一种PLS3-ABD2重组蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及PLS3-ABD2重组蛋白的制备。
背景技术
肌动蛋白成束蛋白PLS3是Plastin蛋白家族中的一员，又被称为T-plastin，基因定位于Xq23，mRNA蛋白质编码区(Coding sequence,CDS)包括1893个核苷酸，蛋白由630个氨基酸组成。它可以与α、β、γ三种肌动蛋白结合，并在多种实体组织细胞中表达，在外周血中不表达。PLS3在肿瘤发生和发展过程中扮演着重要角色。研究表明，PLS3能调控调控细胞运动、肿瘤细胞的存活和迁移，并能调控肿瘤细胞对顺铂等化疗药物或UV的敏感性。除此之外，PLS3可能是一种潜在的肿瘤标志物：它的异常表达可以作为皮肤T细胞淋巴瘤的标志物；结直肠癌循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)中PLS3的表达与结直肠癌患者的远端转移和预后相关。综上所述，PLS3与肿瘤的发生发展密切相关，而明确PLS3在肿瘤发生发展中的功能，对肿瘤的诊断、治疗及预后均具有非常重要的意义。
尽管PLS3有非常重要的作用，但PLS3蛋白的制备方法仍然存在问题。PLS3蛋白由EF-2hands和4个CH(Calponin-homology)结构域组成，其中CH3和CH4为主要的功能结构域，二者称为ABD2(Actin-binding domain 2)。商品化的PLS3蛋白大多是ABD2的重组蛋白，该结构域存在多个保守位点，是PLS3抗体的主要靶向结构域。商品化的PLS3蛋白多为原核表达系统所表达的，缺乏真核系统蛋白合成过程的天然修饰。原核表达系统所表达的重组蛋白可能在空间构象等方面与真核系统表达的PLS3蛋白存在差异，为后续用于与PLS3蛋白相互作用的蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽筛选带来困难。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种PLS3-ABD2重组蛋白的制备方法，使得采用该方法制备得到的PLS3-ABD2重组蛋白，相比现有技术(原核表达)而言，由真核细胞可以形成稳定的二硫键，在蛋白翻译后进行正确的修饰，所产生的外源蛋白质更具有天然活性而不是被降解或者形成包涵体，在活性方面远胜于原核表达系统，更接近于天然蛋白质，可为后续用于与PLS3蛋白相互作用的蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽筛选奠定基础。
目前商品化的PLS3蛋白多为原核表达系统所表达的，缺乏真核系统蛋白合成过程的二硫键和糖基化修饰，空间结构上与天然PLS3蛋白存在较大差异。而在进行与PLS3蛋白相互作用的蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽筛选过程中，一些保守位点由于天然PLS3蛋白的空间结构的存在而被折叠在蛋白内部，所以很难筛选到与这些位点结合的蛋白或者多肽。但由原核表达系统所得到的蛋白，由于缺少复杂的糖基化修饰，部分结合位点被错误的暴露出来，对相互作用的蛋白筛选和特异性结合的多肽筛选造成了困扰。而本发明所提供的方法，能够高效表达PLS3-ABD2蛋白以外，能够对表达的蛋白进行正确折叠，并进行复杂的糖基化修饰，蛋白活性接近于天然蛋白，因此在用于与PLS3蛋白相互作用的蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽筛选具有一定优势。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种PLS3-ABD2重组蛋白的制备方法，所述方法包括：将含有SEQ ID NO.4所示序列的DNA分子克隆至真核表达载体，并将所述真核表达载体转染至真核宿主细胞系中进行培养。
本发明通过采用真核表达载体和真核宿主细胞系，使得所产生的外源蛋白质更具有天然活性而不是被降解或者形成包涵体，在活性方面远胜于原核表达系统，更接近于天然蛋白质，可为后续用于与PLS3蛋白相互作用的蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽筛选奠定基础。
进一步地，所述真核表达载体包括但不限于pIRES2-ZsGreen1、pcDNA3.1、pEGFP或pCMV7.1等。
将所述DNA分子克隆至真核表达载体的过程可采用本领域常用的克隆方法，例如，利用酶切位点酶切连接等。
