辨识中医阴阳属性体质的外周血基因标志物及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种辨识中医阴阳属性体质的外周血基因标志物及其用途。
背景技术
中医理论是把人体作为一个整体，将人体分为阴、阳两个既对立，又统一的属性，运用朴素的阴阳五行学说来阐述生命运动的规律，说明健康与疾病的问题。中医理论用阴阳学说从生理功能特点对人的体质属性加以区分，反映个体在非疾病状态下存在的生理特异性。中医体质学主要是根据中医学阴阳、五行、脏腑、精、气血津液等基本理论来确定人群中不同个体的体质差异性，具体分类方法有阴阳分类法、五行分类法、脏腑分类法、体型分类法，以及禀性勇怯分类法等，其中，阴阳分类法概括体质分类的总纲，理想的体质应是阴阳平和之质，但是阴阳的平衡是阴阳消长的动态平衡过程，总是存在偏阴或偏阳的状态，因此可以将人的体质大致可分为阴阳平和质、偏阳质和偏阴质三种类型，其中阳性体质(偏阳质)和阴性体质(偏阴质)都处于阴阳失衡的状态，虽然尚未超过机体的调节和适应能力，属于正常生理状态，但也容易诱发相应的疾病。因此有必要对阳性体质(偏阳质)和阴性体质(偏阴质)加以甄别判断，进行针对性的预防和干预，避免最终发展为疾病。
中医体质辨识对于疾病预防和干预具有重要意义，不同体质的个体在宏观上都存在与之对应的易发疾病(疾病易感性)，通过综合运用中医“天人合一”的整体观、“体病相关、体质可分、体质可调”的中医体质学说理论和中医调理方案，可以实现“未病先防”和“既病防变”的治未病目标。按照不同的体质分类，可以提供体质相关的疾病易感性分析和风险评估，从而依据不同体质进行针对性的健康养生指导和干预服务，从根本上减少疾病的发病率和死亡率。
但是，传统中医通过“望、闻、问、切”四诊对人的体质进行辨识，辨识方法还停留在唯象判断的阶段，缺乏客观的判别指标，容易受医生主观判断、受检者外在差异等因素的干扰，往往导致不同医生对同一病人体质辨识的一致性较差，严重影响了体质辨识的准确性。目前，虽然在中医四诊的基础上开发了一些基于图像识别、脉博计数等方法的中医体质辨识仪器，一定程度上提高了体质辨识的准确性，但并未从根本上改变中医体质辨识完全依赖外在表象进行判断的问题，难以实现中医诊断、治疗过程的标准化，严重制约中医在疾病早期预防和干预中的作用。市场上迫切需要一种基于客观分子指标、操作简便、准确的中医体质辨识方法。
人体是阴与阳的平衡体，其生命运动，通过水、金、土、火、木五种基本元素之间的相互资生又相互制约关系、即蕴涵五行相生相克原理，维系着整个生命体的动态平衡。血液是人体最大的组织器官，血细胞可以同几乎所有组织细胞进行信息交流，在维系生命体动态平衡方面发挥着重要的作用。当体内组织器官发生损伤、炎症等疾病时，病变组织细胞周围的微环境会发生一系列的特异性改变。当血液流经各组织器官时，病变组织细胞的微环境与血细胞进行信息交换，而血细胞会直接或间接地响应这些改变，发生相应的基因表达变化，参与免疫系统等全身各系统的信息传递和交换。血细胞的这种基因表达变化远早于机体产生明显的外在体征变化，因此，通过紧密监测血细胞基因的表达谱，可以敏感地捕捉到体内生理活动是否失衡，在微观基因层次上反映机体宏观的阴、阳平衡状态，为中医阴、阳体质辨识提供可靠、客观的分子证据。而且外周血基因表达检测作为一种简便、无创性的检查方式，受检者易于接受，对建立中医体质相关的疾病预防和干预体系、推动中医诊疗的标准化和指导确定疾病治疗原则都具有重要意义。
发明内容
本发明要解决目前中医体质辨识依赖唯象判断，缺乏客观、准确检测指标(生物标志物)的技术问题，提供一种辨识中医阴阳体质的外周血基因标志物，该标志物可以比较准确的判别阴性体质和阳性体质，具有很高的检测准确性、敏感性和特异性，而且仅需要采集2ml外周静脉血进行检测，检测过程简便，特别适于大规模的人群体质辨识，根据个人体质特点制定相应的易感疾病防治原则，因人而异的开展易感疾病预防和干预。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种包含多个多核苷酸或其片段的组合产品，所述多个多核苷酸在中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)人群的外周血中差异表达，该多个多核苷酸的序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的EIF2S3、AK2、TROVE2、MARCH2、PAG1这5个中医阴阳体质特征基因序列。
在本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含用于检测在中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)人群外周血中基因差异表达的引物和/或探针，所述基因的序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴阳体质特征基因序列。
在本发明的另一方面，还提供了上述包含多个多核苷酸或其片段的组合产品的用途，用于制备辨识中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)的产品。
优选的，所述辨识中医阴性体质与阳性体质的产品包括：用实时定量PCR、RNA测序或基因芯片检测中医阴性体质、阳性体质的产品。
所述用实时定量PCR辨识中医阴性体质和阳性体质的产品包含特异扩增SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴阳体质特征基因序列的引物。
所述用基因芯片检测鉴别诊断或筛查超早期肺癌的产品包含：与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴阳体质特征基因序列杂交的探针。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于辨识中医阴性体质和阳性体质的检测试剂盒，所述试剂盒包含特异性针对SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴、阳体质特征基因序列的引物和/或探针。该试剂盒还包含特异性针对GAPDH内参基因序列的引物。
