用于直接从FFPE组织样本生产DNA文库的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月5日提交的美国临时专利申请号62/581,713的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开一般性地涉及用于基因测序的组织样本制备领域；更具体的是，涉及直接从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织样本中生产脱氧核糖核酸(DNA)文库的方法和组合物。
背景技术
FFPE组织是用于临床癌症诊断和研究的DNA和核糖核酸(RNA)的最重要来源之一。这种诊断和研究通常使用称为下一代测序(NGS)的高级基因测序技术来完成。涉及NGS的诊断程序通常涉及检测从一个或多个FFPE组织样本制备的DNA文库中的低频体细胞突变，这种突变是患者癌症进展的关键指标。
制备这种DNA文库的最常用方法之一涉及使用QIAGEN Gmbh销售的DNA FFPE组织试剂盒纯化基因组DNA。另一种流行的方法涉及使用由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的IonDirect FFPE DNA试剂盒。然而，所有这些组织制备试剂盒及其随附的程序都充满了挑战。
例如，图1显示了从FFPE组织样本制备DNA文库的已知方法的某些步骤。图1中所示的步骤类似于涉及DNA FFPE组织试剂盒的文库制备程序的某些步骤。此类程序通常需要来自多个安装于载玻片上的FFPE样本的组织。当需要多次运行NGS时，这会快速耗尽样品供应。FFPE载玻片也在芳族溶剂如二甲苯中脱石蜡。然而，二甲苯的健康危害已有详细记载，长期接触二甲苯的人可能会出现头痛，头晕，恶心和呕吐(见Kandyala，R.，Raghavendra，S.P.C，Rajasekharan，S.T.(2010)。An overview of its health hazards and preventive measures.Journal of Oral and Maxillofacial Pathology,14(1):1)。脱石蜡后，将FFPE载玻片在乙醇中洗涤以置换基于二甲苯的溶液，然后用手术刀或剃刀刀片刮擦载玻片上暴露的组织样本，并将其转移到试管或反应管中。然后将收集的组织样本进行蛋白酶K消化步骤以消化污染蛋白质，并加入裂解缓冲剂以裂解剩余的污染细胞组分。然后将裂解物转移到包含由二氧化硅膜制成的微型柱的反应管中。然后将另外的缓冲剂加入到反应管中，并将整个管离心以将来自组织样本的DNA结合到微型柱上。然后将微型柱转移到收集管中并加入洗脱缓冲剂。最后将管离心以从微柱中洗脱DNA。然后可以将DNA扩增试剂加入到洗脱的DNA中，然后可以对这种混合物进行扩增反应以产生DNA文库。
从图1中可以看出，目前从FFPE组织样本制备DNA文库的方法通常费力且耗时(例如，长达72小时)。这些方法还需要多种试剂和缓冲剂，并且易受临床医生错误的高风险的影响。虽然其他方法，例如涉及IonDirect FFPE DNA Kit的方法，已经用二甲苯消除了脱石蜡步骤，但这些方法需要将FFPE组织样本溶解在矿物油中，并需要多种试剂和加热步骤来从组织样本中提取DNA。然后需要额外的步骤以使用来自另外的DNA扩增试剂盒的试剂制备用于进一步扩增的提取的DNA。
因此，需要一种解决方案，其与常规方法相比减少了从安装于载玻片上的FFPE组织样本制备DNA文库所需的操作步骤的数量，同时保持或改善靶序列产率的数量和质量。与传统方法相比，这种解决方案应该具有成本效益，需要更少的时间，并且应该降低临床医生或操作员错误的风险。
发明内容
本文公开了用于直接从安装于基板(例如，安装于载玻片)的FFPE组织样本生产DNA文库的方法和组合物。在一个实施方案中，公开了制备DNA文库的方法，包括将试剂混合物液滴施加到安装于基板的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织样本上。例如，FFPE组织样本可以安装在载玻片上，例如玻璃载玻片。
在一个实施方案中，施加到FFPE组织样本上的试剂混合物的液滴可以使用与移液管连接的宽孔移液管枪头来施加。宽孔移液管枪头可具有介于约1.00mm至约1.25mm之间的孔内径。
当FFPE组织样本处于约0℃至大约23℃之间的温度时，可以将试剂混合物的液滴施加到FFPE组织样本上。在一个实施方案中，施加到FFPE组织样本上的试剂混合物的液滴体积可为约20微升(μL)。
在一些实施方案中，试剂混合物可包含一种或多种缓冲液，辅因子，非离子表面活性剂，甘油溶液，明胶溶液，多种dNTP，DNA聚合酶，和包含多种正向引物和反向引物的引物池。