更进一步地，本发明优选所述真核表达载体为pIRES2-ZsGreen1质粒。所述pIRES2-ZsGreen1质粒含有IRES元件，将多克隆位点隔开，可以构建同时表达两个基因的重组质粒。当采用该质粒转染真核细胞时，目的基因与报告基因ZsGreen1共转录为一个mRNA，但分别翻译，既能监测是否转染成功，又避免报告基因蛋白影响目的基因蛋白的结构和功能；ZsGreen1是亮度最高的绿色荧光蛋白，适合流式细胞仪以及其他荧光筛选；pIRES2-ZsGreen1质粒为高拷贝质粒，含有筛选基因Neo基因，能够用于筛选表达PLS3蛋白的稳定细胞系。因此本发明优选采用pIRES2-ZsGreen1载体来进行PLS3-ABD2片段的构建，相比其他真核表达载体更具优势。
作为一种示例性说明，本发明针对利用pIRES2-ZsGreen1质粒构建表达PLS3-ABD2的真核表达载体的方案，提供一种具体的构建方法：
(1)以公开号为CN107446949A的中国专利申请中所构建的PLS3重组蛋白真核表达质粒为模板，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物，引入酶切位点和6×His片段，构建酶切位点为EcoRI-His-PLS3-ABD2-BamHI的cDNA片段(SEQ ID NO.3)；
(2)分别对pIRES2-ZsGreen1质粒和步骤(1)所述cDNA片段进行EcoRI和BamHI双酶切，然后将酶切后的cDNA片段克隆至pIRES2-ZsGreen1质粒，构建得到可表达PLS3-ABD2的真核表达载体，命名为pIRES2-ZsGreen1-His-PLS3-ABD2真核表达质粒。
进一步地，通过将上述表达PLS3-ABD2的真核表达载体转化感受态大肠杆菌，利用大肠杆菌自身机制进行质粒的扩增，可制备出大量真核表达质粒。
进一步地，所述真核宿主细胞系包括但不限于CHO-K1、293T、MCF-7、T-24等。
将所述真核表达载体转染至真核宿主细胞系的过程可采用本领域常用的转染方法。例如，使用Lipo2000将表达PLS3-ABD2的真核表达载体转染至真核宿主细胞系中，转染6小时后换液，转染48小时后收集细胞。
更进一步地，本发明优选所述真核宿主细胞系为CHO-K1细胞系。所述CHO-K1细胞系相对于其他真核宿主细胞系，具有目的蛋白表达水平高，杂蛋白较少，更利于获得纯度较高的目的蛋白的优点。
进一步地，在将所述真核表达载体转染至真核宿主细胞系中进行培养后，所述PLS3-ABD2重组蛋白的制备方法还包括对PLS3-ABD2重组蛋白的纯化。
为了便于对PLS3-ABD2重组蛋白进行纯化，在构建前述真核表达载体时，优选在重组蛋白的编码基因前加入His-tag(6×His片段)，即，将SEQ ID NO.3所示序列的DNA分子或含有SEQ ID NO.3所示序列的DNA分子克隆至真核表达载体。
在真核表达载体转染真核宿主细胞系后，所述重组蛋白纯化具体包括如下步骤：
(1)收集培养后的真核宿主细胞并进行裂解：
收集培养后的真核宿主细胞，加入裂解液，反复冻融后，离心取上清液，过滤后加入裂解液稀释，得到细胞裂解液。
作为优选，当所述真核宿主细胞系为CHO-K1细胞系时，将转染后的CHO-K1细胞在37℃恒温细胞培养箱中培养48小时以后，倒掉培养基加入PBS清洗残余的培养基，加入裂解液(300mM NaCl，20mM咪唑，20mM PB，pH7.0)，然后使用刮刀收集细胞到离心管中；于液氮和37℃水浴锅中反复冻融三次；将反复冻融后的液体于4℃，2000rpm，离心5min；离心后的上清液经0.22μm的滤膜过滤后加入10μL裂解液稀释，即制成初步的细胞裂解液。
(2)初步纯化：
使用镍-琼脂糖凝胶柱将上述细胞裂解液中所含的带His-tag的PLS3-ABD2重组蛋白进行分离纯化。
作为优选，使用镍-琼脂糖凝胶柱(Ni-NTA Resin)对细胞裂解液中所含的带His-tag的PLS3-ABD2重组蛋白进行分离纯化，具体操作如下：
装柱：重悬介质，根据待纯化蛋白量，将适量介质加入层析柱，静置；
平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱；
上样：样品缓冲液应尽可能与平衡缓冲液一致，为避免堵塞层析柱，样品应经离心或使用0.45μm过滤器过滤；
洗涤：上样完毕后，用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液；平衡缓冲液配方：300mM NaCl，20mM咪唑，20mM PB，10mM Tris base，pH7.0。收集到的流出液进行SDS-PAGE电泳验证，确定目的蛋白在哪一条件下有较高的纯度，为后续二次纯化奠定基础。
洗脱：用平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑，进行梯度洗脱。
(3)二次纯化：
