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通过程序化细胞收缩折叠生物组织

2021-04-08 07:41:16

通过程序化细胞收缩折叠生物组织

  背景技术

  活组织的特征在于细胞层和细胞外基质(ECM)。层之间的界面通常折叠成更复杂的形貌,例如乳房的腺泡、大脑皮层的折叠、真皮表皮交界处以及肠的隐窝和绒毛。对于在体外产生可以折叠成三维形式的组织存在相当大的兴趣,并且可以用作组织体外折叠的模型。

  发明内容

  本公开提供了用于产生组织的方法和系统,所述组织被配置用于基于收缩性细胞在组织中的放置而折叠成三维形式。收缩性细胞在组织中的定位决定了组织折叠成的三维形状。因此,在一些实施方案中,通过本文教导的方法和系统产生的组织折叠成预定的3D形式,其由组织中存在的收缩性细胞的图案决定。

  本公开的方法包括结合收缩性细胞作用于其上的纤维设置收缩性细胞的图案,从而允许将所得组织折叠成3D形式。

  在某些方面,本文公开的方法包括在包括纤维基质(例如细胞外基质(ECM))的层上设置收缩性细胞的图案,并通过收缩性细胞作用在ECM中存在的纤维上折叠该层。

  本发明公开的方法还包括产生三维组织,其包括设置在纤维基质内的收缩性细胞的图案。在一些实施方案中,三维组织基于收缩性细胞在纤维基质中的放置而折叠成各种形状。

  还提供了使用本文公开的方法和系统产生的3D组织。

  在某些方面,制造配置用于折叠成三维形状的平面生物组织的方法包括在基底表面上图案化收缩性细胞,包括在基底表面上设置核酸图案;和在杂交条件下使图案化的核酸与收缩性细胞的悬浮液接触,其中收缩性细胞包含与图案化的核酸互补的细胞表面附着的核酸,并且其中细胞表面附着的核酸与图案化的核酸杂交,在基底表面上产生图案化的收缩性细胞;使基底表面上的图案化的收缩性细胞与包含纤维的聚合物基质接触,从而将图案化的收缩性细胞嵌入聚合物基质中;从基底表面除去聚合物基质,其中图案化的收缩性细胞在移除时保留在聚合物基质中,从而产生配置用于折叠成三维形状的平面生物组织;使平面生物组织与培养基接触;并且将平面生物组织在培养基中悬浮孵育一段时间,该时间足以使收缩性细胞作用于纤维上,以将组织折叠成三维形状。

  在某些方面,在基底表面上图案化收缩性细胞包括在第一基底的第一表面和第二基底的第一表面上设置核酸图案,其中第一基底的第一表面与第二基底的第一表面通过第一和第二基底之间的间隙间隔开,并且其中表面彼此面对面配置;和在杂交条件下使图案化的核酸与收缩性细胞的悬浮液接触,其中收缩性细胞包含与图案化的核酸互补的细胞表面附着的核酸,并且其中细胞表面附着的核酸与图案化的核酸杂交,以在第一基底的第一表面和第二基底的第一表面上产生图案化的收缩性细胞;其中去除聚合物基质包括从第一和第二基底之间移除聚合物基质,从而产生平面生物组织,其包括在平面生物组织的顶表面和底表面上的图案化的收缩性细胞。

  在某些实施方案中,平面生物学可包括含有聚合物基质和细胞图案的区域和含有没有细胞的聚合物基质的区域,并且其中将平面生物组织在悬浮液中孵育以将组织折叠成三维形状包括将含有聚合物基质和细胞图案的区域与没有细胞的聚合物基质的区域分离并且孵育含有聚合物基质和细胞图案的区域。

  在某些实施方案中,核酸的图案是二维的。在某些实施方案中,该方法包括将聚合物基质溶解在三维形状中以产生包含纤维和收缩性细胞的三维形状。

  在某些实施方案中,核酸图案可包括具有相同核苷酸序列的单个核酸群。在某些实施方案中,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列。在某些实施方案中,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列,其中每个群的核酸在基底表面上是唯一可寻址的。在某些实施方案中,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列,其中每个群的核酸在第一和/或第二基底的第一表面上是唯一可寻址的。在某些实施方案中,收缩性细胞的悬浮液包含两种或更多种独特的收缩性细胞群,其中每个收缩性细胞群包含与图案中的核酸群之一互补的表面附着的核酸。

  在某些情况下,设置包括在基底上印刷包括核酸的液体。在某些情况下,细胞表面附着的核酸包含附着于核酸的脂质部分,该表面附着的核酸通过将脂质部分插入收缩性细胞的质膜而附着于收缩性细胞。在某些情况下,细胞表面附着的核酸包含脂质部分和核酸之间的间隔区。在一些情况下,从基底表面除去聚合物基质包括将聚合物基质暴露于核酸酶。

  在一些方面,纤维提供在细胞外基质(ECM)中。在一些实施方案中,ECM是合成的或从生物来源获得。在一些方面,ECM由细胞系分泌。在一些方面,纤维包含胶原蛋白。在某些情况下,胶原蛋白是合成的。

  在一些实施方案中,制备被配置用于折叠成三维形状的平面生物组织的方法包括在基底上设置包含纤维的聚合物层;在聚合物层上图案化收缩性细胞,使得收缩性细胞在聚合物层上以彼此间隔开的方式设置;和在足以允许收缩性细胞粘附到聚合物层的条件下在聚合物层上孵育收缩性细胞,从而产生生物组织,该生物组织被配置用于通过在聚合物层中收缩性细胞作用纤维上而折叠成三维形状。

  在一些实施方案中,收缩性细胞在聚合物层的第一表面上图案化,并且该方法还包括在聚合物层的第二表面上图案化收缩性细胞,其中第二表面与第一表面相对,其中收缩性细胞在聚合物层上以彼此间隔开的方式设置。在某些实施方案中,第一表面上的收缩性细胞的图案相对于第二表面上的收缩性细胞的图案偏移。在某些实施方案中,第一表面上的收缩性细胞被图案化成圆形形状,并且第二表面上的收缩性细胞被图案化成直径大于所述圆形形状的环。

  在某些实施方案中,在第一表面上图案化的收缩性细胞的数量和在与第一表面相对的第二表面上图案化的收缩性细胞的数量可以是相似的,例如,细胞的数量可以具有0.75∶1至1∶0.75的比率。例如,在第一表面上图案化的收缩性细胞的数量和在第二表面上图案化的收缩性细胞的数量可以具有0.75∶1、0.80∶1、0.9∶1、1∶1、1∶0.9、1∶0.8或1∶0.75的比率。

  在一些情况下,图案化包括以间隔开的方式在聚合物层上印刷收缩性细胞。在一些情况下,图案化包括在聚合物层上以间隔开的方式微动吸移收缩性细胞。

  在一些情况下,该方法包括将生物组织在培养基中悬浮孵育并将平面生物组织折叠成三维形状。

  在某些实施方案中,图案化包括设置包含单一类型的收缩性细胞的收缩性细胞群。在一些情况下,图案化包括设置包含两种或更多种类型的收缩性细胞的收缩性细胞群。在其他情况下,图案化包括设置第一图案的第一类型的收缩性细胞群和第二图案的第二类型的收缩性细胞群。

  在另一方面,公开了一种用于生成被配置用于折叠成预定形状的三维(3D)组织的方法。在某些情况下,该方法包括将收缩性细胞和纤维的混合物设置在基底上以形成包含收缩性细胞和纤维的3D结构;和在细胞培养条件下将所述结构在培养基中孵育,以将结构折叠成预定形状。

  在一些情况下,该方法包括在孵育之前将纤维溶液设置在所述结构上。在一些方面,该方法包括在孵育之前重复将收缩性细胞和纤维的混合物和/或纤维溶液设置在所述结构上。在一些方面,该方法包括在孵育之前从基底移除所述结构。在某些情况下,设置包括印刷,例如3D打印。在某些情况下,设置包括挤出。

  本文还提供了用于产生平面生物组织的系统,所述平面生物组织被配置用于折叠成三维形状。在一些情况下,所述系统包括以图案设置在基底的表面上的核酸群;包含与核酸群互补的细胞表面附着核酸的收缩性细胞群,其中细胞群通过表面附着核酸与核酸群杂交而附着于核酸群;和包含纤维的聚合物基质。

  在一些情况下,第一基底与第二基底间隔开,其中第一基底的第一表面处于与第二基底的第一表面相对的配置,其中核酸群以图案设置在第一和第二基底的第一表面上。

  在另一方面,一种用于产生平面生物组织的系统,所述平面生物组织被配置用于折叠成三维形状,所述系统包括聚合物层,所述聚合物层包括设置在所述聚合物层的表面上的包含纤维的层;和收缩性细胞群。

  在另一方面,一种用于产生平面生物组织的系统,所述平面生物组织被配置用于折叠成三维形状,包括聚合物层,所述聚合物层包括设置在所述聚合物层的顶表面和底表面上的包含纤维的层;和收缩性细胞群。在某些实施方案中,纤维提供在细胞外基质中。

  也公开了一种工程化的三维(3D)生物组织,其包括预定图案的收缩性细胞,其中预定图案的收缩性细胞确定3D生物组织的形状。在某些情况下,生物组织仅包含一种类型的收缩性细胞。在某些情况下,生物组织仅包含两种类型的收缩性细胞。在某些实施方案中,所述一种类型的收缩性细胞包含成纤维细胞。在某些实施方案中,所述两种类型的收缩性细胞包括成纤维细胞和上皮细胞。在某些情况下,生物组织的图案包括间隔开的收缩性细胞簇。在一些实施方案中,每个簇包含5-100个收缩性细胞。在一些实例中,每个簇包含5-50个收缩性细胞。在其他方面,每个簇包含5-10个收缩性细胞。在一些情况下,生物组织包括预定浓度的纤维。在一些实施方案中,生物组织缺乏血细胞、脂肪细胞和神经细胞中的一种或多种。在某些实施方案中,生物组织缺乏红细胞和免疫细胞中的一种或多种。

  在一些方面,收缩性细胞选自:成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑细胞、心肌细胞、其祖细胞及其组合。

  在一些方面中,所述聚合物基体可以是水凝胶、藻酸盐、聚己内酯(PCL)、明胶、琼脂糖、或纤维素聚合物。在一些情况下,纤维包含胶原蛋白或纤连蛋白。胶原蛋白可以是合成的或从生物来源获得。

  在某些情况下,通过约束生物组织的一部分使得该部分不经历折叠,可以诱导使用本文公开的方法产生的生物组织折叠成预定形状。

  附图说明

  图1是描绘平面外曲率和其测量值的示意图。

  图2是描绘与平面形状形成对比的三维形状的曲率的示意图。

  图3示出了对齐的胶原蛋白区域处于张力下。在形成条带后组织对之间的凝胶的激光显微切割产生了与垂直于条带的区域的缩回和远离组织的对照区域相比凝胶表面的显着更高的缩回距离。

  图4示出了通过间充质凝聚(mesenchymal condensation)机制重构组织折叠。

  图5示出了重构系统表现出间充质凝聚的特征并沿着可预测的轨迹折叠。

  图6示出了组织界面处的ECM张力导致内陷或外翻,这取决于层力学的差异。

  图7示出了通过DNA编程细胞组装(DPAC)的微流体整合的重构组织制造。

  图8示出了通过非接触式细胞印刷的重构组织制造。

  图9说明细胞簇是各向同性吸引物,其以依赖于细胞类型的速率径向排列胶原蛋白。

  图10示出了细胞簇对在几百微米的距离上放大它们之间的胶原蛋白纤维排列。

  图11示出了重构组织曲率的速率由致动细胞对凝胶施加应变的速率确定。

  图12示出了各向同性的重构组织遵循单调曲率轨迹。

  图13描绘了在消融致动器细胞之后仅部分展开的重构组织。

  图14描绘了各向异性折叠的保真度受到可收缩簇迁移的限制。

  图15描绘了间充质凝聚足以将组织界面雕刻成不同的3D形式。

  图16示出了卷曲、管和波纹重构组织的截面分析。

  图17示出了双帽、球形、立方体和Miura重构组织的截面分析。

  图18示出为在重构组织中相对的折叠对于弹出通过缺陷是稳固的。

  图19示出了间充质凝聚驱动的组织折叠对于复杂折叠附近的多种细胞类型的同时自组装是稳固的。

  图20示出了乘客HUVEC沿着新生折叠表现出偏向的运动性。

  图21示出在生物曲率的位点(在肠道绒毛和鸡皮芽处)在体内间充质细胞凝聚与类似胶原蛋白1压实和对准相关联,如在本文提供的重构组织模型生成的。

  具体实施方式

  本公开提供了用于产生组织的方法和系统,所述组织被配置用于折叠成三维形式。本发明利用收缩性细胞用于折叠组织成三维形状。该方法包括结合纤维基质设置收缩性细胞的图案,收缩性细胞作用于纤维基质上,以通过收缩性细胞作用在纤维上产生组织和折叠组织。还提供了使用本文公开的方法和系统产生的3D组织。

  在描述本发明的示例性实施方案之前,应当理解,本发明不限于描述的具体实施方案,因为其当然可以改变。也应理解,本文使用的术语仅仅为了描述具体实施方案的目的,并且不旨在是限制性的,因为本发明的范围仅仅由所附的权利要求限制。

  在提供值的范围时,应理解,除非上下文明确另外指出,该范围的上限和下限之间的至下限十分之一单位的每个中间值也具体地公开。在所述范围内的任何所述值或中间值与所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个较小范围包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在所述范围内,并且在较小的范围内包括任一界限、不包括两个界限或包括两个界限的每个范围也包括在本发明内,遵从该叙述的范围中任何具体排除的界限。在叙述的范围包括一个或两个界限时,排除了那些包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本发明内。

