基便释放一个质子，导致局部pH变化，离子传感器检测pH变化，并将化学信号转换成数字信号，实时判读碱基，最终获得每个DNA片段的碱基序列；最后，利用生物信息学分析把这些序列定位到目的基因组的参考图谱上，与相应的目标区域进行序列比对，并在门、纲、目、科、属水平得出菌种分类结果。

　　更具体地，在测序过程中，使用半导体测序仪Ion Personal Genome Machine(PGM)，通过专有的大规模并行半导体感应器，对于DNA扩增时产生的离子流，实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入Ion Torrent半导体芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系，微体系机械设计和半导体的技术组合，可以快速直接的将遗传信息翻译成数码的DNA测序结果，得到大量高质量的测序数据。

　　以下为具体实施例部分。

　　一、试剂和设备

　　1、DNA提取试剂

　　1.1培养基微生物DNA的提取

　　TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，生产商：天根生化科技(北京)有限公司(货号：DP302)，储存条件：所有试剂室温贮存(15-25℃)，有效期：1年。

　　1.2宫颈拭子样本DNA的提取

　　QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，生产商：QIAGEN(货号：52304/51106)，储存条件：所有试剂室温贮存(15-25℃)，有效期：1年。

　　无水乙醇，生产商：广东光华化学厂有限公司，级别：AR(分析纯)，有效期：3年(开封后6个月)。

　　2、多重PCR扩增试剂

　　Multiplex PCR Kit，生产商：Vazyme，储存条件：-20℃。

　　3、文库构建和测序试剂

　　4、设备

　　4.1 DNA提取相关设备

　　4.2文库构建和测序相关设备

　　二、质控设置

　　1、质控组：

　　阳性质控(Positive Control，POS)：以E.coli DNA为模板，与样本DNA平行实验，每批次1个。

　　阴性质控(Negative Control，NEG)：以Nuclease-free water为模板，与样本DNA平行实验，每批次1个。

　　2、标本及文库定量

　　Qubit-1：采用dsDNA HS Assay Kit，对文库构建前的DNA进行定量；

　　Qubit-2：采用dsDNA HS Assay Kit，对构建好的标本文库(Library)进行定量。

　　3、质控结果判断

　　4、常见问题处理

　　5、质控储存

　　阳性质控：-15～-25℃储存，可将POS质控分装，使用液放置2～8℃储存。

　　阴性质控：-15～-25℃储存，可将NEG质控分装，使用液放置2～8℃储存。

　　每一质控使用期限为半年，半年后该质控需经实验验证是否可用。

　　三、操作步骤

　　1、样本基因组DNA提取

　　1.1菌种来源

　　B群链球菌：临床样本：生殖道分泌物分离纯化培养的菌种；

　　沙门氏菌：临床样本：粪便样本分离纯化培养的菌种。

　　1.2基因组DNA提取

　　1.2.1提取前注意事项

　　若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用。

　　所有的离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心。

　　试剂盒初次使用前向缓冲液GD中加入17ml无水乙醇；漂洗液PW中加入60ml无水乙醇，反复颠倒混匀。

　　1.2.2提取操作流程

　　1)取足量1.5ml的离心管并做好标记，用一次性手术刀片轻刮平板上的菌至对应离心管中。

　　2)每管加入200μl缓冲液GA，充分振荡。

　　3)加入20μl Proteinase K溶液，混匀，加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

　　4)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

　　5)将4)步骤所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，13,400×g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

　　6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，13,400×g离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

　　7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，13,400×g离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

　　8)重复步骤7)。

　　9)将吸附柱CB3放回收集管中，13,400×g离心2min，倒掉废液，吸附柱CB3置于室温放置5min；

　　10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置5min，13,400×g离心2min，完成洗脱。

　　1.2.3磁珠纯化DNA

　　1)取出DNA纯化磁珠，使平衡至室温，使用前充分震荡。

　　2)向上一步的DNA洗脱液中加入100.0μl DNA纯化磁珠(2×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温放置5min。