将步骤(2)的纯化产物使用液相色谱仪进行二次纯化，得到纯化的PLS3-ABD2重组蛋白。
作为一种示例性说明：使用Waters e2695液相色谱仪(Alliance)进行二次纯化，纯化步骤依据仪器说明书进行。收集15min-18min的流出液，经液相验证，得到单一峰，经Western blot和质谱验证为PLS3-ABD2重组蛋白。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
针对肌动蛋白成束蛋白PLS3蛋白的385-629位氨基酸，提供一种相对简便的、真核表达系统的方法制备PLS3-ABD2重组蛋白，然后纯化获得其单一蛋白，通过Western Blot实验进行验证，得到纯化的PLS3-ABD2重组蛋白。
本发明提供一种PLS3-ABD2重组蛋白，其是针对PLS3蛋白质的385-629位氨基酸进行制备并纯化的蛋白质，其制备过程主要是构建PLS3-ABD2重组蛋白的真核表达载体，转入真核宿主细胞，使用镍-琼脂糖凝胶柱和液相色谱仪分离并纯化PLS3-ABD2重组蛋白，并通过Wesern Blot进行验证。纯化后的PLS3-ABD2重组蛋白可用于与PLS3蛋白相互作用蛋白筛选以及与PLS3蛋白特异性结合的多肽的筛选。
附图说明
图1为真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-His-PLS3-ABD2的质粒图谱。
图2为实施例1中扩增的PLS3-ABD2cDNA片段的电泳结果；其中，Ladder:2000bp DNA Marker。
图3为本发明实施例1中用EcoR I和BamH I双酶切构建的pIRES2-ZsGreen1-His-PLS3-ABD2真核表达载体的电泳结果；其中，M:5000bp DNA Marker；1:质粒双酶切的样品。
图4为本发明实施例1中挑出的单菌落进行菌落PCR，得到的电泳结果；其中，Ladder:2,000bp DNA Marker。
图5为本发明实施例2中筛选出的带有荧光蛋白报告基因的质粒转染CHO-K1细胞系48h后，在荧光下激发绿色荧光。
图6为经Ni-NTA Resin初步纯化后，Western blot验证的结果。
图7为Alliance液相色谱仪分析初纯样品的结果。
图8为转染PLS3-ABD2质粒的总蛋白质Western blot检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中采用的主要试剂、仪器：
主要试剂：CHO-K1细胞系；DME/F-12(Hyclone)；FBS(Gibco)；pIRES2-ZsGreen1(Yrbio)；大肠杆菌DH5α(天根生化有限公司)；DL5000(天根生化有限公司)；质粒小量提取试剂盒(天根生化有限公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化有限公司)；DL2000(Takara)；限制性内切酶EcoR I(Takara)；BamH I(Takara)；T4连接酶(Takara)；DNA聚合酶(Takara)；QIAquick PCR Purification kit(MN)；咪唑(阿拉丁)；琼脂糖(Biowest)；胰蛋白胨(Oxide)；酵母提取物(Oxide)；NaCl(阿拉丁)；卡那霉素(Coolaber)；Gelred(BIOTIUM)；逆转录试剂盒(Roche)；Ni-NTA RESIN(TRAN)；NaH2PO4·12H2O(Amresco)；Tris(Amresco)。
主要仪器：37℃恒温振荡培养箱(太仓市科教仪器厂)；热循环仪(Thermo Fisher)；微型台式漩涡振荡器(VORTEX)；37℃恒温培养箱(太仓市科教仪器厂)；水平电泳仪(Bio-Rad)；凝胶成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司)；紫外分光光度计(MALCOM，e-spect)；Waters e2695液相色谱仪(Alliance)；生物超净台(北京东联哈尔仪器)；细胞培养箱(Thermo Fisher)。
实施例1 His-PLS3-ABD2融合蛋白的制备方法
1.实验方法
(1)PLS3真核表达质粒的构建
根据公开号为CN107446949A的中国专利申请中所构建的PLS3重组蛋白真核表达质粒为模板，根据PLS3基因序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5358)，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物，加入酶切位点和6×His片段，构建酶切位点为EcoR I-His-PLS3-ABD2-BamH I的cDNA片段；然后通过酶切酶联反应，将获得的cDNA片段克隆至pIRES2-ZsGreen1质粒，构建成pIRES2-ZsGreen1-His-PLS3-ABD2真核表达质粒；