优选的，所述试剂盒还包含与PCR扩增片段特异性结合的荧光探针或非特异性结合的SYBR Green染料。
优选的，所述引物的序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.17所示(包括内参基因的引物)；所述荧光探针的序列如SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.23所示(包括内参基因的探针)。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于辨识中医阴性体质和阳性体质的检测芯片，所述芯片包含与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴阳体质特征基因序列杂交的探针。
利用本发明的试剂盒或检测芯片，可以检测受检者外周血中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示中医阴阳体质特征基因序列的表达情况，然后根据表达上调或下调的信息，输入中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)甄别模型即可得出受检者的阴、阳体质类型，从而实现对中医阴、阳体质的辨识。
此外，由于中医理论将人体分为阴、阳两种体质是总纲，按五行金、木、水、火、土又可细分为阴虚、阳虚、气郁、血瘀、痰湿五种体质，因此，利用本发明甄别出的中医阴、阳体质，还可以进一步利用甄别阴虚、阳虚、气郁、血瘀、痰湿五种体质的外周血特征基因标志物辨识阴虚、阳虚、气郁、血瘀、痰湿这五种体质，或用该五种体质的外周血特征基因标志物直接辨识阴虚、阳虚、气郁、血瘀、痰湿这五种体质。
本发明的基因标志物，能对受检者的中医阴性体质和阳性体质进行准确辨识，检测敏感性高、特异性强，且由于是以临床上最易采集的外周血为检测样本，采样方式无创，检测方便，适用于大规模人群的中医体质辨识检查，针对体质相关的易感疾病，采取相应的预防和干预措施，在健康管理、疾病预防、医疗干预市场具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例2利用筛选出的5个中医阴阳体质特征基因组合(5-gene Panel)对中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)样本进行甄别的箱线图(图1A)，以及中医阴、阳体质甄别模型对135例样本预测结果列表图(图1B)；
图2是本发明实施例2利用筛选出的5个中医阴阳体质特征基因和体质甄别模型对135例样本进行阴、阳体质辨识的ROC AUC图。
具体实施方式
针对目前中医体质辨识依赖唯象判断，缺乏客观、准确检测指标(生物标志物)的技术问题，本发明提供了一种用于中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)辨识的外周血基因标志物。本发明以外周血基因表达谱定量检测为基础，通过定量分析中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)人群的外周血总RNA的基因表达差异，基于逻辑回归统计学方法在外周血基因表达谱中筛选出5个辨识中医阴、阳体质的特征性差异表达基因，即外周血中中医阴阳体质特征性的基因表达信号(生物标志物)，并且构建相应的中医阴、阳体质甄别模型。然后，采用荧光定量RT-PCR、基因表达谱芯片或RNA测序等技术定量检测受检者外周血中该5个中医阴阳体质基因标志物的相对表达量，结合中医阴阳体质甄别模型对体质进行预测，从而辨识受检者的阴阳体质类型。
实施例1 辨识中医阴阳属性体质的外周血特征基因标志物的筛选
辨识中医阴阳属性体质特征基因的筛选包括以下步骤：
1)收集按中医四诊确认的50例阴性体质(偏阴质)和50例阳性体质(偏阳质)人群的外周血样本，每例样本采集2-3ml肘静脉血。
2)采用PAXgene Blood RNA Kit抽提试剂盒提取上述样本的总RNA，用AgilentBioanalyzer 2100生物分析仪检测RNA样本的片段完整度(RIN)，用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度。所有RNA样本必须符合以下质控条件：RNA产率大于2微克，28S/18S峰的比值大于1，RIN值大于7，260nm/280nm的吸光度比值大于1.8。
3)采用Affymetrix Gene Profiling Array U133Plus2芯片(人类全基因表达谱芯片)检测上述外周血总RNA样本，获得样本的外周血基因表达谱数据，然后采用AffymetrixExpression Console软件中的MAS5方法对外周血基因表达谱数据进行归一化(Normalization)处理，消除表达谱芯片检测过程中可能产生的系统误差，获得可以统一比较的外周血基因表达谱数据。
4)剔除外周血基因表达谱中过高和过低的基因表达信号，选择在所有样本中均有适度表达(信号值在100-10000之间)的基因进行T检验分析，比较中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)人群的外周血基因表达差异，将统计学P值小于0.05、基因表达倍数变化在1.1倍以上的基因作为候选基因进行后续分析。
5)分析上述侯选基因与阴性体质的相关性，按基因与阴性体质的相关性系数高低进行排序，挑选出一组与阴性体质具有高度相关性的基因队列(基因队列I)；此外，将剩余基因与队列I中的基因进行相关性分析，挑选出与基因队列I具有高度相关性的另一组基因队列(基因队列II)。然后将基因队列I和基因队列II中的基因两两配对，组成一系列侯选基因组合。