  除非另外限定,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于实施或测试本发明,但是一些潜在的和示例性的方法和材料现在可以被描述。本文提及的任何和所有公开案均以引用的方式并入本文中,从而公开和描述与所引用公开案相关的方法和/或材料。应当理解,在有矛盾的情况,本公开取代并入的出版物的任何公开内容。

  必须注意,除非上下文另外明确规定,否则如本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。因此,例如,提及“膜锚定的多核苷酸”包括多个这样的膜锚定的多核苷酸,并且提及“多核苷酸”包括提及一个或多个多核苷酸,等等。

  应进一步注意,权利要求书可被撰写为排除任何任选的元素。因而,此陈述旨在用作与权利要求元素的引述结合使用使用如“仅仅(solely)”、“仅(only)”及其类似术语等此类排他性术语或使用“负性”限制的引用基础。

  本文论述的出版物仅仅提供其在本申请的申请日之前的公开内容。不应将本文中的任何内容理解为承认所本发明无权因为在先发明而占先于这类公开案。另外,所提供的公开日期可不同于可能需要独立确认的实际公开日期。在这些出版物可能列出与本公开的明确或隐含定义相冲突的术语的定义的情况,以本公开的定义为准。

  当阅读了本公开,对本领域技术人员显而易见,本文描述和阐释的每个单个实施方案具有分开的组分和特征,其可容易与任何其他数个实施方案的特征分开或结合,而不背离本发明的精神或范围。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。

  定义

  术语“膜表面附着的核酸”、“膜锚定的多核苷酸”、“脂质-DNA”和类似术语包括通过任何方式附着到插入膜中的疏水、亲脂或两亲部分的寡核苷酸或多核苷酸,无论“膜锚定的多核苷酸”或其部分是否实际插入膜中。寡核苷酸或多核苷酸也可以通过与存在于膜中的胺的NHS-酯反应和与糖萼的双正交化学反应附着至细胞的膜,并因此可以不包括疏水的、亲脂性、或两亲性区域用于插入膜。多核苷酸可以通过任何可靠的方法附着到玻璃基底的表面上。附着于玻璃基底表面的多核苷酸可任选地包括疏水、亲脂或两亲区域。

  术语“膜”或任何类似的术语在这里被广义地并且一般地用来指任何含脂膜、细胞膜、单层、双层、泡囊、脂质体、脂质双层等,并且本发明并不意味着限于任何特定膜。

  术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”的特定使用绝不应视为限制性的,并且可在本文中互换使用。当相关核酸分子通常包含少于约100个碱基时,使用“寡核苷酸”。当相关核酸分子通常包含超过约100个碱基时,使用“多核苷酸”。这两个术语用于表示DNA、RNA、修饰或合成的DNA或RNA(包括但不限于包含合成和天然存在的碱基类似物、双脱氧或其他糖、硫醇或其他非天然或天然聚合物骨架的核酸),或其他含核碱基的聚合物。因此,该术语不应解释为限定或限制本文提及和使用的核酸的长度。

  本公开的多核苷酸可以是单链、双链、三链,或包括这些构象的组合。通常,多核苷酸含有磷酸二酯键,但在一些情况下,如下所述,包括可具有交替骨架的核酸类似物,包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基磷酰胺键和肽核酸骨架和键。其他类似物核酸包括吗啉代,以及具有正骨架、非离子骨架和非核糖骨架的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内。可以进行核糖-磷酸主链的这些修饰以促进添加其他部分(例如标记),或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。

  术语“核酸序列”或“多核苷酸序列”是指连续的核苷酸碱基串,并且特别地,上下文还指核苷酸碱基在多核苷酸中出现时彼此相对的特定位置。

  术语“互补”或“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如,序列“5′-AGT-3′”与序列“5′-ACT-3′”互补。互补性可以是“部分的”,其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配,或者核酸之间可以存在“完整”或“完全”互补性。核酸链之间的互补程度影响在限定条件下核酸链之间杂交的效率和强度。

  如本文所用,术语“杂交(hybridize)”和“杂交(hybridization)”用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度)受诸如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严格性和所形成的杂交体的Tm等因素的影响。“杂交”方法涉及将一种核酸退火至另一种互补核酸,即具有互补核苷酸序列的核酸。

  “在杂交条件下”是指允许特异性杂交的条件。互补序列的长度、二级结构和GC含量影响获得靶位点与靶核酸的特异性杂交所必需的杂交条件的热熔点Tm。

  术语“热熔点”、“熔融温度”或“Tm”在本文中指的是这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下),其中50%与靶标互补的探针与靶序列平衡杂交(因为靶序列过量存在,在Tm,50%的探针在平衡时被占据)。在一些情况下,术语“Td”用于定义至少一半探针与完全匹配的靶核酸解离的温度。

  在相应核苷酸之间具有所有完美形成的氢键的双链体分子的形成被称为“匹配的”或“完全匹配的”,并且具有不对应的单对或几对核苷酸的双链体被称为“错配”。在适当的实验条件下,单链RNA或DNA分子的任何组合可以形成双链体分子(DNA:DNA、DNA:RNA、RNA:DNA或RNA:RNA)。

  短语“选择性杂交”或“特异性杂交”是指当该序列存在于复杂混合物中时(例如总细胞或文库DNA或RNA),在严格杂交条件下,分子仅与特定核苷酸序列结合、双链体化或杂交。

  本领域普通技术人员将容易认识到,可以利用替代的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件,并且将认识到参数的组合比任何单个参数的测量重要得多。

  术语“荧光团”是指能够吸收第一波长的能量并在不同的第二波长重新发射能量的任何分子实体。示例性荧光团包括但不限于CAL Fluor Red 610(FR610;Biosearch Technologies,Novato,CA),异硫氰酸荧光素,荧光素,罗丹明和罗丹明衍生物,香豆素和香豆素衍生物,花青和花青衍生物,Alexa Fluors(Molecular Probes,Eugene,OR),DyLight Fluors(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)等。

  术语“双层”是指一种“夹心状”结构,其由两亲脂质分子(通常磷脂)组成,被布置为两个分子层,在内表面具有疏水尾部,在外表面具有极性头基。

  术语“单层”是指由两亲性分子的分子层限定的结构,其中头基在一侧富集并基本上对齐,疏水基团富集在并且基本上在相对侧。

  术语“生理条件”意指涵盖与活细胞相容的那些条件,例如与活细胞相容的温度、pH、盐度等的主要水性条件。

  如本文所用的,术语“测定”、“测量”、“评估”、“估计”和“分析”可互换使用并包括定量和定性测定。

  在核酸或氨基酸序列同一性的背景中使用的术语“基本上相似”是指具有至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的序列同一性的两种或更多种序列。

  如本文所用,“%序列同一性”使用可从欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)获得的EMBOSS成对比对算法工具确定,该研究所是欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分。可以通过在“ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/”前面放置“www.”找到的网站访问此工具。该工具使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453;Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison,在D.Sankoff和J.B.Kruskal,(编辑),Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,第1-44页Addison Wesley。使用默认设置,包括Gap Open:10.0和Gap Extend 0.5。默认矩阵“Blosum62”用于氨基酸序列,默认矩阵“DNAfull”用于核酸序列。

  在整个本公开中,用于描述“表面附着的核酸”或“膜锚定的多核苷酸”的命名法如下。首先,常规名称用于化合物的某些膜锚定部分,例如二烷基磷酸甘油酯和单烷基酰胺。第二,为了便于描述,可以使用以下缩写:FACS,荧光激活细胞分选;DNA,脱氧核糖核酸;DIFO,二氟环辛炔;NHS,N-羟基琥珀酰亚胺;PEG,聚乙二醇;MFI;中值倍数荧光增加;dT,脱氧胸苷;MEF,小鼠胚胎成纤维细胞;PBS,磷酸盐缓冲盐水;TEAA,乙酸三乙铵;HPLC,高压液相色谱;P/I,佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和离子霉素;FITC,异硫氰酸荧光素。

  如本文所用,术语“纤维”是指合成或天然存在的聚合物(例如蛋白质或糖蛋白),其为纤维状并且由收缩性细胞的动作机械地致动。纤维的长度可以变化,这取决于使含有纤维的溶液退火以产生更长纤维的时间量。示例性纤维包括胶原蛋白和纤连蛋白。纤维基质是指纤维的支架,其为可能存在于基质中的任何细胞提供结构支持。

  如本文所使用的,术语“细胞外基质”或ECM是指水和纤维(例如,其被机械地通过收缩性细胞的作用致动的多肽)的混合物。纤维在ECM中被组织,以提供在结构上支撑可存在于ECM中的任何细胞的支架。

  方法

  本公开提供了用于产生组织的方法,其编程用于折叠成三维形式,其中三维形式的形状基于组织中收缩性细胞的图案。组织的定向折叠由组织中收缩性细胞的位置控制。该方法包括将收缩性细胞的图案设置在包括纤维的表面上,所述纤维在收缩性细胞的作用下机械致动并且通过纤维上的收缩性细胞的作用折叠表面。该方法还包括产生三维组织,该三维组织包括设置在纤维基质内(并且可选地在其表面上)的收缩性细胞图案。基于收缩性细胞在三维组织内(并且如果存在的话,在三维组织上)的放置,可以将三维组织折叠成各种形状。

  在某些实施方案中,本公开提供了用于制造平面生物组织的方法,其编程用于折叠成三维形状。该方法可以包括通过在基底表面上设置核酸图案来图案化基底表面上的收缩性细胞;在杂交条件下使图案化的核酸与收缩性细胞的悬浮液接触,其中收缩性细胞包含与图案化的核酸互补的细胞表面附着的核酸,并且其中细胞表面附着的核酸与图案化的核酸杂交,在基底表面上产生图案化的收缩性细胞;使基底表面上的图案化的收缩性细胞与包含纤维的聚合物基质接触,从而将图案化的收缩性细胞嵌入聚合物基质中;从基底表面除去聚合物基质,其中图案化的收缩性细胞在移除时保留在聚合物基质中,从而产生编程用于折叠成三维形状的平面生物组织。该方法可以进一步包括在悬浮培养物中培养平面生物组织,从而诱导平面生物组织折叠成三维形状。

  在某些实施方案中,在基底表面上图案化收缩性细胞可包括在第一基底的第一表面和第二基底的第一表面上设置核酸图案,其中第一基底的第一表面与第二基底的第一表面通过第一和第二基底之间的间隙间隔开,并且其中表面彼此面对面配置;在杂交条件下使图案化的核酸与收缩性细胞的悬浮液接触,其中收缩性细胞包含与图案化的核酸互补的细胞表面附着的核酸,并且其中细胞表面附着的核酸与图案化的核酸杂交,以在第一基底的第一表面和第二基底的第一表面上产生图案化的收缩性细胞;其中去除聚合物基质包括从第一和第二基底之间移除聚合物基质,从而产生平面生物组织,其具有在平面生物组织的顶表面和底表面上的图案化的收缩性细胞。

  在某些实施方案中,该方法还包括使平面生物组织与培养基接触和在细胞培养条件下孵育以及折叠平面生物组织成三维形状。在某些实施方案中,平面生物组织在非粘附条件下培养,例如,使用不具有粘附表面的容器,使得平面生物组织不附着于容器表面。在某些实施方案中,平面生物组织在将平面生物组织保持在培养基中的容器中自由浮动。

  在某些实施方案中,在已经产生包含收缩性细胞的平面生物组织之后,可以从平面生物组织移除包含图案化收缩性细胞的聚合物基质的区域。例如,本方法可用于在连续的聚合物基质平面层上产生多个单独的收缩性细胞图案。随后可以移除多个单独的收缩性细胞图案,例如,将其剖开以产生单独的平面生物组织片。可以使用任何合适的方法进行剖开,例如手术工具(活组织检查穿孔器、刀片等)或通过激光显微切割术。

  在图4A中描绘了用于产生被配置用于折叠成3D形式的平面生物组织的示例性系统。图4A中描绘的系统可用于在平面聚合物层的单侧(一个表面)上产生包含细胞的平面聚合物层。图4B描绘了从平面生物组织中去除含有图案化收缩性细胞的各个聚合物层片。

  用于产生配置用于折叠成3D形式的合成平面生物组织的另一示例性系统在图5A中示出。图5A中描绘的系统可用于在平面聚合物层的第一表面和与第一表面相对的第二表面上(例如顶表面和底表面)产生包含细胞的聚合物层。图5B示出了使用图5A中描绘的方法在包含纤维的聚合物的连续平面层上产生多个单独的收缩性细胞图案。将含有纤维和细胞的平面聚合物从图5A所示的流动池中取出,漂浮在培养基中,并从平面聚合物层中除去含有各个收缩性细胞图案的聚合物层区域。

  在某些情况下,核酸的图案可能是二维的。在某些情况下,核酸的图案包括具有相同的核苷酸序列的核酸的单一群体。在某些情况下,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列。在某些情况下,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列,其中每个群的核酸在基底表面上是唯一可寻址的。在某些情况下,核酸图案包含两个或更多个核酸群,其中每个核酸群包含独特的核苷酸序列,其中每个群的核酸在第一和/或第二基底的第一表面上是唯一可寻址的。在某些情况下,设置包括在基底上印刷包括核酸的液体。在组装基底之前或之后,可以在基底的表面上图案化核酸(寡核苷酸或多核苷酸),以形成用于产生编程用于折叠的平面组织的流动池。因此,所公开方法的某些实施方案包括以与第二基底间隔开的方式放置第一基底,其中第一基底的表面和/或第二基底的表面包括设置在其上的核酸图案。第一基底和第二基底可以使用弹性构件间隔开,弹性构件另外有助于密封基底和弹性构件(例如垫圈)之间的空间。在某些实施方案中,该方法可包括在第一基底的第一表面和第二基底的第一表面上图案化核酸,并以间隔开的方式放置第一基底和第二基底,使得基底的第一表面处于面向的方向。该方法还可以包括在第一和第二基底的周边之间形成密封。基底之一可包括一个或多个开口(例如端口),用于将材料(例如细胞、培养基、聚合物基质等)引入两个基板之间的空间中。该方法还可以包括在杂交的条件下在收缩性细胞的悬浮液中孵育图案化的核酸一段时间足以使细胞结合图案化的核酸。该方法可任选地包括洗涤步骤以除去未结合的细胞。在其他实施方案中,可以不使用洗涤步骤,并且除去含有细胞的培养基可以促进任何未结合细胞的去除。在某些实施方案中,在杂交条件下使图案化的核酸与收缩性细胞的悬浮液接触的步骤可以进行多次,其中细胞的相同的第一群被引入多次或细胞的不同群(例如细胞的第一群、第二群、第三群)在不同的接触步骤接触图案化核酸。

