MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测方法
技术领域
本发明涉及生物领域，特别是涉及MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测。
背景技术
人脑胶质瘤是一种常见的原发性恶性颅内肿瘤。化疗是治疗脑胶质瘤的一种方法。肿瘤对化疗的耐受是影响化疗效果的重要因素之一。DNA修复酶——O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA-transferase，MGMT)在胶质瘤组织中的表达与肿瘤的耐药性相关，MGMT基因启动子的甲基化程度是决定MGMT表达量的主要因素，可能影响病人的化疗效果及其预后。MGMT启动子的甲基化程度越高，对化疗药物的敏感度越好。
MGMT启动子甲基化多发生于MGMT启动子区的CpG岛。MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测，一直以来都是在重亚硫酸盐（bisulfite）转化样本DNA后，通过各种分子生物学技术手段来获得结果的。其中，主要的检测方法有以下几种。
甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法。MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，将所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变；然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物，并进行聚合酶链扩增反应(PCR)；最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法的优点是灵敏度较高，应用范围广。缺点是：（1）实验条件要求高，对操作的要求高；（2）电泳分析通量低，且容易分辨不清甲基化和非甲基化扩增片段的区别；（3）检测的CpG位点少，只能定性，不能精确确定甲基化CpG的比例。
亚硫酸氢盐处理后测序（bisulfite sequencing PCR，BSP）方法是将重亚硫酸盐处理的DNA直接用特异引物扩增，引物设计在非CpG区，按C-U/T的序列来设计。BSP法主要用于发现甲基化位点分布，不能直接看电泳结果，需要通过一代测序鉴定序列，而一代测序一次只能鉴定一个克隆，无法一次解析出生物体内的甲基化程度比例。
改进的BSP法使用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)。由于C-U/T的变化改变了序列的Tm值，这样可以通过实时荧光定量PCR仪和SYBgreen染料法，来分析最终扩增产物的Tm值。甲基化程度越高，C的含量越高，则Tm值就越高，可以实现快速半定量的甲基化程度分析。该方法的缺点是，扩增容易受到气溶胶污染的影响，非特异扩增容易改变实际的甲基化比例结果，且不能知道特定甲基化位点的比例，或单拷贝的甲基化连锁情况。
焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序技术本身可以检测并定量甲基化水平上的细微改变。该方法在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例，因此不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。但该方法存在以下缺点：（1）单次检测通量为24个样本，带标准品时就只能检测22个样本；（2）由于测序读长质量的限制，一次只能检测4个CpG位点；（3）不能分辨单拷贝的基因组DNA分子上的CpG位点的甲基化组合，只能混合分析一个样本CpG甲基化程度的百分比。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测方法，它可以全面、可靠、快速地定量检测MGMT启动子区CpG岛的甲基化比例。
为解决上述技术问题，本发明的MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测方法，步骤包括：
1）用重亚硫酸盐转化DNA；
2）对步骤1）所得重亚硫酸盐转化后的DNA，使用建库正向引物和建库反向引物，进行PCR扩增并建库；
3）对步骤2）所得扩增产物进行纯化，获得甲基化检测文库；
4）对步骤3）所得文库进行定量，并进行二代测序，获得MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度数据。
所述建库正向引物的序列结构为：第一测序接头+Index序列+上游特异引物，所述建库反向引物的序列结构为：第二测序接头+下游特异引物。其中，上游特异引物和下游特异引物可以靶向捕获MGMT启动子的甲基化特异检测区。该上游特异引物和下游特异引物的序列分别为：
上游特异引物: GATATGTTGGGATAGTT（SEQ ID NO:1）
下游特异引物: CCCAAACACTCACCAAAT （SEQ ID NO:2）
所述第一测序接头和第二测序接头的序列分别为：
第一测序接头：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG（SEQ ID NO:3）
第二测序接头：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT （SEQ ID NO:4）
所述Index序列为标识序列，用于区分不同的样本。该序列可以是一段10～12nt的已知可变序列。
上述步骤2），扩增反应体系优选为：5X 热启动Taq反应缓冲液5µl、10mM dNTPs 0.5µl、10µM建库正向引物0.5µl、10µM建库反向引物0.5µl、热启动Taq DNA聚合酶0.2µl、重亚硫酸盐转化后的DNA 5µl、无核酸酶水13.3µl，总体积25µl。扩增反应条件优选为：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃复性15s，68℃延伸30s，共35个循环；68℃后延伸5min；4℃保持。
上述步骤4），可以获得MGMT启动子区12个CpG位点的甲基化程度数据。
本发明要解决的技术问题之二是提供用于上述检测方法的建库引物对。该建库引物对包括建库正向引物和建库反向引物。其中，建库正向引物中包含有一段序列如SEQ ID NO:1所示的上游特异引物序列；建库反向引物中包含有一段序列如SEQ ID NO:2所示的下游特异引物序列。
进一步的，所述建库正向引物中还包含有序列如SEQ ID NO:3所示的测序接头和前述Index序列，所述建库反向引物中还包含有序列如SEQ ID NO:4所示的测序接头。