　　3)置于磁力架上2min，或至溶液澄清，弃上清。

　　4)加入300.0μl新鲜配制的70％乙醇，转动EP管几次，溶液澄清后吸去上清。

　　5)重复步骤4)。

　　6)室温放置5min，挥发酒精(注意：残留酒精会抑制文库的扩增反应)。

　　7)20μl Nuclease-free Water洗脱。

　　1.2.4测定DNA浓度

　　使用dsDNA HS Assay Kit及2.0 Fluorometer测定DNA浓度，具体操作如下：

　　a.按下表比例制备Qubit荧光混合物，充分震荡，微离心；

　　b.分装190.0μl到2个Qubit浓度测定专用管中，标记为S1(Standard 1)、S2(Standard 2)，分别加入10.0μl Standard 1、Standard 2；

　　c.取相应数量的Qubit浓度测定专用管，标记上相应的实验号，gDNA浓度测定：分装199.0μl至各管中，加入1.0μl DNA样本；

　　d.接通2.0Fluorometer电源，选择主界面上的样本类型，如DNA，再选则dsDNA High Sensitivity选项，按提示顺序加入S1、S2测定管及样品管，记录浓度数据。

　　2、多重PCR扩增

　　2.1引物设计

　　如下表所示第一组引物和第二组引物的详细信息：

　　2.2多重PCR扩增步骤

　　2.2.1如下表所示，每种Barcode对应4条引物，将每管引物均稀释至10pM，对应下表中引物名称按照1:1:1:1体积进行混合，并以Barcode号标记。

　　2.2.2 PCR体系配制

　　2.2.3 PCR程序设置

　　2.3 PCR产物纯化

　　a.取出Ampure XP Beads，平衡至室温，使用前充分震荡。

　　b.将扩增产物转移至1.5ml EP管中，并加入50.0μl DNA纯化磁珠(1.0×样本体积)，吹打混匀，室温静置5min。

　　c.EP管置于磁力架上2min，至溶液澄清，弃上清。

　　d.加入300.0μl新鲜配制的70％乙醇，转动EP管几次，溶液澄清后吸去上清。

　　e.重复步骤d。

　　f.室温放置5min，挥发酒精(注意：残留酒精会抑制测序文库的扩增反应)。

　　g.40μl Nuclease-free Water洗脱。

　　2.4 Qubit检测PCR产物浓度(ng/μl)

　　使用dsDNA HS Assay Kit及2.0Fluorometer测定DNA浓度，具体操作如下：

　　a按下表比例制备Qubit荧光混合物，充分震荡，微离心；

　　b.分装190.0μl到2个Qubit浓度测定专用管中，标记为S1(Standard 1)、S2(Standard 2)，分别加入10.0μl Standard 1、Standard 2；

　　c.取相应数量的Qubit浓度测定专用管，标记上相应的实验号，gDNA浓度测定：分装199.0μl至各管中，加入1.0μl DNA样本；

　　d.接通2.0Fluorometer电源，选择主界面上的样本类型，如DNA，再选则dsDNA High Sensitivity选项，按提示顺序加入S1、S2测定管及样品管，记录浓度数据。

　　2.5 Agilent 2100检测产物片段大小

　　主峰片段在180bp左右，符合预期。

　　3、模板制备反应(Emulsion PCR)

　　a.将构建的Library稀释至3ng/ml。

　　b.往两个收集管中各添加150.0μl Breaking solution，放置于仪器相应的位置。

　　c.充分震荡Ion PGMTM Hi-QTM Reagent Mix、Ion PGMTM Hi-QTM ISPs(1min以上)，微离心，迅速吹打几下，加入到反应体系中，Ion PGMTM Hi-QTM Enzyme Mix微离心。