  在某些实施方案中,使基底表面上的图案化收缩性细胞与含有纤维的聚合物基质接触,从而将图案化的收缩性细胞嵌入聚合物基质中可以进行足以使聚合物基质聚合成平面层的一段时间。

  在某些情况下,细胞表面附着的核酸包含附着于核酸的脂质部分,该表面附着的核酸通过将脂质部分插入细胞的质膜中附着于细胞。在某些情况下,细胞表面附着的核酸包含脂质部分和核酸之间的间隔区。在一些实施方案中,脂质部分包括12-24个碳原子的长烷基链,例如12-22、12-20、12-18、14-22、14-20、14-18、16-22、16-20或16-18个碳原子。间隔区可包括10-80个核苷酸长,例如10-60、10-40、20-80、20-60、20-40、40-60、40-80、50-80、50-80或60-80核苷酸长。

  可以使用用于图案化核酸和将细胞附着到图案化核酸的任何合适方法。示例性方法包括美国专利申请公开号US20140294782和US20160010054中公开的方法。

  在某些情况下,收缩性细胞的悬浮液包含两种或更多种独特的收缩性细胞群,其中每个收缩性细胞群包含与图案中的核酸群之一互补的表面附着的核酸。用于图案化不同类型细胞群的方法也公开在申请公开号US20140294782和US20160010054中。

  可以使用能够在包含在聚合物层中的纤维上施加收缩力的任何类型的收缩性细胞。在某些情况,收缩性细胞选自:成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑细胞、心肌细胞、其祖细胞及其组合。在某些情况下,收缩性细胞是成纤维细胞。在某些情况下,收缩性细胞是上皮细胞。在某些实施方案中,收缩性细胞可以从宿主中分离,通过本文公开的方法产生的3D生物组织将被移植到所述宿主中。在某些实施方案中,可以对收缩性细胞进行基因工程改造以增加其驱动纤维的能力,例如,增加纤维的收缩和/或增加纤维的排列。例如,收缩性细胞表达增强的Ras的水平或可表达组成型活性H-RasV12。

  在某些实施方案中,该方法还包括从三维形状中除去聚合物基质以产生含有纤维和细胞但基本上不含聚合物材料的组织。可以通过溶解聚合物来除去聚合物基质,例如通过反转交联剂以聚合聚合物。在某些情况下,聚合物可以是可生物降解的聚合物,其可以限定的一段时间后通过体内降解除去。可以使用任何已知的制备生物可降解聚合物层以及控制降解速率的方法。具有预定降解速率的示例性可生物降解聚合物公开在美国专利申请公开号US20140170204中。在某些实施方案中,聚合物基质包括甲基丙烯酸酯聚合物、聚乙烯亚胺和硫酸葡聚糖、聚(乙烯基硅氧烷)生态聚乙烯亚胺、磷酸胆碱、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚氨酯、聚(乙二醇)、聚(乳酸-乙醇酸)、羟基磷灰石、聚(乳酸)、聚羟基戊酸和共聚物、聚羟基丁酸酯和共聚物、聚己内酯、聚二恶烷酮、聚酐、聚氰基丙烯酸酯、聚(氨基酸)、聚(原酸酯)、聚酯、胶原蛋白、明胶、纤维素聚合物、壳聚糖和藻酸盐或其组合、水凝胶、琼脂糖或纤维素聚合物。在某些情况下,可以将处于预聚合物状态的聚合物基质引入本公开的流动池中(例如,与第二基底间隔开并且包括用于将材料引入流动池的端口的第一基底)并使其在流动池中聚合。聚合物基质可以与纤维预混合,或者纤维可以在单独的步骤中引入。

  在某些情况下,聚合物基质包含核酸酶。在某些实施方案中,将含有纤维和收缩性细胞的聚合物层与基底分离可以包括将聚合物层暴露于核酸酶以消化将细胞附着到基底上的寡核苷酸。在其他实施方案中,将含有纤维和收缩性细胞的聚合物层与基底分离可以不涉及使用核酸酶;相反,寡核苷酸的杂交可以通过细胞培养条件逆转。

  本公开中使用的纤维可以是在收缩性细胞的作用下机械致动的任何纤维。这种纤维可包括纤维胶原,例如I型、II型、III型、V型或XI型胶原蛋白,或纤连蛋白。纤维可以是合成的,分离自哺乳动物,例如啮齿动物、牛或人,或来自遗传工程改造以表达纤维的细胞。在某些情况下,纤维可以包含在ECM中。本公开中使用的ECM可包括合成ECM、从动物分离的ECM、从细胞系分泌的ECM、或其混合物。在某些实施方案中,聚合物基质可包括用胶原或RGD肽片段接枝的聚合物。

  本文还公开了产生平面生物组织的另外方法,所述平面生物组织被配置用于折叠成三维形状。在某些实施方案中,这些方法不包括在基底表面上图案化核酸的步骤,并且不利用包括与图案化核酸互补的细胞表面附着核酸的收缩性细胞。这些方法可包括在基底上设置包含纤维的聚合物层;在聚合物层上图案化收缩性细胞,使得收缩性细胞在聚合物层上以彼此间隔开的方式设置;和在足以允许收缩性细胞粘附到聚合物层的条件下在聚合物层上孵育收缩性细胞,从而产生生物组织,该生物组织被配置用于通过在聚合物层中收缩性细胞作用纤维上而折叠成三维形状。

  在某些情况下,该方法包括产生聚合物层和在聚合物层上设置纤维(例如ECM)并在聚合物层上设置收缩性细胞图案。

  在某些情况下,所述设置包括在聚合物层的顶表面上设置第一层纤维(例如ECM)并在聚合物层的底表面上设置第二层纤维,并且图案化收缩性细胞包括:图案化第一层纤维上的收缩性细胞;在足以允许收缩性细胞粘附到纤维上的条件下在纤维的第一层上孵育收缩性细胞;图案化第二层纤维上的收缩性细胞;在足以允许收缩性细胞粘附到纤维上的条件下在第二层纤维上孵育收缩性细胞。

  在某些情况下,图案化包括以间隔开的方式在纤维层上印刷收缩性细胞。细胞的印刷可以通过任何合适的方法进行,例如3-D印刷、挤出、挤出3-D印刷等。任何类型的微流体喷嘴或其他分配系统,例如,scienion细胞打印机、改进的喷墨打印机、液滴微流体装置可用于打印细胞或收缩性细胞和纤维(或ECM)的溶液。在某些情况下,图案化包括在纤维层上以间隔开的方式微动吸移收缩性细胞。

  在所公开方法的某些方面,收缩性细胞可以与纤维的印刷结合印刷。例如,在各种实施方案中,收缩性细胞和纤维作为混合物挤出;收缩性细胞和纤维分层印刷(例如,收缩性细胞和胶原蛋白的交替层);收缩性细胞和纤维以分开的步骤印刷,以形成与纤维图案相邻的收缩性细胞图案,等等。

  在某些实施方案中,用于产生配置用于折叠成预定形状的三维(3D)组织的方法包括将收缩性细胞和纤维的混合物设置在基底上以形成包含收缩性细胞和纤维的3D结构;和在细胞培养条件下将所述结构在培养基中孵育,以将结构折叠成预定形状。

  在某些实施方案中,该方法还包括在孵育之前将纤维溶液置于所述结构上。在某些实施方案中,该方法可以进一步包括在孵育之前重复将收缩性细胞和纤维的混合物和/或纤维溶液设置在所述结构上。

  任选地,在孵育之前将结构从基底上移除,或者任选地与基底一起孵育。在某些实施方案中,基底是柔性基底,其也可以随着3D结构的折叠而折叠。例如,基底可以是平面聚合物层或具有支架结构的聚合物层。

  在某些实施方案中,收缩性细胞和纤维使用印刷技术设置,例如挤出3-D印刷。例如,在一些实施方案中,胶原溶液以任何所需图案作为层印刷在聚合物基底上,以产生多个对齐的胶原蛋白纤维。基于聚合物基质将要折叠成的期望3D形式,收缩性细胞任选地以任何浓度和图案包含在这种胶原蛋白层中。

  在某些实施方案中,该方法包括在聚合物材料的较大3D板内挤压收缩性细胞和纤维的混合物,使得纤维形成3D板内的支柱和收缩性细胞形成通过收缩这些纤维支柱连接纤维的两个或更多个支柱的节点。

  含有纤维的溶液或者是新鲜制备的,或者可以已经被孵育一段时间以形成一定长度的纤维。任选地使用更长的孵育期来产生更长的纤维,反之亦然。基于生物组织的所需性质确定纤维的浓度。

  在某些情况下,纤维的最佳浓度是凭经验确定的。在各种实施方案中,纤维(例如胶原蛋白、纤连蛋白等)的浓度范围为0.1mg/ml-10mg/ml。在一些情况下,取决于收缩性细胞的定位和/或数量,使用更高浓度的纤维。

  在某些实施方案中,生物组织中包含的收缩性细胞包含成纤维细胞。在其他实施方案中,生物组织中包含的收缩性细胞包含上皮细胞。在某些实施方案中,生物组织中包含的收缩性细胞包含成纤维细胞和上皮细胞。

  在某些情况下,该方法还包括在细胞培养条件下将含有纤维和收缩性细胞的生物组织在培养基中孵育,并将生物组织折叠成三维形状。根据用于产生生物组织的方法,生物组织在某些情况下是平面的,折叠成3-D形式,或者生物组织在某些情况下是3-D形式,其由通过收缩性细胞在纤维上的作用引入折叠进行改进。

  本发明方法的示例性实施方案包括在培养基中孵育含有纤维和预定图案的收缩性细胞的生物组织,同时约束生物组织的一部分以防止受约束部分在收缩性细胞的作用在纤维上折叠。受约束的生物组织部分可以是组织的边缘、组织的表面、组织的内部区域等。在某些情况下,可以约束一个以上的生物组织部分,例如,边缘和表面都可以保持在约束下。

  在一个实例中,生物组织可以具有基本上平坦的表面,该平坦表面可以粘附到支撑件上,以防止平坦表面在收缩性细胞作用纤维上时折叠。在某些实施方案中,生物组织可以是基本上平面的并且包括与第二平坦表面相对的第一平坦表面。第一平坦表面的一部分或基本上整个第一平坦表面可以粘附到支撑件上,以防止第一平坦表面在收缩性细胞的作用纤维上时折叠,同时第二平坦表面经历折叠。这种方法可用于以不对称的方式在组织中产生折叠,例如在第二平坦平面上形成凹痕,同时第一平坦平面保持基本平坦。

  在另一个实例中,生物组织的边缘可以粘附到支撑物上,以防止边缘在收缩性细胞的作用下折叠。

  在某些实施方案中,生物组织的内部区域、边缘或表面可包括使内部区域、边缘或表面的至少一部分收缩的试剂,其抵消收缩力并防止收缩性细胞折叠该部分。在某些实施方案中,可以在生物组织的靶区域(例如,生物组织的内部区域、边缘或表面)中改变离子强度,使得靶区域中的聚合物基质变得高度交联,因此抵抗收缩性细胞产生的收缩力。在某些实施方案中,可以将核糖或赖氨酰氧化酶添加到生物组织的目标区域(例如生物组织的内部区域、边缘或表面),其导致目标区域缩小,抵消收缩力并防止收缩性细胞折叠目标区域。

  在某些情况下,生物组织的一部分可包括用于使该部分扩张从而分离收缩性细胞和/或稀释纤维量使得扩张部分不折叠的溶胀剂。在某些实例中,溶胀剂可以是逆转聚合物基质的交联的试剂。生物组织区域的化学溶胀可以如下述文献中所述进行,例如,Chen等,Science,第347卷,第6221期,第543-548页,2015。

  在某些情况,图案化包括设置包含单一类型的收缩性细胞的收缩性细胞群。在某些情况,图案化包括设置包含两种或更多种类型的收缩性细胞的收缩性细胞群。在某些情况下,图案化包括设置第一图案的第一类型的收缩性细胞群和第二图案的第二类型的收缩性细胞群。在某些情况,收缩性细胞选自:成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑细胞、心肌细胞、其祖细胞及其组合。在某些情况下,聚合物层包含水凝胶、藻酸盐、聚己内酯(PCL)、明胶、琼脂糖、纤维素聚合物或其组合。

  在某些情况下,ECM包含从细胞系分泌的ECM或合成ECM。在某些情况下,ECM包括纤维,例如胶原蛋白或纤连蛋白。

  根据某些实施方案,核酸在表面上图案化(例如,通过分子书写),使得在接触步骤后,细胞以单细胞分辨率附着于表面。“单细胞分辨率”是指在表面上特异性图案化的细胞(例如,通过与其正交图案化核酸的特异性结合)在物理上彼此分离。也就是说,单个细胞在表面上在表面上的非重叠位置处被图案化,其中表面上的空白空间存在于单个细胞之间。通过在表面上以合适的密度在表面上高分辨率处理核酸,通过在细胞的第一悬浮液中选择合适浓度的细胞,等等,实现单细胞分辨率。在其他实施方案中,一些细胞以间隔开的方式设置在多个位置,例如,每个位置可具有少于1000个细胞,少于100个细胞,少于30个细胞或少于10个细胞,例如2-10个细胞。