A)PCR扩增体系如下：
B)PCR程序如下
98℃预变性4min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
C)琼脂糖凝胶电泳
称取0.5g琼脂糖溶于50mL的1×TAE电泳缓冲液，配制成1％(g/mL)的琼脂糖凝胶溶液，于微波炉中加热3min后加入5μL的GelRed(美国BIOTIUM公司),混合均匀。然后倒入放好梳子的凝胶槽中凝固20min以上，然后将凝胶槽放入含1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，依次加入DNA ladder和样品。电泳电压调至80V，30min。使用凝胶成像仪进行拍照。并在紫外灯下观察电泳条带，根据片段大小来判断扩增产物是否为所要片段。
D)PCR产物的纯化
使用试剂盒QIAquick PCR Purification kit纯化从PCR反应得到的单、双链DNA片段。按PCR样品与PB buffer 5：1的比例加入PB buffer，并混匀。将QIAquick吸附柱放入2mL收集管中。样品加入吸附柱中，12,000g离心1min。弃掉滤过的液体，加入0.75mL PE buffer至柱中，离心1min。弃掉滤过液，再离心1min，开盖室温放置10min至吸附膜变干。将QIAquick柱放至新的1.5mL离心管中，加入30μL水至QIAquick膜上，放置1min，12,000g离心1min。可于-20℃保存。
E)酶连接反应，反应体系如下
DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍范围内。常温下连接5-6h。
F)转化
将酶连产物加入50μL DH5α菌液中，轻轻旋转混匀。所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。冰浴中放置30min。在42℃热休克45s，迅速转移到冰浴中。冰浴静置2min，该过程不要摇动离心管。加入不含卡那霉素的LB培养基500μL，在37℃恒温培养箱中于150rpm/min振摇1h，目的是使菌体复苏，使质粒上相关抗性标记基因表达。取100-200μL培养液加到含卡那霉素(100μg/mL)的LB琼脂平板上，用无菌的三角涂布棒轻轻地将细胞均匀涂开。将平板置于室温，直到液体被吸收，晾干平板。在37℃倒置培养10-16h，观察是否长出抗性菌落；时间不能过长，否则会出现卫星菌落。
G)菌落PCR
采用牙签法挑菌落。在含氨苄的LB琼脂平板反面用marker笔划出16个正方小格，作为备用。PCR反应体系总体积为10μL，PCR小管中提前加入5.5μL灭菌水，用高温高压灭菌的牙签轻挑平板上的单克隆菌落，在一个正方小格的固体培养基上轻划斜线，而后在PCR小管中轻转牙签尖头，即完成一个菌落的挑选工作。在PCR小管中再加入0.5μL primer和5μL primer STAR Hs。(PCR程序参考步骤B)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳条带，根据片段大小判断该菌落是否为目的菌落。用牙签在阳性PCR对应的菌落小格表面轻轻挑菌，加到适量的含卡那霉素的液体培养基中做质粒提取准备。然后依照质粒提取试剂盒说明书提取质粒
I)酶切验证
配制双酶切体系如下：
进行琼脂糖电泳，根据DNA ladder的条带指示，判断酶切产物的条带是否与与目的条带吻合。
(2)PLS3蛋白的真核表达
取无抗生素培养24h后的CHO-K1细胞，细胞汇合度载70％左右，进行转染。取两只1.5mL的无菌离心管，一个管中取3μg质粒于200μL不含血清和抗生素的DME/F-12培养基中，混匀；另一支离心管加入7.5μg质粒和200μL不含血清和抗生素的DME/F-12培养基中，混匀；静置5min后将两支离心管中的液体混匀，静置20min。然后从细胞培养箱中取出事先准备好的细胞，弃去原来的培养基，使用PBS清洗后，加入5mL的无血清培养基，然后将之前混匀静置的液体加入。37℃细胞培养箱中静置6h后，细胞换液，加入10mL含血清的培养基。然后在细胞培养箱中培养48h后，使用荧光显微镜观察细胞转染效率。如图5可以观察到PLS3-ABD2质粒的成功转染和表达。
(3)PLS3蛋白的纯化
A)制备细胞裂解液
转染后的CHO-K1细胞弃去培养基，加入1mL裂解液(300mM NaCl，20mM咪唑，20mM PB，pH7.0)，然后使用刮刀收集细胞到1.5mL离心管中；于液氮和37℃水浴锅中反复冻融三次；将反复冻融后的液体于4℃，2000rpm，离心5min；离心后的上清液经0.22μm的滤膜过滤后加入10μL裂解液稀释，即制成初步的细胞裂解液。
