一种单细胞基因表达量检测文库的构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单细胞基因表达量检测文库的构建方法。
背景技术
传统的测序方法，无论是基因芯片，还是二代测序，都需要从超过10万个细胞中提取大量的DNA或者RNA，而提供的信息是大量细胞的平均值。RNA测序(RNA-seq)已成为生物学和医学不可或缺的工具，RNA序列信息作为机体基因在转录水平的表征，为疾病诊断分析和基因治疗等方法应用提供了重要支持。单细胞基因测序是指在单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞基因测序，认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。
而对某一类甚至某一个细胞的基因表达量进行研究，更加有助于我们理解细胞的功能，变异，起源等方面，因此需要建立单细胞基因表达量检测文库。
发明内容
针对现有技术存在的空白，本发明提供一种单细胞基因表达量检测文库的构建方法，目的是利用单个细胞中少至pg级别的RNA起始量来，采用链特异性和转座结合的方式构建文库，对特定细胞的特定基因的表达量进行检测，从而把基因测序应用到了单个细胞层面，可以对某一类甚至某一个细胞的基因表达量进行研究，更加有助于我们理解细胞的功能，变异，起源等方面。
实现本发明目的的单细胞基因表达量检测文库的构建方法按照以下步骤进行：
(1)通过流式细胞仪分拣出单个细胞，置于Lysis Buffer缓冲液中，单个细胞裂解释放RNA；
(2)在含有单细胞的Lysis Buffer缓冲液中直接加入第一链合成所需逆转录组分，逆转录合成First-Strand cDNA；
(3)在步骤(2)后直接在上步体系中加入扩增体系；
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行PCR产物纯化；
(5)在步骤(4)后加入转座体系，进行转座和加接头；
(6)在步骤(5)后对转座产物进行纯化；
(7)在步骤(6)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大；
(8)在步骤(7)后加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
其中，所述的细胞包括体外培养细胞，各种组织细胞以及体液中的游离细胞，细胞的物种来源包括人类、大鼠、小鼠。
所述的RNA量低至单细胞级或pg级别。
所述的Lysis Buffer缓冲液的主要成分包括：SDS，NP-40，PMSF，NaCl，EDTA，Tris-HCl。
所述的逆转录组分包括：缓冲液，dNTPs，逆转录酶，RNase抑制剂和引物，其中引物包括逆转录引物和模板跳转引物，如逆转录引物SC-RT-T30和模板跳转引物SC-TSO-GC3G，在加入前在72℃变性3min，逆转录引物5’端为测序引物序列，3’端为oligodT引物序列，oligo dT引物序列长度为20-60nt；模板跳转引物5’端为测序引物序列，3’端为跳转引物序列，跳转引物序列3’端含有3-10nt长度的序列，跳转序列碱基是DNA、RNA或DNA与RNA的嵌合，跳转序列碱基需修饰，所述的修饰包括甲基化修饰、氨基化修饰、磷酸化修饰、硫代修饰、C3Spacer修饰。
所述的扩增体系包括缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs以及一对上下游引物。
所述的转座体系包括LM Buffer，TN5转座复合体和cDNA，转座所需条件是55℃，15min，其中TN5转座复合体包含TN5转座酶，引物SC-TN5-ADT2和SC-TN5-CORE。
所述的PCR扩增体系包括缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs以及一对上下游引物，其中上游引物TN5-INDEX，5’端为P7接头序列，3’端为特异性引物序列，下游引物TS-Primer1，5’端为P5接头序列，3’端为特异性引物序列。
所述的上机文库大小在400-700bp。
所述的上机文库，用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、Oxford Nanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
(1)本发明提供了一种单细胞转录组文库构建方法，可应用于不同类型的测序平台，文库构建起始量极低，为单个细胞的核酸量，可以针对单个细胞进行基因表达量的研究。
(2)本发明从细胞裂解到预文库PCR结束均在一管中完成，出错率得到显著降低，可以有效避免操作污染，缩短操作步骤，提高文库构建效率。
(3)本发明整个文库构建流程短，操作简单，耗时短，成本低。