  在一些实施方案中,以图案设置的细胞之间的间隔基于ECM中细胞所施加的期望曲率和/或收缩力而变化。例如,为了诱导更大的折叠,细胞可选地相对紧密地设置,以引起较小的折叠。在某些情况下,细胞的间隔根据经验确定。

  细胞表面附着的核酸通过任何方便的方法附着在细胞表面上。根据某些实施方案,细胞表面附着的核酸通过代谢工程和无铜点击化学与细胞表面聚糖共价连接,其中蛋白质可通过胺酰化修饰。在某些方面,细胞表面附着的核酸包括(直接或间接)附着于核酸的脂质部分,该表面附着的核酸通过将脂质部分插入细胞的质膜而附着于细胞。当细胞表面附着的核酸包括与核酸连接的脂质部分时,在一些情况下,在脂质部分和核酸之间存在间隔物。

  根据某些实施方案,细胞表面附着的核酸是膜锚定的多核苷酸。膜锚定的多核苷酸的实例描述于例如Selden NS等人,(2012)J.Am.Chem.Soc.134,765-768;和美国专利申请公开号US2014-0294782和美国专利申请61/554,912中,其各自的公开内容通过引用并入本文。膜锚定的多核苷酸通常包括膜锚定区和多核苷酸。多核苷酸具有膜近端和膜远端。多核苷酸可包括接头区域和膜远端粘附区域。多核苷酸的接头区域可包括至少约20个核苷酸的连续区段。膜远端粘附区域可以包括至少10个核苷酸并且位于接头区域的远侧,其中接头区域不能与膜远端粘附区域杂交。

  在一些实施方案中,膜锚定的多核苷酸的多核苷酸部分包括DNA,例如单链DNA。在一些实施方案中,多核苷酸包括RNA、PNA、LNA等。在一些实施方案中,多核苷酸可以是单链的。

  在一些实施方案中,多核苷酸包括接头区域,其中接头区域包括约20至约3000个核苷酸的连续区段。在某些实施方案中,接头区域与多核苷酸的膜远端分开约10个核苷酸或更多。例如,接头区域任选地与多核苷酸的膜远端分开约10至约2000个核苷酸或更多。在某些方面,多核苷酸包括约10至约2000个核苷酸的连续区段,包括仅三种类型的碱基。在一些实施方案中,三个碱基选自A、C、T和G。在某些实施方案中,三个碱基是A、C和T。

  膜锚定的多核苷酸任选地含有膜锚定区,其可包括含12-22个碳的烷基链。在某些方面,膜锚定区与多核苷酸连接。根据某些实施方案,膜锚定区域是疏水的。在一些实施方案中,膜锚定区域是亲脂性的。在某些方面,整个膜锚定区域是疏水的。根据某些实施方案,整个膜锚定区域是亲脂性的。在一些实施方案中,仅一部分是亲脂性或疏水性的。在某些方面,膜锚定区域是两亲的。根据某些实施方案,膜锚定区域使得在能量上更有利于将链插入膜中而不是包含在溶液(例如水)中。在这样的实施方案中,膜锚定区域自发地插入脂质膜中。

  如本文所公开的,在一些实施方案中,膜锚定区域插入细胞的膜中。在一些实施方案中,附着于膜锚定区的多核苷酸位于细胞膜的细胞外侧。在其他实施方案中,多核苷酸位于细胞膜的细胞内侧。在一些实施方案中,膜锚定区域包括单个烷基链。在其他实施方案中,膜锚定区域包括两个烷基链。在某些方面,膜锚定区域包含多于两个烷基链。任选地包括三个或更多个烷基链。

  根据某些实施方案,膜锚定区包含烷基链和链烯基、烷基、芳基或芳烷基链。该链烯基、烷基、芳基或芳烷基链可包含12-22个碳原子。在一些实施方案中,烷基链包含约12-22个碳原子,并且烯基、烷基、芳基或芳烷基链包含约12-22个碳原子。在一些实施方案中,链共享相同数量的碳原子。在其他实施方案中,一条链的碳原子比另一条链少约1至10个碳原子。在各种实施方案中,一个链具有比另一个链少约1个碳原子,少约2个碳原子,少约3个碳原子,少约4个碳原子,少约5个碳原子,少约6个碳原子,少约7个碳原子,少约8个碳原子,少约9个碳原子,或少约10个碳原子。在一些实施方案中,膜锚定区包含一个以上的烯基、芳基或芳烷基链,每个链包含12-22个碳原子。

  在一些实施方案中,膜锚定区含有一个或多个不饱和碳键。在一些实施方案中,不饱和键全部包含在同一链内。在其他实施方案中,不饱和键可以包含在多于一个链中。

  在某些实施方案中,膜锚定区域包含二烷基磷酸甘油酯,并且多核苷酸与二烷基磷酸甘油酯缀合。在一些实施方案中,二烷基磷酸甘油酯的每个链与另一个链具有相同数目的碳原子。在其他实施方案中,二烷基磷酸甘油酯的两个烷基链之间的碳原子数不同。在一些实施方案中,每条链具有12至22个碳。在一些实施方案中,每个链具有约12个碳原子,或约14个碳原子,约16个碳原子,约18个碳原子,约20个碳原子或约22个碳原子。在一些实施方案中,至少一个链具有约12个碳原子,约14个碳原子,约16个碳原子,约18个碳原子,约20个碳原子或约22个碳原子。在特定的实施方案中,膜锚定区域包含C16二烷基磷酸甘油酯。

  在一些实施方案中,膜锚定区包含单烷基酰胺,并且多核苷酸与单烷基酰胺缀合。在一些实施方案中,单烷基酰胺链具有12至22个碳原子。在各种实施方案中,单烷基酰胺链具有约12个碳原子,或约14个碳原子,约16个碳原子,约18个碳原子,约20个碳原子或约22个碳原子。在某些实施方案中,单烷基酰胺包含约16或18个碳原子。

  在某些方面,本公开的方法包括在杂交条件下使表面上的细胞图案与第二细胞悬浮液接触,其中第二悬浮液的细胞包括与图案化细胞的细胞表面附着的核酸互补的细胞表面附着的核酸,并且其中第二悬浮液细胞的细胞表面附着的核酸与表面上图案化的细胞的细胞表面附着核酸杂交,形成细胞的三维图案。根据某些实施方案,第二悬浮液的细胞选自上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、干细胞或其任何组合。

  本方法任选地包括从表面除去图案化的细胞。在某些方面,通过将细胞嵌入基质中并从表面除去基质来除去图案化的细胞,其中细胞的图案化在去除时保留在基质中。感兴趣的基质包括但不限于细胞外基质(ECM),例如基质胶、胶原蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、PEG-丙烯酸酯等。在一个特定的实施方案中,嵌入包括在保持凝胶处于液态的条件(例如对于基质胶,4℃)下用含有高活性DNase的液体ECM填充PDMS流动池。然后将流动池转移至生理温度以同时触发凝胶基质凝固,并启动细胞和玻璃基底之间的DNA链的酶促切割。去除任选地包括将包含图案化细胞的基质从基底表面剥离。

  在某些方面,该方法包括培养图案化细胞。图案化的细胞可以在使得包含该图案化细胞中的基质是自由浮动的形式并且能够通过在收缩性细胞在ECM上施加收缩力而折叠的条件下培养。

  在某些实施方案中,有限元模型(FEM)任选地用于预测本文公开的生物组织中的折叠。在一些情况下,FEM用于基于期望的3D形状确定纤维的排列、细胞之间的距离、细胞的浓度等。在某些情况下,使用本文公开的方法产生的生物组织层叠在或夹在ECM的一层或多层之间,所述ECM可以包含或不包含收缩性细胞。在一些情况下,ECM层包括不同浓度的纤维和/或与生物组织中存在的纤维不同的纤维类型。

  在某些实施方案中,所述方法包括产生多个合成平面组织并组合平面组织或由其产生的3D形状以形成更高阶结构。例如,在一些情况下,本文所公开的方法用于生成3D形状的合成组织,例如管、具有弹出或凹坑的四重连接、盒子、球体,熊爪状等。任选地组合这些合成3D组织中的两种或更多种以产生更高级的结构。在一些情况下,解剖通过本文公开的方法产生的生物组织以产生期望的形状,并且一个或多个解剖的片用于产生特定形状的组织。

  在一些实施方案中,基于特定组织中所需的收缩程度确定收缩性细胞图案中的细胞簇中的细胞数。在各种实施方案中,细胞数量范围为1-1000个细胞/簇,例如3-1000、3-300、3-100、5-1000、5-300、5-100、8-1000、10-100、10-300或10-1000个细胞/簇。细胞簇之间的距离在一些情况下基于在特定组织中期望的折叠确定,并且范围可以从10-1000μm,例如10-300、100-300、100-500、100-1000、100-500、200-500、300-500或400-600等。在各种实施方案中,收缩性细胞的簇聚图案是各向同性图案、各向异性图案、或相对于平面组织沿X轴和Y轴(以及当组织处于3-D形式时沿X轴、Y轴和Z轴)的相邻簇之间的距离的渐变图案。

  在各种实施方案中,使用本发明公开的方法产生的编程用于以预定方式折叠的组织的尺寸范围在组织的最宽尺寸上从约1mm-约1cm。在某些情况下,组织最初可以较大并且可以被解剖以产生较小的组织片,其在组织的最宽尺寸上可以在约1mm至约5mm的范围内。

  在一些实施方案中,收缩性细胞的图案化由折叠组织中的所需曲率确定。例如,为了产生更高幅度的曲率,收缩性细胞任选地以更短的距离分开,以及为了产生更低幅度的曲率,可以将收缩性细胞分开更长的距离。可替代地或另外地,为了产生更高幅度的曲率,任选地图案化更多数量的收缩性细胞,以及为了产生更低幅度的曲率,可以图案化更少数量的收缩性细胞。类似地,为了产生更尖锐的折叠(更高的曲率),任选地使用可以促进纤维的增加收缩和/或增加纤维排列的收缩性细胞(例如成纤维细胞)。为了产生更平滑的折叠(低曲率),任选地使用可在较低水平促动纤维收缩和/或纤维排列的收缩性细胞(例如上皮细胞)。

  在期望在组织中引入相对折叠的实施方案中,收缩性细胞任选地被图案化以引入这种折叠。例如,在一些实施方案中,收缩性细胞在平面基底(例如含有纤维的聚合物层)的第一表面和第二表面上图案化,其中第一和第二表面彼此相对。第一表面上的收缩性细胞的图案任选地偏离第二表面上的收缩性细胞的图案。在一些情况下,偏移的距离由折叠之间的期望距离确定。在一些情况下,设置在第一和第二表面上的细胞的数量由所需的折叠曲率确定。在某些实施方案中,第一和第二表面上的细胞数大致相同。在某些实施方案中,第一和第二表面上的细胞数量可以相差不超过25%。

  在某些实施方案中,该方法包括引入在组织的x轴上交替极性的折叠(例如,波纹状结构)。在这样的实施方案中,产生每个折叠的细胞数量可以相差不超过25%。

  在某些实施方案中,该方法包括产生平面组织,其被配置用于折叠成管状。例如,在一些实施方案中,该方法包括在具有纤维的聚合物层上图案化收缩性细胞,其中所述收缩性细胞沿着聚合物层的x轴图案化,使用在x方向上从30至1000微米的对数分布的细胞间隔(例如30至300微米、100至300微米、100至250微米、30至250微米、50至250微米、100至250微米、50至150微米、或80至250微米)。沿y的组织间隔任选地保持相对较大(例如在约3000-300微米,例如2500-300微米、1000-300微米、500-300微米或400-300微米),以使沿管的长度的曲率最小化。在某些情况下,x方向上的细胞间距在100至300微米或80至250微米的范围内,并且沿y轴可以是500-300微米或400-300微米。

  系统

  本公开还提供了可用于例如实践主题方法的系统。在某些情况下,提供了一种用于生成配置用于折叠成三维形状的合成平面生物组织的系统。例如,在一些实施方案中,所述系统包括以图案设置在基底的表面上的核酸群;包含与核酸群互补的细胞表面附着核酸的收缩性细胞群,其中细胞群通过表面附着核酸与核酸群杂交而附着于核酸群;和包含细胞外基质的聚合物基质。

  在某些情况下,该系统包括与第二基底间隔开的第一基底,其中第一基底的第一表面处于与第二基底的第一表面相对的配置,其中核酸群以图案设置在第一和第二基底的第一表面上。

  在某些情况下,公开了一种用于生成配置用于折叠成三维形状的合成平面生物组织的另一种系统。该系统包括:聚合物层,其包括设置在聚合物层表面上的纤维层(例如细胞外基质);和收缩性细胞群。

  在某些情况下,公开了一种用于生成配置用于折叠成三维形状的合成平面生物组织的另一种系统。该系统包括:聚合物层,其包括设置在聚合物层的顶表面和底表面上的纤维层(例如细胞外基质);和收缩性细胞群。

  在某些情况,收缩性细胞群包括选自以下的细胞类型:成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑细胞、心肌细胞、其祖细胞及其组合。

  在某些情况下,聚合物包含水凝胶、藻酸盐、聚己内酯(PCL)、明胶、琼脂糖、或纤维素聚合物。在某些情况下,ECM可包括可由收缩性细胞致动的纤维。在某些情况下,纤维包含胶原蛋白和/或纤连蛋白。