B)PLS3-ABD2重组蛋白的纯化
使用Ni-NTA Resin对步骤A)所得细胞裂解液中所含的带His标签的PLS3-ABD2重组蛋白进行分离纯化。装柱：重悬介质，根据待纯化蛋白量，将适量介质加入层析柱，静置；平衡：用5-10倍柱体积平衡缓冲液平衡层析柱；上样：样品缓冲液应尽可能与平衡缓冲液一致，为避免堵塞层析柱，样品应经离心或使用0.45μm过滤器过滤；洗涤：上样完毕后，用5-10倍柱体积平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液；洗脱：用平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑，进行梯度洗脱。
平衡缓冲液配方：300mM NaCl，20mM咪唑，20mM PB，10mM Tris base，pH7.0。
C)经Ni-NTA Resin初纯后，使用Alliance液相色谱仪进行纯化，纯化步骤依据仪器说明书进行。收集15min-18min的流出液，经液相验证，得到单一峰，经Western blot和质谱验证为PLS3-ABD2重组蛋白。
2.实验结果与分析
拟构建的质粒图谱如图1所示，命名为pIRES2-ZsGreen1-PLS3-ABD2。扩增得到的PLS3-ABD2cDNA目的条带约在750bp左右，取前沿最亮条带进行切割(图2)。切割后的胶进行胶回收。胶回收后的cDNA片段与pIRES2-ZsGreen1质粒进行EcoR I和BamH I双酶切。双酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，切胶回收，然后二者以一定比例进行酶连接。连接产物转化DH5α感受态，将菌液均匀涂抹含有卡那霉素的平板，次日挑取单克隆，进行菌落PCR实验。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳条带，该片段大小约为200bp，与目的条带吻合(图4)。接下来，采用双酶切的方法进行验证。根据DNA ladder的条带指示，检测有两条主带，分别在5000bp和800bp左右，与PLS3-ABD2cDNA的条带和pIRES2-ZsGreen1空载质粒条带的片段吻合。酶切验证通过后，进行一代双向测序，检测结果表明与序列SEQ ID NO.3相一致。由此本发明成功构建pIRES2-ZsGreen1-PLS3-ABD2的真核表达质粒。
pIRES2-ZsGreen1载体中含有IRES元件，将多克隆位点隔开，可以构建同时表达两个基因的重组质粒。当采用该质粒转染真核细胞时，目的基因与报告基因ZsGreen1共转录为一个mRNA，但分别翻译，既能监测是否转染成功，又避免报告基因蛋白影响目的基因蛋白的结构和功能；ZsGreen1是亮度最高的绿色荧光蛋白，适合流式细胞仪以及其他荧光筛选；pIRES2-ZsGreen1质粒为高拷贝质粒，含有筛选基因Neo基因，能够用于筛选表达PLS3蛋白的稳定细胞系。因此本发明中采用pIRES2-ZsGreen1载体来进行PLS3-ABD2片段的构建，相比其他真核载体更具优势。分别对CHO-K1细胞系转染2μg、4μg质粒，通过比较荧光强度，可以发现4μg质粒转染细胞效率更高(图5)。
对转染该质粒后的CHO-K1细胞系，用Cell Lysis buffer进行温和的细胞裂解，将裂解后的上清液过装有Ni-NTA的镍柱，通过改变洗脱液中咪唑的浓度，分离并纯化PLS3-ABD2蛋白。如图6所示，转染目的质粒后的CHO-K1细胞系表达的PLS3-ABD2蛋白量更大；而经Ni-NTA Resin初步纯化后，200mM洗脱液洗脱时，大部分杂蛋白已去除，只剩下目的条带和70KD左右的杂蛋白。接下来将200mM洗脱液经Alliance液相色谱仪进行纯化，纯化步骤依据仪器说明书进行。收集15min-18min的流出液，经液相验证，得到单一峰(图7)。经Western blot和质谱验证为PLS3-ABD2重组蛋白。
实施例2 pIRES2-ZsGreen1-PLS3-ABD2在CHO-K1细胞系中过表达
为了检测实施例1中构建的真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-PLS3-ABD2是否能够成功表达His标签和PLS3蛋白，本发明采用Western blot的方法检测融合蛋白的表达情况。
1.实验材料
主要试剂：