6)用逻辑回归统计分析方法评估每种侯选基因组合对阴、阳体质的甄别作用，计算每种侯选基因组合的受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)和曲线下面积值(Area Under Curve，AUC)，筛选出对中医阴、阳体质具有良好甄别能力的一系列基因组合。
7)利用实时荧光定量PCR方法对筛选出的系列基因组合进行验证，保留在定量PCR和基因表达谱芯片检测中表达变化一致的基因作为甄别中医阴阳体质的外周血特征基因，筛选出EIF2S3、AK2、TROVE2、MARCH2、PAG1等5个中医阴阳体质特征基因，该5个中医阴阳体质特征基因序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。
8)用逻辑回归统计分析方法评估上述5个基因构成的基因组合(Panel)对中医阴阳体质的甄别作用，计算该基因组合的ROC AUC，建立以下所示的中医阴阳体质甄别模型：
其中，P为阴性体质的概率值；b0至b5分别为相应的逻辑回归模型参数；ΔCt1至ΔCt5分别为5个阴阳体质基因标志物与内参基因的定量PCR循环数Ct值的差值；X为逻辑回归对数似然比(log likelihood ratio)。
实施例2 利用筛选出的中医阴阳属性体质特征基因标志物甄别阴阳体质
1.方法步骤：
1)待检测样本外周血样品的收集：使用QIAGEN公司的BD PAXgeneRNA采血管收集病人外周血样品；
2)待检测样本外周血样品中总RNA的提取纯化：使用QIAGEN公司的PAXgeneBlood RNA Kit提取纯化外周血中的总RNA，并用Agilent BioAnalyzer 2100型微量电泳分析仪鉴定提取的总RNA片段完整性和产量。用Nano1000微量紫外分光光度仪检测RNA样本的纯度；
3)反转录反应：使用Life Techonolgy公司的High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit反转录试剂盒，使用总RNA为模板，以Olig(dT)为逆转录引物，进行逆转录反应合成cDNA。
4)荧光定量RT-PCR检测：根据5个基因标志物(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5)及内参基因GAPDH的相关序列，设计特异性引物SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.17(其中，引物SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.7用于特异性扩增SEQ ID NO.1所示的EIF2S3基因标志物，引物SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9用于特异性扩增SEQ ID NO.2所示的AK2基因标志物，引物SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.11用于特异性扩增SEQ ID NO.3所示的TROVE2基因标志物，引物SEQ ID NO.12～SEQ ID NO.13用于特异性扩增SEQ ID NO.4所示的MARCH2基因标志物，引物SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.15用于特异性扩增SEQ ID NO.5所示的PAG1基因标志物，引物SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.17用于特异性扩增内参基因GAPDH)，以该SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.17为引物，以SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.23为荧光探针(其中SEQ ID NO.18～SEQ ID NO.22分别为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5特征基因序列的探针序列，SEQ ID NO.23是内参基因GAPDH的探针序列)或者采用可与PCR扩增片段非特异性结合的SYBR Green染料，利用反转录获得的cDNA作为扩增模板，进行实时荧光定量RT-PCR反应，利用GAPDH基因作为内参基因，获得该5个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量。下述表1所列为荧光定量PCR反应体系。
表1 荧光定量PCR反应体系
5)待检测样本结果的诊断：根据实时荧光定量PCR检测的EIF2S3、AK2、TROVE2、MARCH2、PAG1这5个基因标志物在外周血样本中的mRNA相对含量，通过实施例1建立的阴阳体质甄别模型，计算样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的检测结果判定为阴性体质(偏阴质)；X值<0的检测结果判定为阳性体质(偏阳质)。
2.结果
共采集了66例中医阴性体质(偏阴质)、69例阳性体质(偏阳质)人群的外周血样本，用荧光定量RT-PCR检测了外周血中5个阴阳体质特征基因标志物以及内参基因GAPDH的相对表达量，计算每个样本的逻辑回归对数似然比X值，X值≥0的视为阴性体质结果，反之视为阳性体质结果。将检测结果与中医四诊所得阴阳体质结果比较，得出本发明5个基因标志物可以较好的辨识中医阴性体质(偏阴质)与阳性体质(偏阳质)，对阴性体质(偏阴质)的检测灵敏度、特异性均超过85％，准确度达到90％，具体检测结果见图1-2和下表2所示。
表2 对中医阴、阳体质辨识的准确性、灵敏度、特异性和ROC AUC值
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 北京丰亚医学研究院
<120> 辨识中医阴阳属性体质的外周血基因标志物及其用途
<141> 2017-09-06
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