  在某些情况下,该系统包括编程,该编程包括指令,当由计算机的处理器执行指令时使计算机执行生成被配置为以预定方式折叠的组织的方法。

  编程可选地体现在计算机可读介质中和/或存储在云中。在一些实施方案中,独立于用于生成被配置用于以预定方式折叠的组织的其他组件提供编程。在某些情况下,编程与用于生成被配置用于以预定方式折叠的组织的其他组件捆绑在一起。

  在某些情况下,编程包括用于计算产生将以期望的结构折叠的组织所需的收缩性细胞的图案、收缩性细胞的数量、纤维的浓度等的算法。例如,编程可以向机器人或用户提供指令以在特定数量和特定图案下设置细胞以产生将折叠成管、波纹片等的组织。在利用自动或半自动仪器生成被配置用于以预定方式折叠的组织的实施方案中,编程向仪器提供指令以执行本文公开的方法的一个、多个或所有步骤。

  体外产生的生物组织

  也公开了一种工程化的三维(3D)生物组织,其包括预定图案的收缩性细胞,其中预定图案的收缩性细胞确定3D生物组织的形状。在某些情况下,生物组织由本文所述的方法和系统产生。术语工程化3D生物组织指的是人造的、非天然存在的组织,其包括预定图案的收缩性细胞,该收缩性细胞已经根据用于获得特定形状的组织提供的说明被定位。本文公开的方法提供了收缩性细胞相对于彼此的精确放置,以产生具有预定形状的组织。在某些情况下,收缩性细胞簇可以间隔相同的距离。在其他情况下,收缩性细胞簇可以间隔开一距离,该距离沿着一个或多个轴增加设定增量。在一些情况下,收缩性细胞簇可以间隔开一距离,该距离沿一个或多个轴指数增加。在某些情况下,可以将细胞编程为自组织,例如,使用它们的物理特性或合成生物学技术。

  通过所公开的方法产生的组织在组织中存在的细胞的大小、形状和图案方面可以基本相同。基本上相同的组织的产生在需要跨不同条件的均匀性的方法中是有利的。例如,通过本方法产生的多种不同的工程化3D生物组织可以是相同的,因此可以用于筛选影响这些组织的试剂。在某些情况下,可以使用多个相同的工程3D生物组织来筛选调节细胞信号传导、形态发生、器官形成、生命系统组织等的试剂。这些组织不会受到分离的生物组织中固有的细胞数量和组织的变化或甚至使用细胞培养系统在体外产生的那些。

  在某些情况下,生物组织包括仅一种类型的收缩性细胞。在某些情况下,生物组织仅包含两种类型的收缩性细胞。在某些实施方案中,所述一种类型的收缩性细胞包含成纤维细胞。在某些实施方案中,所述两种类型的收缩性细胞包括成纤维细胞和上皮细胞。

  在某些情况下,生物组织的图案包括间隔开的收缩性细胞簇。在一些实施方案中,每个簇包含5-100个收缩性细胞。在一些实例中,每个簇包含5-50个收缩性细胞。在其他方面,每个簇包含5-10个收缩性细胞。在一些情况下,生物组织包括预定浓度的纤维。在一些实施方案中,生物组织缺乏血细胞、脂肪细胞和神经细胞中的一种或多种。在某些实施方案中,生物组织缺乏红细胞和免疫细胞中的一种或多种。在某些实施方案中,生物组织缺乏以下的一种或多种:免疫细胞,例如淋巴细胞,嗜碱性粒细胞,嗜中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,单核细胞和巨噬细胞。

  在许多方面,通过本公开的方法产生的工程化3D生物组织不同于从动物(例如人)分离的生物组织。如本文所述,工程化3D生物组织缺乏通常存在于组织体内的免疫细胞。另外,本文公开的工程化3D生物组织缺乏存在于天然形成的组织中的通道/管等的脉管网络,例如血管网络、淋巴管网络等。在某些实施方案中,通过添加免疫细胞和/或通道/管的脉管网络可以进一步修饰通过本公开的方法产生的工程化3D生物组织,以用作从动物分离的生物组织的模型。

  在一些方面,收缩性细胞选自:成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、平滑细胞、心肌细胞、其祖细胞及其组合。

  在一些方面,工程化的3D生物组织可以包括水凝胶、明胶、藻酸盐、聚己内酯(PCL)、琼脂糖、纤维素或另一种聚合物的基质,以支持可以是胶原蛋白或纤连蛋白的纤维。胶原蛋白可以是合成的或从生物来源获得。

  在某些情况下,生物组织可以是包括在体外产生的生物组织的分离的单元的混合组织。可以组装体外产生的生物组织的单独单元以提供混合组织,例如,体外产生的生物组织的单独单元可以一个在另一个之上层叠。体外产生的生物组织的单独单元可以具有不同类型的细胞,例如,第一单元可以具有上皮细胞,第二单元可以具有成纤维细胞。

  在某些情况下,混合组织可包括体外产生的生物组织和从哺乳动物分离的生物组织。例如,混合组织可包括体外产生的组织的第一单元(例如上皮细胞和/或成纤维细胞层)和从哺乳动物分离的生物组织层。从哺乳动物分离的可用于产生混合组织的生物组织包括血管、脂肪组织、神经组织等。

  效用

  本公开的方法、基底、聚合物层和系统可用于各种不同的应用,包括研究、临床前和临床应用。例如,使用本公开的方法产生的3D细胞结构可用作例如皮肤、肠、前列腺、肝脏和乳房的模型。此类组织/器官模型可用于分子功效和毒性测试,例如药物或化妆品测试。

  本公开的方法、基底、聚合物层和系统可有生产植入到动物和人类的合成器官,例如在糖尿病中取代胰腺功能,或在植入的生物反应器的情况下,例如以取代肾功能。其他用途包括通过利用组织自组装、ECM分泌来生产合成生物材料(例如合成皮革、天然化学品、食品)。

  这里公开的折叠组织也可用于测试细胞信号传导的模型系统,涉及形态发生、器官形成、生命系统组织等的解密机制。

  此外,所述方法、基底和系统可用于临床应用。例如,本公开的方法可用于再生医学应用,其中期望产生3D组织或其子结构,以便向需要其的受试者(例如人类患者)提供其组织或子结构,例如由于受试者缺乏功能性相应的组织或组织亚结构。

  实施例

  如从以上提供的公开内容可以理解的,本公开具有广泛的应用。因此,提出以下实施例以便向所属领域的一般技术人员完整地公开且描述如何制备和使用本发明,并且并不旨在限制本发明人视为其发明的范围,也不旨在表示下文实验为所进行的全部或唯一实验。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似结果的各种非关键参数。因此,提出以下实施例以便向所属领域的一般技术人员完整地公开且描述如何制备和使用本发明,并且并不旨在限制本发明人视为其发明的范围,也不旨在表示下文实验为所进行的全部或唯一实验。已努力确保关于所使用的数量(例如量、尺寸等)的准确性,但应当说明存在一些实验性误差和偏差。

  材料和方法

  细胞培养.在经处理的聚苯乙烯板和烧瓶(Coming)上培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF,Jay Debnath,UCSF的礼物);MCF10AT(Liu,J.S.等,Cell Reports 2,1461-1470(2012))(RAS细胞,大量群体和克隆),其表达H2B-GFP和组成型活性H-RasV12;人脐静脉内皮细胞(HUVECs,Lonza),其用pSicoR-Efla-mCh-Puro(Addgene 31845)制备的慢病毒转导后表达mCherry;人乳腺成纤维细胞(Jim Garbe的礼物,UCSF),通过pSicoR-Efla-maxGFP-Puro(Justin Farlow,UCSF的礼物)表达maxGFP;Madin-Darby犬肾上皮细胞(MDCK,UCSF细胞培养设施);Jurkat永生化T细胞(美国典型培养物保藏中心);原代人乳腺上皮细胞(HMECs,Jim Garbe的礼物,UCSF);和Caco2人上皮结肠直肠腺癌细胞(UCSF细胞培养设施)。如以前所述对MCF10A细胞培养RAS细胞(Debnath,J.等人,Methods 30,256-268(2003))。将HUVEC维持在EGM-2培养基(Lonza)中。将Jurkat细胞维持在含有10%胎牛血清(FBS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培养基中。将MDCK和Caco2细胞维持在含有10%FBS和1X非必需氨基酸的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将HMEC维持在M87A培养基中并在第4代分选成肌上皮(MEP)和腔(LEP)上皮细胞群,如以前所述的(Stampfer,M.R.等人,Cell and Molecular Biology of Breast Cancer(ed.Schatten,H.)323-361(Humana Press,2013).doi:10.1007/978-1-62703-634-4_15)。

  通过从10mM DMSO储液中连续稀释,将布雷他汀(Abcam ab120491)和星形孢菌素(Sigma-Aldrich S5921)以指定浓度加入细胞培养基中。

  重构组织制造.通过将醛-硅烷化玻璃载玻片(Schott 1064874)夹在用工艺切割器(Silhouette)切割的PDMS膜垫片(0.01”厚,SSP M823)上来构建流动池。顶部载玻片中的通孔使用10-20道的15%功率的蚀刻激光(VLS3.5,Universal Laser Systems)制成。在细胞图案化之前,将基准标记蚀刻到两个载玻片中以通过光学显微镜帮助对准。蚀刻的载玻片用作DNA编程的细胞组装(DPAC)的基底,如以前所述(Todhunter,M.E.等人,Nat Meth 12,975-981(2015))。蚀刻后,将胺修饰的寡核苷酸印刷到载玻片上并通过还原胺化共价连接。印刷位置在位图文件中指定。用疏水性硅烷处理载玻片并通过蛋白质吸附阻断载玻片,然后与PDMS垫圈组装。在夹之前,立即将PBS添加到垫圈中的间隙中以引导流动池并减少在载玻片之间捕获气泡的趋势。使用微阵列杂交盒(AHClX16,ArrayIt)对夹心施加轻微压力。顶部载玻片中的通孔的位置和PDMS垫圈中的空隙与盒的尺寸匹配,使得16个流动池可以通过成对的通孔独立地寻址。

  使用PBS然后用0.05%胰蛋白酶从板上提起待组装在顶部和底部流动池壁上的细胞,并用脂质修饰的寡核苷酸标记,如以前所述(Todhunter,M.E.等人,Nat Meth 12,975-981(2015))(在一个实例中Caco2是例外,见下文)。将流动池盒置于冰上,通过在一对通孔中的一个上方轻轻移液,将约10×106个细胞/ml悬浮液中的细胞引入流动池,并粘附在玻璃上的DNA斑点上。使用另一轮细胞组装在每个DNA斑点处产生5-8个细胞的簇。细胞在图案化后,液体ECM-模拟物凝胶前体以每流动池20微升的两个等分试样引入,盒放置在37℃下20分钟,以凝固该前体。重组的组织凝胶由Matrigel中荧光标记的胶原蛋白1纤维的复合物组成。首先,在DMSO中使用5ul 1mg/ml Alexa Fluor 555或647-NHS酯(ThermoFisher Scientific;根据成像要求)标记在0.02M乙酸(Coming 354249)中的200μl~8.5mg/ml大鼠尾胶原蛋白1,在用10μl20xPBS和4μl 3M NaOH在冰上中和之前立即加入。在冰上10分钟后,将70μl该胶原原液加入到由415μl~9mg/ml Matrigel(Corning 354234)和15μl Turbo DNA酶(ThermoFisher Scientific AM2238)组成的第二种原液中。该500μl前体溶液足以填充8-10个流动池。

  然后将流动池盒轻轻地拆开,并将载玻片夹层在室温下浸没在合适的细胞培养基中。使用剃刀刀片轻轻地撬开玻璃载玻片。由ECM凝胶携带的细胞簇组成的重构组织通常自发地漂浮到培养基中,或者可以用微刮刀轻轻地从一个载玻片上分离(Fine Science Tools 110089-11)。然后使用活检穿孔器或剃刀刀片或通过激光显微切割(Zeiss PALM MicroBeam)手动切割漂浮的组织。使用修剪至~7mm直径的P1000移液管将成品组织转移至玻璃盖玻片底24孔板(Greiner)。如果打算重构组织进行折叠,则在加入重构组织之前,用PBS中的1%琼脂糖包被每个孔中的玻璃以防止它们粘附。对于胶原应变/对齐和非折叠对照的成像研究,或在显微切割之前,重构组织被促使以通过在半干状态10分钟37℃下孵育粘附到盖玻片孔的底部(培养基暂时撤回)。

  不是由DPAC组装,而是通过在凝胶前体中以4×106个细胞/ml预混合它们使得它们在37℃凝固之前沉降到流动池的底部而在下组织表面构建半融合的Caco2细胞层。

  将包含HUVEC的重构组织在EGM-2中培养,其中IL-3,基质细胞衍生因子1a(SDF-1a)和干细胞因子(SCF)各200ng/ml以促进流明。将具有单个乘客细胞类型的组织在合适的成纤维细胞培养基中培养12小时,然后转移至乘客细胞类型的培养基中。在12小时后,将3细胞型重构组织(含有MEF、HUVEC和Caco2细胞)类似地转移到50∶50HUVEC:Caco2培养基中。

  细胞印刷.不使用DPAC,流动池中产生的凝胶可以使用非接触印刷用细胞簇图案化。使用压电小体积分配器sciFlexArrayer S3(Scienion Technologies)分配PBS中的10×106个细胞/ml MEF悬浮液。排出的细胞悬浮液滴体积约为300μL,直径约为100μm,平均含有3个细胞/滴。在印刷过程中,将重构组织粘附在半干状态的普通载玻片上。然后,将组织在37℃下孵育30分钟以促进细胞粘附,然后在添加过量细胞培养基后使用微刮刀轻轻地从载玻片上提起。