　　d.按以下比例配制油包水PCR的水相。

　　e.充分震荡以上反应体系，微离心，全部吸入到反应槽中。

　　f.再向反应槽中加入1.7ml Reaction Oil，进行油包水PCR反应。

　　g.油包水PCR反应结束后，从One Touch上把两个收集管取出，吸去两收集管中的上清，大概留50.0μl的液体，上下吹打混匀2个收集管中的溶液，并吸到新的1.5ml EP管中。

　　h.加1ml Ion OneTouchTM wash solution到2个收集管中，吹打混匀，把所有的液体转移到EP管中，15,500g离心3min。

　　i.吸去上清，留大概100.0μl的液体。

　　4、模板富集(ES)

　　a.按下表的比例制备Melt-off富集洗脱液。

　　b.充分震荡MyoneTM streptavidin C1Beads，微离心。

　　c.取一个新的1.5ml的EP管，吸取130.0μl MyoneTM Beads wash solution到EP管中，加入13.0μlMyoneTM streptavidin C1Beads，上下吹打几次，震荡微离心，磁力架上放置2min，吸去上清，再往EP管中加入130.0μl MyoneTM Beads wash solution清洗液，震荡微离心。

　　d.取一个8-well strip(如Ion PGMTM template OT2Supplies)，方头放在面朝实验者的左面，圆头在右边，从左至右依次编号1到8，按下表所示加样。

　　e.进行富集反应。

　　f.反应结束后，取出收集管，15,500g，离心2min。

　　g.吸去上清，吸剩15.0μl液体，加入100.0μl Ion OneTouchTM wash solution，上下吹打10次，15,500g，离心2min。

　　h.吸去上清，留下大概15.0μl液体，加入90.0μL Ion OneTouchTM wash solution。

　　i.再往管中加入5.0μl control Ion sphereTM Particles，加入100.0μl Annealing Buffer，上下吹打混匀，15,500g，离心2min。

　　j.吸去上清，吸剩3.0μl(314芯片)/15.0μl(316/318芯片)。

　　k.往管中加入12.0μl Hi-QTMsequencing primer，上下混匀，微离心，总体积为27.0μl。

　　l.在PCR仪中，按以下程序进行：95℃,2min→37℃,2min→25℃保温。

　　m.向PCR管中加入1.0μl(314芯片)/3.0μl(316/318芯片)Ion PGMTM Hi-QTMSequencing Polymerase，室温放置5min，准备loading芯片。

　　5、PGM测序

　　5.1 PGM初始化

　　5.2加载芯片并测序(Loading chip and Sequencing)

　　a.芯片校准(二维码扫描，校准后需氩气吹干)，提前设置Plan。

　　b.吸取30.0μl产物，缓慢加入芯片中，芯片标签向里离心45ec；

　　c.芯片倾斜45度，从加样孔缓慢吸吹多余的液体，芯片标签向外离心45sec；

　　d.芯片倾斜45度，从加样孔缓慢吸吹多余的液体，芯片标签向里离心45sec；

　　e.芯片倾斜45度，吸去多余产物；

　　f.倒转芯片，标签向里，离心3sec；

　　g.把芯片放到PGM上进行测序。

　　四、结果分析

　　1、结果分析采用软件：Ion ReporterTM Software(Version：5.0)。

　　2、IR结果如下表所示。

　　3、IR结果汇总如下表。

　　4、结论分析，见下面两个表。

　　请结合图1，用同样的菌种DNA混合物对B群链球菌(属于链球菌科)和沙门氏菌(属于肠杆菌科)，用不同的Barcode引物扩增，上机测序后，IR系统分析得出的菌种分类结果与所占比例是相符的，结果可信度高，检测效率较之传统有显著提高。

　　以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

　　以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

　　序列表

　　<110> 广州金域医学检验集团股份有限公司

　　广州金域医学检验中心有限公司

　　<120> 16S rDNA微生物菌种鉴定用引物系统、试剂盒和应用

　　<160> 102

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 26

　　<212> DNA