与现有检测方法相比，本发明的MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测方法，具有以下优点和有益效果：
1．检测位点多，一次可以检测12个CpG位点，远远多于经典的焦磷酸测序方法，对甲基化程度的判断更全面可靠；
2．建库快速简便，检测时间短；本发明的方法可以快速靶向捕获MGMT启动子甲基化特异检测区，在一次扩增重亚硫酸盐转化的样本DNA的同时，合并完成建库；重亚硫酸盐转化后的DNA，只需3小时即可获得测序文库，整个检测时间只需1～2天；
3．单次检测通量高；本发明使用高通量二代测序检测CpG甲基化程度，一次建库测序可以检测大于96个样本；
4．可分辨每个基因组拷贝来源的分子上，12个CpG的甲基化图谱（即每个单分子上，12个CpG甲基化组合情况），这是焦磷酸测序方法所无法分辨的；
5．仪器设备简单，成本低；本发明的方法只需要高通量二代测序仪即可实现，不需要使用专门的PCR仪或焦磷酸测序仪，也不需要特殊的试剂盒。
附图说明
图1是人HCT116 DKO甲基化DNA测序片段。
图2是人HCT116 DKO非甲基化DNA测序片段。
具体实施方式
为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、检测区域
本发明共检测MGMT启动子区的以下12个CpG位点（GRCh37(hg19)）：
chr10:131265493-131265495；
chr10:131265495-131265497；
chr10:131265506-131265508；
chr10:131265513-131265515；
chr10:131265518-131265520；
chr10:131265521-131265523；
chr10:131265525-131265527；
chr10:131265535-131265537；
chr10:131265537-131265539；
chr10:131265542-131265544；
chr10:131265547-131265549；
chr10:131265553-131265555。
二、引物的设计
根据重亚硫酸盐转化DNA后，胞嘧啶（C）会变为胸腺嘧啶（T）的特点，本发明设计特异引物序列如下：
上游特异引物: GATATGTTGGGATAGTT（SEQ ID NO:1）
下游特异引物: CCCAAACACTCACCAAAT （SEQ ID NO:2）
另外，设计用于NGS高通量测序的建库测序接头的序列如下：
第一测序接头：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG（SEQ ID NO:3）
第二测序接头：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT （SEQ ID NO:4）
最终的建库测序引物的序列结构为：
建库正向引物：第一测序接头+Index+上游特异引物
建库反向引物：第二测序接头+下游特异引物
其中，Index为一段10-12nt的可变的已知序列，用于区分不同的样本。
实施例1 MGMT启动子区12个CpG甲基化程度检测
1．重亚硫酸盐转化DNA
取样本DNA 200ng，使用EZ-96 DNA Methylation-Lightning™ MagPrep（zymo research，D5046）进行重亚硫酸盐转化，并纯化。
本实施例选用zymo research公司的Human Methylated & Non-methylated DNA Set（D5014）作为标准品进行检测，该标准品包含人HCT116 DKO非甲基化DNA（阴性标准品）和人HCT116 DKO甲基化DNA（阳性标准品）。阴性标准品和阳性标准品分别进行重亚硫酸盐转化。
2．取上述重亚硫酸盐转化后的DNA，使用上述建库正、反向引物进行PCR扩增。扩增反应体系和反应条件分别如表1、表2所示：
表1 PCR扩增反应体系
表2 PCR扩增反应条件
3．纯化
在上述扩增后得到的PCR产物中加入25µl无核酸酶水，再加入Agencourt® AMPure® XP 40µl，吸打混匀5次，室温静置5min后，将反应管置于磁架上，静止2min或待溶液澄清，转移上清至一个新的离心管中。
在上清中加入20µl Agencourt® AMPure® XP，吸打混匀5次，室温静置5min后，将离心管置于磁架上，静止2min或待溶液澄清，弃去上清，避免碰触磁珠。向离心管中加入200µl新鲜配置的80%乙醇，贴着磁架轻轻地上下移动离心管来清洗磁珠，然后吸去上清；重复这一清洗磁珠的步骤一次，并确保所有的80%乙醇都被吸去。然后将离心管保持在磁架上，室温干燥3min后，从磁架上取下，加入52µl无核酸酶水，旋涡振荡混匀，短暂离心后，放置在磁架上静置2min，待溶液澄清后，吸取50µl上清至新的反应管。
在上清液中加入50µl Agencourt® AMPure® XP，吸打混匀5次，室温静置5min后，将反应管置于磁架上，静止2min或待溶液澄清，弃去上清，避免碰触磁珠。向反应管中加入200µl新鲜配置的80%乙醇，贴着磁架轻轻地上下移动下反应管来清洗磁珠，然后吸去上清；重复这一清洗磁珠的步骤一次，并确保所有的80%乙醇都被吸去。然后将反应管保持在磁架上，室温干燥3min后，从磁架上取下，加入50µl无核酸酶水，旋涡振荡混匀，短暂离心后，放置在磁架上静置2min，待溶液澄清后，吸取上清至新的反应管。上清液中即为制备好的MGMT甲基化检测文库。
4．测序检测
将上述制备得到的MGMT甲基化检测文库，用Qubit 2.0定量后，使用Ion S5 XL进行二代测序，测序片段分布如图1和图2所示。通过数据过滤比对，获得12个CpG的平均甲基化百分比，如表3所示。其中，阳性标准品甲基化程度为97.6%，阴性标准品甲基化程度为2.8%。可见，用本实施例的方法可以有效地定量检出MGMT启动子区的甲基化程度数据。
表3 测序结果
序列表
<110> 领星生物科技（上海）有限公司
上海领安生物科技有限公司
启东领星医学检验所有限公司
<120> MGMT启动子区CpG岛的甲基化程度检测方法
<130> LHJ-NP-18-100031
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatatgttgg gatagtt 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaaacact caccaaat 18
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctctctatg ggcagtcggt gat 23