  液滴收缩.快速筛选细胞收缩通过在以盖玻片为底的微孔中设置含有106个细胞/ml的1μlECM凝胶微滴在37℃下20分钟来完成。然后加入培养基并在时间推移成像之前通过温和移液将液滴分离。

  重构组织凝胶表征.通过粒子图像测速法测定重构组织在单细胞附近的凝胶应变(PIV ImageJ plugin(Tseng,Q.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,1506-1511(2012))。具有每毫升8×106的1微米红色荧光聚苯乙烯珠的重构组织凝胶前体的30微升等分试样(ThermoFisher Scientific F13083)和未标记的胶原纤维在37℃下设置在96孔板的孔中20分钟。将每孔3,000个细胞沉积在重构组织凝胶衬垫上,并通过共聚焦显微镜每60分钟成像用于珠置换。

  使用ImageJ中的OrientationJ测量胶原纤维取向和FEM边缘取向(Z.等人,Focus on Bio-Image Informatics 219,69-93(Springer Intemational Publishing,2016)。使用高斯模糊对取向图像进行平滑,其长度为细胞簇间距的~0.1倍,以实现解释。

  通过手动注释在ImageJ中确定胶原带取向。具有至少为3的信噪比的胶原荧光的条带包括在取向图中。

  在通过激光显微切割(Zeiss PALM MicroBeam)消融~100μm×10μm轨道后30分钟测量凝胶回弹。在远离细胞簇的对照区域中调节激光功率,以确保切割整个凝胶厚度。

  成像.重构组织折叠的3D时间流逝在37℃和5%CO2下通过Zeiss Zen 2012软件经由具有30微米z切片间距的平铺共聚焦显微镜10x物镜记录,使用具有Yokogawa CSUX1旋转盘和Photometrics Evolve 512 EMCCD相机的Zeiss Observer.Z1。

  从共聚焦数据空间重建重构组织.共焦图像在ImageJ中手动或通过半自动阈值化分割。然后将二进制图像堆栈读入MATLAB(MathWorks)并通过行进立方体转换为等值面网格。使用自定义脚本对网格进行平滑处理并将前面颜色分配给局部曲率。

  在手动挑选重构组织的中心作为起点之后,通过在ImageJ中径向重新分割和阈值化来产生针对帽重构组织报告的曲率。将径向切片读入MATLAB,将最小二乘法拟合到圆圈中。对于指示的切割平面和折叠,类似地产生各向异性曲率。

  免疫荧光.将重构的组织转移到新鲜的24孔板中,并在室温下在2%多聚甲醛中固定45分钟。在通过光学显微镜观察重构组织的同时进行所有液体处理,以避免移液管尖端的机械破坏。将重构组织用PBS中的100mM甘氨酸洗涤三次,每次洗涤20分钟,并在PBS中的0.5%Triton X-100中透化15分钟,所有都在室温下进行;并在0.1%牛血清白蛋白、0.2%的Triton X-100、0.04%Tween-20、10%山羊血清(ThermoFisher Scientific 16210064)(包括在PBS中1∶50稀释的山羊抗小鼠IgG fab片段(Jackson ImmunoResearch 115-007-003))中在4℃封闭过夜。重构组织中在4℃下在过夜封闭缓冲液中与一抗进行探测并在封闭缓冲液中洗涤三次,每次洗涤1小时。对二抗重复该过程。然后将重构组织在FocusClear(CedarLane FC-101)中成像。一抗是兔抗人细胞角蛋白14(1∶50,ThermoFisher Scientific RB-9020-P)和小鼠抗人细胞角蛋白19(1∶50,Biolegend 628502)。二抗是AlexaFluor 647标记的山羊抗小鼠IgG和AlexaFluor 405标记的山羊抗兔IgG(1∶200,分别地ThermoFisher Scientific A21235和A31556)。

  小鸡肠道成像.将受精的白色来亨鸡蛋孵化,加窗,并进行处理,如以前所述(Schneider,1999)。在指定的胚胎日解剖胚胎以移除肠管。将管切成粗糙的2mm片段,然后纵向切开以露出腔表面。将组织在4%多聚甲醛中固定,在PBS中洗涤3次,每次洗涤5分钟,在PBS中的2μg/ml溴化乙锭中染色15分钟,并且在室温下类似地洗涤(Eames和Schneider,2005)。对腔表面进行成像,放大2倍使用宏共焦显微镜(Nikon AZ-C2Si)。

  有限元建模.使用Kangaroo2模拟重构组织,Kangaroo2是Rhino Grasshopper算法建模环境中基于位置的动力学求解器。我们采用了一种相对抽象的形态发现FEM方法来实现交互式、快速重构组织原型化。立方体单位单元由四个网格面构成,每个四边形具有两个对角线。组装单位单元以每单位边长0.1mm的比例模拟重构组织,平衡空间分辨率和模拟时间。所有边缘都被建模为线性弹性元件,其刚度为k1,其余长度等于其初始长度。由于组织位置被指定为比模型中的网格顶点高10倍的分辨率,因此通过重新缩放和舍入DPAC组织坐标来生成要在上模型面或下模型面上指定的致动器节点(没有尝试校正空间混叠伪像)。与这些节点重合的xy平面中的边缘被指定为活动边缘,其相对于弹簧网络中的其他边缘具有>3x-更高的弹簧常数k2,并且具有由用户操纵的剩余长度s。

  因此,以这种方式构造的模型具有两个参数-非活动边缘的刚度k1和活动边缘剩余长度s。通过手动迭代s=0来拟合k1,以在t~21小时内近似d=100微米帽的曲率数据。然后将该k1值用于所有后续模拟。典型地对于0-1范围内的10个s值模拟重构组织,以在中间折叠状态产生每个重构组织设计的对象家族。模型重构组织被烘烤并从Rhino中导出,在Zbrush(PIxologic)中重新绘制以去除网面定向缺陷,读入MATLAB,体素化,转换为等值面网格,平滑并使用自定义脚本将面颜色映射到局部曲率。

  由于s不直接类似于体外重建的组织折叠时间,因此基于曲率分布的定性相似性选择模型重构组织,以从相应的成像时间点实验重构组织。

  统计分析.通过普通单向ANOVA与Prism 7(GraphPad)中的Holm-Sidak多重比较测试,分析数据之间的统计学显着性差异。

  在重构组织中消融后推断局部收缩引起的张力.由于凝胶表面收缩的实时成像受限于切割和共聚焦显微镜的适当长度尺度的不匹配,我们在约30分钟后进行解剖并成像切口。30分钟后,我们预计由于弹性组织反弹引起的应变将完全实现(Bonnet等,2012),而由于细胞簇的主动牵引而导致的持续应变将限制在胶原带附近小于~10μm(图11C)。我们认为组织的消融类似于在张力下切断弹性弹簧,从Kelvin-Voigt模型中抛弃时间依赖性动力学,Kelvin-Voigt模型通常用于研究活体生物背景中的粘弹性回缩(Bonnet等,2012;Kumar等,2006;Tanner等,2010)。因此,预张紧力正交的烧蚀切口F∝(L-Lo),其中L是在消融后的凝胶表面的放松切口宽度,Lo是被激光照射破坏立即的凝胶宽度(在实践中为没有细胞簇的对照凝胶中的激光束宽度或切口宽度)。

  各向同性重构组织曲率的缩放分析.我们近似重构组织作为同向单形弹性板,使得对于小的曲率(挠度比板厚小),在从板的中间平面的任意垂直距离z在yz平面上的应变由下式给出:

  εyz=zCyz[1]

  其中,Cyz是平行于yz平面的中平面的曲率(Timoshenko和Woinowsky-Krieger,1959)。我们假设重构组织上各向同性的致动器阵列在与其总数Nc成比例的给定时间点t产生切向凝胶表面的空间均匀应变,使得:

  其中是细胞簇的胶原基质应变速率。的实验测量值表现出是对于本地和全球的胶原凝胶变形大范围随时间近似恒定(Meshel等人,2005)。因此,结合[1]和[2]表明形成Cyz∝Nc的一阶模型,以拟合在描述中间时间点各向同性重构组织的折叠的校准数据。

  各向异性折叠的保真度.我们假设迁移率的细胞类型特异性差异将预测初始簇位置编码各向异性曲率的保真度。我们发现,间充质样癌细胞(MCC)在7.5hr的特征时间τd/2,迁移到80微米的簇对半间距的特征距离d/2,而小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在11小时内达到该阈值(图14C)。因为具有相似间隔的网格的各向同性重构组织的折叠时间对MCC和MEF细胞类型分别约为10小时和5小时,这些数据表明,MCC簇从它们的初始位置分散,然后显著发生折叠,而MEF没有。在折叠过程中细胞远离其预期位置的分散将倾向于产生空间上不受控制的应变,并因此产生不受控制的曲率。为了进一步研究这一假设,我们测量了各向同性或高度各向异性网格中簇(相对于水平轴)之间形成的拉伸胶原带的角度(图14D)。在培养9小时时,无论细胞类型如何,簇之间的条带主要朝向各向同性网格中的0和90度角的最近邻居。然而,在15小时时,由于细胞迁移远离初始簇位置的解体效应,条带取向变得随机分布。

  对于各向异性网格,在9小时簇之间条带也主要朝向最近的邻居,集中在沿水平轴0o处。然而,在15小时时,与MEF网格相比,各向异性MCC网格中的条带更频繁地远离该轴(即更紊乱),与远离初始簇位置的大量MCC迁移一致。这些数据表明,细胞应变率与迁移率之比的阈值决定了给定细胞类型以足够的保真度致动重构组织的程度。

  相邻的相对折叠弹出的坚固性.对于交替的负曲率和正曲率(即相对的折叠)的相邻折叠的设计的主要关注是它们对“弹出”缺陷的坚固性,其中平面外变形可以在非预期的方向上出现。通过将细胞簇放置在ECM片的相对侧上在xy平面中的空间上不同的区域,可以构建相反的折叠。为了研究我们的重构组织对这些缺陷的坚固性,我们建立了四重顶点组织,它们具有相同方向的三个折叠,一个相反方向上一个,在一个点上会聚。我们假设,为了成功地形成相对的折叠,它们需要由相似数量的细胞簇驱动,使得特定折叠的取向不会由更加根本弯曲的相邻折叠确定。实际上,当相对折叠中的簇的数量小于两个相邻折叠中的平均数的一半时,出现了以不正确取向形成的相对折叠的临界阈值(图18)。然而,对于该比率高于~0.75的值,相对的折叠总是突然进入正确的方向,这表明如果适当地管理空间应变分布,则相邻的相对折叠稳健形成。

  乘客细胞行为的调节.与非折叠对照组织相比,HUVEC细胞在四折叠顶点重构组织的3倍交叉处被图案化为贴片,优先沿着新生折叠迁移(图20),可能响应于局部胶原浓度和/或由成纤维细胞在折叠处协调的排列。这些数据表明,重构组织可以掺入产生基质应变和折叠所必需的比对的细胞,以及随着折叠进展动态响应这些微环境线索的其他细胞类型。

  实施例1:通过程序化细胞收缩性定向折叠组织

  设计曲率成薄的聚合物层的努力通常取决于发展由于材料中不同的收缩或膨胀造成的面内应力,这可通过至少部分地可预测的曲率和屈曲变形得到缓解。这些面外变形可以通过用铰链精加工板或通过使用各向异性材料特性来沿着规定方向偏置曲率来进一步控制。

  虽然显著工程控制已在非生物系统实现,但朝着构建折叠生物组织的进步已经首先受到细胞如何产生以及响应于在其微环境中的机械力的不完整知识限制。其次,响应于这种力的曲率和折叠的出现已经缺乏组织模拟模型系统,其提供对诸如细胞类型和分布以及ECM刚度和组成的参数的工程控制。为了应对这些挑战,我们研究了在嵌入均匀ECM凝胶的表面的收缩组织之间的力,并且使用图案化收缩网络研究后续的平面外曲率。

  为了建立凝聚机制的充分性以驱动组织折叠,我们开发了一种体外模型,允许详细分析细胞压实、ECM重排、机械力以及这些特性与附近组织界面折叠的关系。我们开始重建类似于胚胎间充质的微环境,其在250μm厚的松散且富含胶原蛋白的纤维状ECM板中掺入覆盖的富含层粘连蛋白的基底膜的组分(Adams和Watt,1993;Gersdorff等,2005;Smart和Moscona,1967年)。我们在凝胶板表面附近嵌入了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(图4C-E,5A)。为了控制凝胶中的初始细胞位置,我们使用了图案化技术,例如DNA编程的细胞组装(DPAC)(Todhunter等,2015年);为了模拟凝胶纤维重排,我们使用有限元建模(FEM,图5B,图6-8)。细胞产生的牵引力先前已经显示出在初始各向同性凝胶中应变和排列基质纤维(Baker等人,2015;Harris等人,1981;Sawhney和Howard,2002;Vader等人,2009)。与这些报告一致,我们发现MEF的网格凝聚成焦点,并且与凝聚相关的径向应变主要通过压缩周围的ECM来解释(图5A)。即使是在重构组织界面处包含5-8个MEF的单个簇的最小收缩系统也产生显着的局部浓度和胶原纤维的径向排列(图9)。此外,对于分离出高达400μm的孤立的簇对,我们发现放大的胶原纤维压实和沿其相互作用轴的重组,形成“带”(图5B,图10)(Sawhney和Howard,2002)。

  图10(E)示出了通过利用间隔开的成纤维细胞簇和凝胶的相对表面与基底的粘附的组合在富含胶原蛋白的凝胶的第一表面中形成局部曲率,以防止相反的表面在第一表面中引入局部曲率时折叠。图10(E)示出了通过约束包括纤维(例如胶原)的聚合物基质的表面,折叠可以仅限于凝胶的一侧(即一个表面),使得折叠是压痕或仅在基质的侧面和在该侧面的局部区域的曲率,即,仅在一个表面上的预定区域经历压缩导致形成局部裂缝。这种方法可用于模拟真皮乳头处毛囊形成的初始阶段。