蛋白质预染Marker：美国Fermentas公司；抗体信息如下：anti-PLS3(Santa Cruz,CA,USA)；细胞裂解液和His-Tag(Cell Signaling Technology)；β-Actin(博奥易杰公司)；PVDF和ECL发光液购自Millipore；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)；Protease Inhibitor Cocktail(Calbiochem)。
主要仪器：
凝胶成像仪和垂直电泳仪均购自Bio-rad。
2.实验方法
(1)转染CHO-K1细胞
转染方法如实施例1中方法所示，分别用空载和构建的PLS3-ABD2质粒转染CHO-K1细胞系。转染细胞培养48h后，提取总蛋白。
(2)蛋白含量的测定
A)取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管标准蛋白(30mg,BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即分装于-20℃长期保存。
B)取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)，配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
C)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μL。
D)各孔加入200μL BCA工作液，37℃放置20-30分钟后测定。测定时，采用酶标仪，在570nm处测量各孔OD值，绘制标准曲线，计算蛋白含量，根据实验需要分装蛋白样品，并保存在-80℃冰箱中备用。
(3)Western blot
A)用预冷的1×PBS冲洗细胞样品，加入适量的细胞裂解液，裂解液中按1:100加入蛋白酶抑制剂。立即用细胞刮刀刮下细胞使其与裂解液充分混合，冰浴30min。裂解后，于4℃，12,000rpm离心15min，收集上清于新的EP管中。用BCA试剂盒测定蛋白含量。将样品与5×上样缓冲液按1:4混合，煮沸10min，离心取上清。总蛋白的上样量为15μg。用移液枪吸取处理好的样品，缓慢加至加样孔内。开始电泳，待样品完成浓缩步骤，由80V调至120V。
B)电泳结束后，转膜。剪取对应大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡1min，再置于蒸馏水中。凝胶要尽量放正，用玻璃棒去除气泡(小心操作，注意勿将凝胶弄碎)。根据蛋白marker判断上样的顺序，并将PVDF膜完全覆盖于凝胶上，剪去一角作为标记。转印膜上依次叠放浸润好的三层滤纸和一层海绵，合上转膜夹。整个过程应避免引入气泡。根据目的蛋白性质设定转膜电流及转膜时间，开始转膜，一般转膜时间为在200mA下转膜2h。
C)配制5％脱脂奶粉封闭，摇床孵育0.5h以上或孵育过夜。根据蛋白marker指示的分子量，裁剪PVDF膜。PVDF膜放入杂交袋中，加入用1％BSA稀释好的一抗溶液，4℃摇床过夜或常温下2h。次日用PBST冲洗3次，每次10min。之后加入用1％BSA稀释好的二抗溶液(稀释比例为1:3000)，摇床孵育1h。PBST冲洗3次，每次10min。膜上滴加ECL发光液，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统凝胶成像仪捕获图像。
3.实验结果与分析
转染CHO-K1细胞48h后，提取蛋白，检测蛋白含量。根据蛋白浓度调整样品上样量，进行Western blot实验，分别用anti-His(购自Cell Signaling Techonology，12698)和anti-PLS3抗体(购自Santa Cruz Biotechnology,sc-166208)进行检测。结果如图8所示，在内参β-Actin表达量一致的情况下，与空载组相比，PLS3组成功高表达His标签和PLS3蛋白，表明质粒构建并转染成功。表达的His标签蛋白条带在28KD左右，与PLS3-ABD2蛋白条带大小一致，表明PLS3-ABD2重组蛋白能够成功表达。
实施例3 PLS3-ABD2蛋白高亲和性肽段的筛选
1.实验材料
主要试剂：N-甲基吗啉、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、六氢吡啶(北京化工厂)，Fmoc保护氨基酸(上海吉尔生化有限公司)，TentaGel树脂(Rapp Polymere)，磁性微球(天津倍思乐色谱技术开发中心)，链霉素(Gbicol)；
主要仪器：
高效液相色谱仪(Waters e2695)，基质辅助激光解离-飞行时间-质谱(MALDI-TOF-MS，BIFLEX III,Bruker Daltonics Inc.德国)。
2.实验方法
A)肽库合成