(4)本发明有利于实现自动化操作和大规模文库集中构建。
(5)本发明方法的实验结果重复性好，构建的单细胞转录组文库质量高。
(6)本发明提供的建库方法，可以用于不同的测序平台，适用性广，易于推广。
附图说明
图1是本发明的单细胞基因表达量检测文库的构建原理图；
图2是本发明的单细胞基因表达量检测文库的构建流程图；
图3是本发明实施例1中2％琼脂糖凝胶电泳检测文库结果图；
其中：M:100bp DNA ladder(宝生物工程(大连)有限公司)；1：实验组构建的单细胞转录组文库；2：对照组构建的单细胞转录组文库。
具体实施方式
本发明实施例以Illumina平台为例，结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
本实施例采用乳腺癌患者正常组织细胞(实验组)和癌变组织细胞(对照组)进行单细胞转录组文库构建及测序分析，如图1和图2所示，具体按照以下步骤进行：
(1)乳腺癌患者癌变组织细胞和正常组织细胞的单细胞分离，通过流式细胞仪进行单细胞的分离并置于装有5μL Lysis Buffer的PCR管中，混匀，冰上放置10-20min；
(2)在步骤(1)的PCR管中直接加第一链合成所需逆转录组分，逆转录合成First-Strand cDNA；
具体是，逆转录组分加入前需要先进行引物变性，步骤(1)的PCR管中加入表1反应体系，热循环仪72℃处理3min，立即置冰上；
表1变性反应体系
变性反应结束后，直接加入表2逆转录反应体系，混匀，室温放置10min，热循环仪中42℃反应90min；
表2逆转录反应体系
(3)在步骤(2)后直接在上步体系中加入表3的扩增体系进行预文库扩增；
表3预文库扩增反应体系
PCR扩增程序：
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行PCR产物XP Beads纯化，具体是用10mM Tris-HCl将PCR产物补足至50μL，加入40μL AMPure XP beads，混匀并室温静置5min。反应管置于磁力架上，静置3-5min。弃上清，加200μL 80％乙醇进行洗脱，重复2～3次，用25μL10mM Tris-HCl进行洗脱。取2μL进行Qubit定量，取5μL进行2％琼脂糖凝胶电泳，140V，25min；
(5)在步骤(4)后加入转座体系，进行转座和加接头，具体是：
配制表4反应体系，混匀，热循环仪中55℃反应15min。结束后马上加入20μL ddH2O吹打混匀终止反应；
表4转座反应体系
(6)在步骤(5)后对转座产物进行纯化，具体是按照QIAquick PCR Purification Kit(250)(QIAGEN，28106)试剂盒说明书进行纯化；
(7)在步骤(6)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大，具体是：
表5 PCR反应体系
PCR扩增程序：
4℃forever；
(8)在步骤(7)后加入磁珠，按照步骤(4)的步骤对扩增后的文库进行XP Beads纯化，纯化后的产物即为上机文库。
对上机文库进行质检和测序，具体是：
按照KAPA Library Quantifcation Kit(Kapabiosystems,Cat No.KK4854)说明书进行操作，使用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪检测，参照试剂盒里的标准品进行文库浓度的绝对定量，结果如表6所示。
表6 qPCR检测结果
结果显示，构建的文库达到上机要求浓度，可用于上机测序。
按照NextSeq测序仪操作流程进行文库变性、稀释以及测序，测序结果如表7所示。
表7测序数据结果
结果显示患者癌变组织细胞的HEPN1基因表达量显著低于正常组织细胞。
采用2％琼脂糖凝胶电泳检测文库，根据电泳分析结果(图3)，文库主带清楚且主要分布在500bp左右，条带亮度明亮，与预期结果一致。
实施例2：
本实施例通过实时荧光定量PCR-TaqMan探针法对该乳腺癌患者样本核酸进行检测，以验证实施例1的测序结果。
(1)对实施例1中的乳腺癌患者正常组织(实验组)和癌变组织(对照组)分别进行RNA提取。
(2)分别采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisher，货号：K1622)和TaqManUniversal MasterMixⅡwith UNG(Applied Biosystems，货号：1605043)进行cDNA合成和PCR反应。
(3)采用Roche Light Cycler 480实时荧光定量PCR仪进行扩增和荧光检测。
采用2-△△Ct对结果进行分析
表8 Q-PCR数据分析结果
结果显示患者癌变组织细胞的HEPN1基因表达量显著低于正常组织细胞，其结果与构建的单细胞转录组文库测序结果一致。