  在约束和局部折叠的变型中可以涉及粘附组织的外围边缘,例如,将平面组织的周边附接到基底,同时允许平面组织的顶部和底部表面不附着到基底上。间隔开的成纤维细胞簇的放置将导致存在于簇之间的位置的聚合物基质折叠,同时还使得存在于成纤维细胞簇之间的区域中的凝胶由于放置在凝胶外围的约束而伸展和变薄。

  在所公开方法的其他变型中,组织内部的一个或多个区域可以通过向局部区域施加压缩力来约束,同时预定图案的收缩性细胞使组织中的其他区域折叠。

  由弹性弹簧构成的单元格网格内的各向同性收缩节点组成的双参数FEM定性地捕获了节点之间相同的放大网格对齐,并且表明这些区域与较不强烈对齐的区域相比具有较高的拉伸应力。生物物理学研究表明,升高拉伸应力下的凝胶区域在切割时应与垂直于切口的局部张力成比例地进行弹性回缩(Bonnet等,2012;Kumar等,2006;Legoff等,2013)。实际上,在实验和FEM中,与正交于条带的区域或远离细胞的对照区域相比,在条带处用聚焦UV激光烧蚀时,发生凝胶表面的显着更大的反冲(图5C)。

  细胞凝聚、ECM压实和纤维排列是在几种体内系统中观察到的间充质凝聚的标志性变化。通过另外证明对齐纤维中拉伸应力的累积,我们的观察表明间充质凝聚过程可以产生应变纤维ECM凝胶的力。对于沿单个组织界面的小应变,我们期望其曲率成比例变化。实际上,我们观察到在单个凝聚簇附近的组织界面处以及在沿着胶原带成对的簇之间的曲率逐渐出现(图9、10)。我们假设驱动单个细胞簇周围的曲率变化的相同现象可以通过机械耦合细胞网络的累积作用将组织界面的曲率设置在相当大的距离上。通过这种方式,凝聚间充质细胞的位置和密度应该决定界面应变,从而与组织的最终结构具有直接、可预测和可重复的关系-这是任何稳健发育计划的关键要求。

  为了验证这一点,我们定量地将凝聚网格中的细胞排列映射到两个折叠图案的面外曲率-各向同性和各向异性的细胞网格(图5D)。我们首先使用DPAC以自由浮动的ECM凝胶的上表面上制备细胞簇的各向同性网格(在x和y中簇之间相等间距d=dx=dy)。这些凝胶形成径向对称的内陷,其曲率随时间增加。此外,内陷凝胶的初始曲率与凝聚细胞类型使周围ECM变形的速率成比例,曲率动态跨越约5至>40小时的特征时间尺度(图11、12)。

  我们选择了相对较慢折叠的重构组织,其具有间充质样癌细胞(MCC)的各向同性网格,以通过全组织共聚焦显微镜能够详细测量折叠的时间动态。我们发现,在给定时间点的凝胶曲率C对于较小的d单调增加(簇数量Nc随Nc~1/d2增加,图5D)。实验的C对Nc数据充分地由比例缩放关系(R2=0.8,通过恒定应变速率致动器弯曲引起(Holmes等人,2011;Timoshenko和Woinowsky-Krieger,1959年)并由3D执行我们的FEM进行拟合。我们另外发现,曲率的出现与广泛和不可逆的凝胶重塑一致,因为当使用星形孢菌素诱导凝聚细胞的细胞凋亡时预折叠的组织展开小于40%(图13)。

  超越径向对称内陷,我们预测沿x轴相对于y轴具有更大密度的细胞簇的各向异性图案将编程沿y轴运行的折叠,因为凝聚过程中带有张力的胶原带优先在各向异性网格的最近的相邻簇之间形成(图14)。实际上,各向异性MEF网格沿预期轴一致地折叠凝胶,并且x和y中的曲率各向异性近似与簇间距各向异性成比例(图5D)。令人惊讶的是,由较少收缩和较多迁移的MCC驱动的相同网格未沿可预测的轴形成受控的各向异性折叠(图15)。经过进一步研究,我们发现给定凝聚细胞类型的折叠率与细胞迁移率之比对于确定可以指定各向异性折叠的保真度至关重要。

  我们继续探索间充质凝聚物通过构建和组合各向同性、各向异性和三个额外的折叠图案(卷曲、复合和反向)将凝胶折叠成复杂几何形状的一般性和稳健性(图15、图16和17)。我们首先实现了卷曲图案,其中MEF簇的线与矩形ECM基底成45°角放置,编码部分封闭的螺旋形状,间距为1mm,半径为200微米(在相应的FEM族的成员中相当值为1.2mm、220微米,图15B和15C)。复合图案,我们引入复合曲率到各向异性网格,以使用圆筒间隔簇的线形成管形状,x设置中80至250微米,由y中300微米分开(未示出数据)。该管在其整个长度上是中空的,内径为550微米+/-9%CV纵向(FEM为555微米+/-4%)。然后,我们将相对的曲率图案合并成四折叠顶点形状,其中相同方向的三个折叠在一个点处以相反方向会聚。我们发现,如果编码相邻折叠的簇密度相当,则这种相对的折叠图案对于“突出”缺陷是稳健的(图18)。

  组合各向异性、复合和相对的曲率折叠图案产生间距为1.6mm且幅度为130微米的波纹(对于FEM,为1.6mm和115微米,图15D和15E)。接下来,我们在顶部和底部表面上使用多组同心细胞簇网格在单个ECM片中编码两个相邻的相对的各向同性帽。局部地,以这种方式产生的曲率轮廓相似(但符号相反),在方位角为+1.6+/-34%,在培养12小时后为-2.1mm-1+/-30%(对FEM为+2.3mm-1+/-15%和-2.1+/-29%),虽然在这种“不可展开的”几何形状中残留的面内应力可能导致在其周边观察到的片的额外屈曲(Armon等人,2011)。

  局部面内残余应力与组织折叠轨迹之间的体内关系是组织边界条件的复杂函数,以及对补偿性细胞行为的反馈,包括细胞分裂、细胞形状变化和ECM重塑(Humphrey和Dufresne,2014;Legoff等,2013)。我们通过在折叠之前策略性地切割表面来特别探索组织边界条件的修改,以实现球形和立方体重构组织(如Kirigami艺术形式)(Sussman等人,2015;Zhang等人,2015)。我们在折叠之前使用激光显微切割凝胶基底构建了两种组织结构(图15F和15G);在后一种情况下,依靠连续立方体边缘处的各向异性曲率来驱动折叠。

  形态发生的过程经常导致构建图案的重复并置,例如肾的肾单位、肺的肺泡和真皮-表皮连接的折叠。我们推断,正如不同的折叠图案可以组合在一起,形成多样化的折叠系列;这些折叠可以作为重复子单元平铺,以构建更大尺寸和复杂性的架构。灵感来自胚胎第13-16天(E13-16)小鸡肠的锯齿形管腔表面(Shyer等,2013),我们设计了一个类似于Miura折纸折叠的四折连接的镶嵌(图19A)。Miura折叠具有几个不寻常的几何特征,包括负泊松比和一般适合复杂目标表面的能力(Dudte等,2016)。我们的Miura设计的有限元建模预测了与鸡肠相似的折叠轨迹(图19B)。实际上,构造的Miura折叠在15小时时自动地从6×8mm的平板形成为4×6mm的锯齿形结构,所有31个折叠具有正确的取向,并且具有与FEM中相似的周期性和幅度。

  组织折叠过程的一个显着方面是它们的曲率轨迹通常是稳健的,即使在具有复杂细胞组成的微环境中也是如此(Nelson,2016;Savin等,2011)。因此,我们测试了在包含其他细胞类型作为“乘客”的重构组织中间充质凝聚驱动折叠的稳健性。我们推断,如果ECM上的乘客细胞的机械活动显着低于凝聚间充质细胞的机械活动,则FEM预测的给定折叠轨迹不会被破坏。因此,我们筛选了7种细胞类型的收缩ECM液滴的能力,发现MEF和原代人乳腺成纤维细胞比其他常见细胞类型(包括内皮细胞和上皮细胞系)更大程度地收缩液滴(图19C)。这些数据表明,后一种细胞类型本身是大多数组织的关键组分,不会干扰由间充质特性支配的折叠轨迹。同样地,我们将其他细胞类型与凝聚间充质并列的能力提高了乘客细胞行为响应由凝聚间充质引导的组织结构变化而改变的第二种可能性(Mammoto等,2013;Shyer等,2015)。

  为了测试这些假设,我们将重构组织中的多种细胞类型图案化,以便折叠成Miura模式(图19D-F)。将3-叉的HUVEC绳索定位在初期折叠下方并在折叠过程中携带;而Caco2细胞(结肠癌细胞系)通过将它们均匀地嵌入组织表面而被携带在顶部。我们发现这些载有乘客细胞的Miura组织的折叠形状与FEM预测的相似,证实了凝聚间充质细胞的特性支配折叠轨迹(图19B、E)。我们还发现HUVEC迁移沿着初期折叠偏向,表明新兴的组织拓扑图和不断变化的ECM特性反馈了乘客细胞的行为(图20)。在稍后的时间点,HUVEC绳索完全封装在锯齿形折叠内,并且在36小时后在100-200微米的管道中流明。最后,我们发现在基质胶中形成3D囊肿的Caco2细胞(Ivanov等,2008)在成纤维细胞网络顶部的谷折叠基部集中。这种完全合成的折叠组织具有与发育中的小肠惊人相似的总体结构(Walton等,2016)。

  动物发育涉及在多个长度尺度上逐步精细化组织结构,形态发生的每个步骤都基于前面步骤中形成的结构。因此,组织固有地印有其形状和各向异性的发育历史,这对于雕刻局部细胞命运决定以及指导最终决定组织功能的后续自组织过程是至关重要的。间充质凝聚是在上皮和间充质的界面处形成拓扑和细胞组成的基础的核心脊椎动物发育程序之一(Mammoto等人,2013)。在间充质凝聚过程中伴随曲率出现的事件是复杂的,涉及每层中多个细胞成分之间的力学和旁分泌信号的变化(Eames和Schneider,2005;Vamer和Nelson,2014;Walton等,2012)。然而,间充质的力学分布在这些过程中的贡献尚未详细研究,假设曲率的开始主要由上皮细胞行为如迁移或形状变化驱动(Lecuit等,2011)。我们发现,在松散和纤维状ECM复合材料的情况下,凝聚间充质细胞的力学和动力学足以解释附近组织界面中的各种形状转变。在这些情况下,间充质表现得像活性复合材料,细胞使ECM紧张并压实ECM,在压实区域之间对齐ECM纤维,并沿着最大纤维排列区域编码材料中的应力。这些应力导致沿着轨迹的组织界面处的材料的面外屈曲,这可以使用有限元建模来预测。这种活体材料的可预测行为使我们能够将细胞-ECM复合材料自主折叠编程成各种3D结构,与体内发现的结构具有惊人的相似性。这个过程类似于将非生物材料自动折叠成复杂的形状(Holmes等,2011;Kim等,2012;Na等,2014;Sydney Gladman等,2016;Tallinen等,2016)。此外,间充质细胞-ECM复合物的自组织和动态特性与重构的肌动蛋白网络中观察到的现象具有惊人的相似性(Linsmeier等,2016),表明这些活性物质可能受共同物理原理的指导。

  重要的是,我们的模型不会引起覆盖组织层例如上皮细胞的任何物理特性。然而,它预测这些特性会影响组织折叠的幅度和极性。在这里,我们的重构组织和FEM模型将覆盖材料视为具有可忽略的弯曲模量。因此,在重构组织的上表面附近的凝聚总是形成凹曲率的区域。然而,如果覆盖材料具有比间充质更高的弯曲模量,则建模预测曲率方向的反转,将内陷转换为外翻(图6)。该模型进一步表明在凝聚事件期间上覆层的重合横向压实,形成类似于基板的结构。这些研究留下了一个有趣的可能性:源于间充质的旁分泌信号可以用于设定上覆上皮的机械性质,从而确定在凝聚事件期间折叠的方向和大小。这种间充质上皮相互作用的观点可以解释上皮和间充质的不同组合如何通过组织力学和旁分泌信号传导之间的相互作用转变为显着不同的组织结构。结合上皮在组织屈曲中的确定作用,我们的结果表明,机械活性组织成分的组合可以协作以启动和加强组织折叠的图案、极性和幅度(Hirashima,2014;Lecuit等,2011;Nelson,2016;Odell等,1981;Oster和Alberch,1982;Savin等,2011;Shyer等,2013;Tallinen等,2016;Vamer等,2015)。

  除了与发育生物学的相关性之外,我们的研究提出了可以容易地实现对细胞-ECM复合材料的材料和物理性质的动态控制的可能性。在这种观点中,从头构建组织是一个4D过程-其中初始组织结构以3D形式组装,但根据特定的发展原则在多个长度尺度上及时演变,最终融合到具有更明确和逼真的结构特征的新3D结构上。这种方法可以显着改善中尺度器官组织模型的结构、成熟和血管形成(Lancaster和Knoblich,2014;Takebe等,2015)。我们相信这些努力对于疾病的体外模型的工程化、再生医学以及诸如软机器人中的有生命活性材料的未来应用具有重要意义。

  图4.通过间充质凝聚机制重构组织折叠。(A)脊椎动物胚胎中组织层界面处的形状转变通常与向内或向外弯曲部位的间充质细胞的凝聚相吻合。(B)沿着界面的细胞会聚在焦点上并且在间充质凝聚期间表现出三个特征。(C)使用DNA编程的细胞组装重建凝聚,以在含有胶原基质纤维的ECM凝胶的上表面和下表面附近构建小细胞簇。(D)应变场由细胞簇在其纤维细胞外微环境中的牵引施加,局部排列胶原纤维并产生导致组织屈曲的平面内力(E)。