使用Tentagel树脂作为固相载体进行多肽库的合成。取150mg的树脂，使用DMF溶胀树脂30min，然后用DMF清洗三遍树脂；脱保护，加入20％的六氢吡啶，常温摇床上10min进行脱保护；检验脱保护，使用DMF和DCM交替清洗，共清洗6遍，最后一遍一定用DMF清洗，取少量树脂于1.5ml的PE管，加入维生素C、笨醛、茚三酮各一滴，然后于沸水中煮沸30s，观察树脂是否变色，若变色，则说明树脂脱保护成功；脱保护完成后，依次按顺序加入Fmoc保护氨基酸，常温摇床上2-3h；使用DMF清洗3遍，再次进行脱保护检验，若树脂不变色，说明氨基酸已经连上；连上氨基酸后进行脱保护以及下一个氨基酸的连接，重复以上步骤，直到最后一个氨基酸；最后一个氨基酸脱保护后，开始收缩氨基酸，先用DMF清洗3遍，再用DCM清洗3遍，甲醇清洗3遍，抽干后即可将树脂取出，保存在-20℃。
B)PLS3特异性多肽筛选及质谱鉴定
使用ChromaLink Biotin Labeling Kit生物素标记试剂盒标记PLS-ABD2重组蛋白；同时使用PBS溶胀多肽库2h并清洗3次；用5％脱脂牛奶封闭肽珠非特异性位点，37℃，混悬仪旋转孵育2h后用PBS清洗3次；加入2ml链霉亲和素标记的蛋白，37℃混悬仪上孵育1h；在显微镜下挑取有结合的肽珠，然后进行二级质谱测序，最后用Mascot软件解谱得到多肽序列。
3.实验结果预期
筛选到与PLS3-ABD2特异性结合的多肽，从细胞水平和动物水平进行验证。
对比例1
本对比例分别采用本领域常用的真核宿主细胞293T替换实施例1中的CHO-K1细胞系，将实施例1构建得到的pIRES2-ZsGreen1-His-PLS3-ABD2真核表达质粒分别转染到上述不同的真核宿主细胞系中，并采用与实施例1相同的纯化方法分离纯化PLS3-ABD2重组蛋白。
通过比较目的蛋白初次纯化后的Western Blot结果，如图6所示，由实验结果可知，将可表达PLS3-ABD2重组蛋白的真核表达载体转染至CHO-K1细胞系，相对于转染至其他真核宿主细胞系，具有目的蛋白表达量较高，杂蛋白相对较少的优势。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种PLS3-ABD2重组蛋白的制备方法
<141> 2018-05-03
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaattcat gcatcatcac catcatcata accaggatat 40
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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gaaactcgtg aagaaagaac cttccgtaac tggatgaact ctcttggtgt caatcctcac 120
gtaaaccatc tctatgctga cctgcaagat gccctggtaa tcttacagtt atatgaacga 180
attaaagttc ctgttgactg gagtaaggtt aataaacctc catacccgaa actgggagcc 240
aacatgaaaa agctagaaaa ctgcaactat gctgttgaat tagggaagca tcctgctaaa 300
ttctccctgg ttggcattgg agggcaagac ctgaatgatg ggaaccaaac cctgacttta 360
gctttagtct ggcagctgat gagaagatat accctcaatg tcctggaaga tcttggagat 420
ggtcagaaag ccaatgacga catcattgtg aactgggtga acagaacgtt gagtgaagct 480
ggaaaatcaa cttccattca gagttttaag gacaagacga tcagctccag tttggcagtt 540
gtggatttaa ttgatgccat ccagccaggc tgtataaact atgaccttgt gaagagtggc 600
aatctaacag aagatgacaa gcacaataat gccaagtatg cagtgtcaat ggctagaaga 660
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aaccaggata ttgactggac tctattagaa ggagaaactc gtgaagaaag aaccttccgt 60
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