  图5.重构系统表现出间充质凝聚的特征并沿着可预测的轨迹折叠。(A)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的图案化网格朝向中心焦点会聚。细胞网格及其下方ECM的径向应变的独立测量显示在组织-培养基界面处的基质压实是主要贡献者(平均值±SEM,n=3)。(B)MEF簇使胶原纤维排列数百微米。有限元模型(FEM)中的弹性边缘的类似对齐发生在由活动边缘组成的收缩节点之间,活动边缘的长度可以减小以通过细胞簇模拟局部凝胶应变。(C)激光烧蚀后的凝胶收缩意味着沿簇之间的轴线(在线)相对于正交轴的拉伸力显着更高,在FEM中具有相似的行为(离线,单因素方差分析与Holm-Sidak的多重比较测试,每组n>9个切口)。(D)各向同性MCC和各向异性MEF簇网格的校准曲线,其定量地编码xz和yz平面中的重构组织的曲率(平均值±SEM,每个网格几何形状n>2)。(B)中的FEM的3D版本广泛地捕获这些曲率关系。

  图6.组织界面处的ECM张力导致内陷或外翻,这取决于层力学的差异。(A)由弹性网络组成的有限元模型,该弹性网络经受在两层A和B的界面处通过有效边缘施加的内部平面应变,所述两层A和B具有不同的非有效边缘刚度k1,A和k1,B。(B)通过将其长度从s=1减小到s=0.5而在有效边缘上施加应变,触发界面处的曲率,其大小和符号取决于非有效边缘刚度比k1,A/kk1,B,(C)。此外,随着模型中的总体刚度(k1,A+kk1,B)减小,应变部位处的基板样增厚更加明显。

  图7.通过DNA编程的细胞组装(DPAC)的微流体整合重构组织。(A)重建的组织内置在由玻璃显微镜载玻片制成的玻璃流动池中,玻璃显微镜载玻片通过垫圈间隔开。顶部玻璃载玻片每个流通池包含两个通孔,以实现流体通路。凝胶中的收缩性细胞位置由DPAC或标准细胞排列技术编码(图8)。在DPAC中,细胞和载玻片上的互补DNA链用于将细胞导向每个流动池的上表面和/或下表面的特定xy位置。然后加入液体凝胶前体并固定,最后(B)分离载玻片,并通过手工解剖或通过激光显微切割,切割重构的组织。在这里,我们使用小鼠胚胎成纤维细胞簇的各向同性网格来编码帽形状。(C)共焦成像(这里,中平面xy和xz截面)使得能够通过计算重建网格对象来通过拟合圆或测量局部曲率来测量对象范围的曲率,所述网格对象可以与来自FEM的对应网格进行半定量比较。

  图8.通过非接触式细胞印刷重构组织。(A)可以浇铸ECM凝胶,然后使用非接触式阵列器以半干燥形式印刷细胞。(B)小鼠胚胎成纤维细胞成功附着在松散的簇中。(C)携带各向同性网格的细胞印刷的重构组织在培养6小时后表现出弯曲。

  图9.细胞簇是各向同性的吸引子,其以依赖于细胞类型的速率径向排列胶原。(A)嵌入富含胶原蛋白的ECM凝胶表面的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)局部对齐荧光标记的胶原1纤维并随时间诱导界面曲率。(B)左,由MEF或间充质样癌细胞(MCC)簇诱导的平均胶原定向图。右,通过沿x和y轴以及相对于簇的两个半径(r)对感兴趣区域(ROI)中的平均图像取向进行采样来量化纤维取向。(C)在2D弹性有限元模型中观察到的相应的径向对准。(D)对准过量(平均ROI取向-在t=0时的取向,平均值±SEM,每个条件n>4)沿x和y轴是等效的,并且对于分离的MEF簇而言在6小时时比对于MCC簇更高。(E)6小时的比对径向地远离MEF和MCC簇衰变(平均值±SEM,每个条件n=12)。使用Holm-Sidak的多重比较检验,通过单向ANOVA分析(D)和(E)中的比对过量数据。(F)在应用有效边缘应变时,在FEM中也观察到x和y的类似对准过大量。(G)在模型中观察到类似的对准过量的径向空间衰减。

  图10.细胞簇对在几百微米的距离上放大它们之间的胶原纤维排列。(A)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)簇之间的胶原带形成。(B)左,由三个距离范围分开的簇的平均胶原取向图。右,通过从每对中的左手簇沿x和y轴以50μm的ROI取样平均取向来量化纤维取向。(C)对于6小时的所有距离范围,以及对于间充质样癌细胞(MCC)簇对,MEF簇(沿x)之间的比对过量高于正交方向(沿y),除了最大距离外,其中簇似乎表现为孤立的各向同性吸引子(即,对准场在此时间点没有耦合在一起)。比对过量绘制为平均值±SEM,每个条件n>4,通过Holm-Sidak多重比较检验的单向ANOVA分析。(D)在应用有效边缘应变时,在有限元模型中观察到沿簇之间的轴线的对准过量的类似增加。(E)隔离的一对MEF簇之间的带形成与局部界面曲率的空间扩展区域一致。

  图11.重构组织曲率由致动细胞对凝胶施加应变的速率确定。(A)上图,细胞应变率是通过测量富含胶原蛋白的ECM凝胶上的间充质样癌细胞(MCC)系克隆(MCC1-3)和原代人乳腺成纤维细胞(乳腺癌)的单个细胞附近的珠子位移来推断的。插图:单个MCC2细胞施加牵引力,导致局部珠子位移。下图,中平面xy共焦部分显示折叠状态的变化取决于细胞类型,其可通过评估重建组织曲率来量化。(B)从(径向)最大曲率轨迹的初始斜率相对于时间确定d=181μm各向同性组织的曲率。(C)由给定的致动细胞类型诱导的组织曲率(平均值±SEM,每个细胞类型n>2)与其应变率近似成比例。

  图12.各向同性的重构组织遵循单调曲率轨迹。(A)左图,用于收缩的间充质样癌细胞(MCC)簇的各向同性网格图案化的ECM凝胶的曲率测量程序的示意图。右图,xy共聚焦截面显示重构组织以随网格密度变化的速率增加曲率。(B)由指定间距的MCC簇网格致动的各个组织的曲率轨迹。曲率似乎在凝胶厚度的数量级处的半径处饱和。

  图13.在消融致动器细胞后,重组的组织仅部分展开。(A)用20μM星形孢菌素(非特异性激酶抑制剂)杀死间充质样癌细胞,通过xy共聚焦截面观察到,导致预折叠各向同性组织曲率的适度减少,并绘制为相对于在加入星形孢菌素之前立即的每个重建组织中平均最大曲率的最大曲率(每个条件n=4个重构组织,绘制为平均值±95%置信区间包络线)。(B)在标准组织培养塑料上培养的细胞的单独实验中测定星形孢菌素的功效,其中20μM星形孢菌素足以引起几乎完全的细胞死亡(细胞存活率绘制为平均值±SEM,n=6)。

  图14.各向异性折叠的保真度受到收缩性簇迁移的限制。(A)左图,示意图描绘了用间充质样癌细胞(MCC)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)簇的各向异性网格图案化的重构组织的曲率测量。右图,xy共焦区域和重建网格显示各向异性MEF网格沿着预期轴线引起各向异性折叠,而各向异性MCC网格则没有。(B)曲率各向异性随着MEF重构组织的簇间距各向异性而增加,但对MCC组织没有。(C)在与(D)相同的实验中定量各向异性网格中的细胞迁移。我们量化了使细胞从它们的初始位置到达簇间距d/2的一半的距离的中位时间τd/2。(D)对于各向同性和各向异性MCC和MEF网格,通过胶原带定向相对于水平的最大仓值归一化的径向条形图。注意MCC网格在15小时时有明显的离轴带方向,但不适用于MEF网格。

  图15.间充质凝聚足以将组织界面雕刻成不同的3D形式。(A)使用3D有限元模型构建的五个折叠图案。(B)收缩节点位置编码模型螺旋和管状组织,显示为由局部平均曲率C和中间组织截面着色的网状物。(C)共聚焦显微照片的重建,作为在两个成像时间点的相应组织的曲率映射网格。(D)、(E)可显影的波纹组织和不可显影的相对的帽组织。通过将小鼠胚胎成纤维细胞定位在重构组织的顶部(橙色)和底部(白色)表面上来编码相反的曲率。围绕y轴以10°增量方位角安装在每个帽上的中间组织切片显示出相邻帽之间以及模型组和实验组织之间的可比较的曲率轮廓。(F)、(G)通过使用激光显微切割的策略性切割实现折叠的球形和立方体重构组织。

  图16.卷曲、管和波纹重构组织的截面分析。(A)图15B和15C中的卷曲组织的实验和模型网格以及正交视图。(B)图15B和15C中管的网格和视图。(C)图15D和15E中的波纹组织的xy平面和几个xz截面。

  图17.双帽、球形、立方体和Miura重构组织的截面分析。(A)通过图15D和15E中双帽组织的帽中心的实验和模型网、xy截面和yz截面。作为xy平面中的角度的函数的安装在帽上的圆圈显示出曲率均匀性。(B)图15F和15G中球体的网格和正交视图。(C)图15F和15G中立方体的网格和正交视图。(D)在图19B中15小时沿Miura镶嵌长度的实验和模型网格和xz截面。

  图18.在重构组织中相对的折叠对于弹出通过缺陷是稳固的。(A)简单的相对折叠是四折叠顶点。我们量化了重构组织的每个折叠的曲率,其中在相对的折叠(折叠2)中图案化不同数量的小鼠胚胎成纤维细胞簇。(B)对于沿相对折叠的较少数量的簇,它向外突出到不正确的方向,而它以正确的方向出现簇数,其比率高于相邻折叠中簇的平均数的0.75倍(用线性最小二乘拟合绘制的比率和实验数据的95%置信区间包络线)。(C)在弹出和正确的折叠配置中重构组织的网格重建。

  图19.间充质凝聚驱动的组织折叠对于复杂折叠附近的多种细胞类型的同时自组装是稳健的。(A)胚胎第16天(E16)鸡肠腔显示出锯齿状的Miura样折叠,其可以通过平铺由凝聚小鼠胚胎成纤维细胞簇编码的四折叠顶点图案来重建。(B)模型和实验折叠显示具有匹配折叠周期和幅度的多个xz轮廓。(C)对于间充质和其他成纤维细胞类型,含胶原的ECM液滴的收缩发生的程度要大得多(平均值±SEM,n=4,单向ANOVA与Holm-Sidak的多重比较检验)。(D)人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)在Miura组织中沿着相邻的四折顶点图案的折叠图案化为三叉的线(E)。(F)代表性横截面显示由Miura折叠和Caco2细胞包裹的内腔化HUVEC帘线,其沉积为嵌入组织上表面内的部分连续层。Caco2细胞簇在凹陷的折叠内形成收缩性成纤维细胞的顶部。

  图20.乘客HUVEC沿着新生折叠表现出偏向的运动性。(A)在由小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)驱动的n=9个四折顶点重构组织中,在三折等效极性的会聚点处对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的贴片进行图案化。在6小时后测定HUVEC的空间分布,并与其中不存在MEF以致动折叠的对照组织的空间分布进行比较。在6小时折叠具有<1毫米-1最大曲率,使得在细胞位置的测量视差可以忽略。(B)局部平均径向细胞距离图显示沿新生折叠的HUVEC迁移偏差。

  实施例2:在弯曲的体内位点的间充质细胞凝聚与胶原1压实和对准相关联

  我们的研究广泛地表明,在生物弯曲体内部位(在肠道绒毛和鸡皮肤芽处)的间充质细胞凝聚与我们在重建的组织模型中产生的类似的胶原蛋白1压实和排列相关。

  图21.(A).胚胎小鼠中的肠绒毛与PDGFR阳性间充质成纤维细胞在绒毛曲率位点处的凝聚形成一致。这些簇与胶原蛋白1原纤维对E-钙粘蛋白阳性上皮的局部排列和压实相关。在未显示的结果中,我们发现在用肌球蛋白II抑制剂布比他汀(blebbistatin)处理的外植肠中不发生细胞聚集和胶原蛋白1重塑,其阻断了系统中的细胞机械收缩性。B)胚胎鸡中的羽毛芽从平坦的上皮形成,并且可以用非特异性溴化乙锭染色显现。Hamburger-Hamilton(HH)阶段32的小鸡皮外植体在培养物中形成羽毛芽,但在布雷他汀存在下破坏羽毛芽间距和高度。

  尽管已经通过图解和实施例,以一些细节描述了前述发明,为了清楚理解的目的,但是鉴于本发明的教导,对于本领域技术人员容易显而易见,可对其做出某些改变和修饰,而不背离所附权利要求的精神或范围。也应理解,本文使用的术语仅仅为了描述具体实施方案的目的,并且不旨在是限制性的,因为本发明的范围仅仅由所附的权利要求限制。

  因此,前述仅仅阐释了本发明的原理。认识到本领域技术人员能够想到各种布置,其尽管未在本文明确描述或显示,但体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外,本文叙述的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解由发明人为将来的技术所贡献的本发明的原理和概念,并且应解释为但不限于这种具体叙述的实施例和条件。而且,本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体例子的描述旨在包括结构和其功能等同方案。另外,期望这种等同方案包括目前已知的等同方案和将来发展的等同方案,即,发展的实施相同功能的任何要素,无论结构如何。所以,本发明的范围不旨在限于示例性实施方案显示和本文所述的。相反,本发明的范围和精神由所附的权利要求体现。

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