该方法还可以包括在载玻片上以圆周运动搅拌试剂混合物的液滴，同时刮擦安装在载玻片上的FFPE组织样本的部分，以产生包含试剂混合物和FFPE组织样本的部分的反应混合物。在一些实施方案中，试剂混合物的液滴可以以顺时针圆周运动、逆时针圆周运动或其组合在载玻片上被搅拌。相同的宽孔移液管枪头也可用于搅拌载玻片上的试剂混合物的液滴，同时还刮擦安装在载玻片上的FFPE组织样本的部分。在吸出反应混合物之前，可以将载玻片上的试剂混合物的液滴搅拌约1分钟至5分钟。
该方法可以进一步包括将反应混合物从载玻片直接吸入移液管枪头并将反应混合物分配到反应容器中。在一些实施方案中，可以将反应混合物吸入宽孔移液管枪头并从宽孔移液管枪头分配到反应容器中。
该方法还可以包括使反应混合物在反应容器中进行聚合酶链式反应(PCR)方案。PCR方案可包括以下步骤：(i)在第一温度下加热反应混合物以在活化步骤中活化DNA聚合酶；(ii)在第二温度下进一步加热反应混合物，以在变性步骤中使反应混合物中的核酸变性；(iii)将温度降低到第三温度以允许退火和延伸；(iv)重复步骤(ii)和(iii)至少24个循环。
在一个或多个实施方案中，PCR方案的第一温度可以是约95℃，PCR方案的第二温度可以是约99℃，并且PCR方案的第三温度可以是约60℃。
在一个或多个实施方案中，本文公开的方法可以应用于FFPE组织样本，其包含以下中的至少一种：FFPE膀胱组织样本，FFPE乳腺组织样本，FFPE宫颈组织样本，FFPE结肠直肠组织样本，FFPE食道组织样本，FFPE胃组织样本，FFPE肾组织样本，FFPE肝组织样本，FFPE肺鳞状组织样本，FFPE淋巴样组织样本，FFPE皮肤组织样本，FFPE鼻咽组织样本，FFPE卵巢组织样本，FFPE前列腺组织样本和FFPE甲状腺组织样本。
在另一个实施方案中，还公开了制备包含FFPE组织样本的PCR混合物的方法。该方法包括将试剂混合物液滴施加到FFPE组织样本上。FFPE组织样本可以安装在诸如载玻片的基板上。在一个实施方案中，可以使用连接到移液管的宽孔移液管枪头将试剂混合物的液滴施加到FFPE组织样本上。宽孔移液管枪头可具有约1.00mm至约1.25mm之间的孔内径。
当FFPE组织样本处于约0℃至约23℃之间的温度时，可以将试剂混合物的液滴施加到FFPE组织样本上。在一个实施方案中，施加到FFPE组织样本上的试剂混合物的液滴体积可为约20微升(μL)。
在一些实施方案中，试剂混合物可包含一种或多种缓冲液，辅因子，非离子表面活性剂，甘油溶液，明胶溶液，多种dNTP，DNA聚合酶，和包含多种正向引物和反向引物的引物池。
该方法还可以包括在载玻片上以圆周运动搅拌试剂混合物的液滴，同时刮擦安装在载玻片上的FFPE组织样本的部分，以产生包含试剂混合物和FFPE组织样本的部分的PCR混合物。在一些实施方案中，试剂混合物的液滴可以以顺时针圆周运动、逆时针圆周运动或其组合在载玻片上被搅拌。相同的宽孔移液管枪头也可用于搅拌载玻片上的试剂混合物的液滴，同时还刮擦安装在载玻片上的FFPE组织样本的部分。在吸出PCR混合物之前，可以将载玻片上的试剂混合物的液滴搅拌约1分钟至5分钟。
该方法可以进一步包括将PCR混合物从载玻片直接吸入移液管枪头并将PCR混合物分配到反应容器中。在一些实施方案中，PCR混合物可以被吸入宽孔移液管枪头并从宽孔移液管枪头分配到反应容器中。
在另一个实施方案中，公开了用于处理安装于载玻片的FFPE组织样本的试剂溶液。试剂溶液可包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)-盐酸(HCl)缓冲液，氯化钾(KCl)缓冲液，氯化镁(MgCl2)溶液，聚山梨醇酯20溶液，甘油溶液，明胶溶液，多种dNTP和Taq DNA聚合酶。
在一个实施方案中，Tris-HCl缓冲液可以是pH为约8.0且浓度为约60.0mM至约90.0mM的Tris-HCl缓冲液。在该实施方案和其他实施方案中，KCl缓冲液可具有约100.0mM至约150.0mM的浓度。
在一些实施方案中，MgCl2溶液可具有约2.0mM至约5.0mM的浓度。在一个或多个实施方案中，聚山梨醇酯20溶液可以是试剂溶液总体积的约0.01％(v/v)至约0.30％(v/v)。在这些和其他实施方案中，甘油溶液可以是试剂溶液总体积的约10.0％(v/v)至约30.0％(v/v)。在一些实施方案中，明胶溶液可以是试剂溶液总体积的约0.01％(v/v)至约0.80％(v/v)。
附图的简要说明
图1示出了本领域已知的用于从安装于载玻片的FFPE组织样本制备DNA文库的方法。
图2示出了从安装于载玻片的FFPE组织样本制备DNA文库的改进方法的实施方案。
图3A是安装于载玻片的FFPE组织样本的黑白图像。
图3B是脱石蜡的安装于载玻片的FFPE组织样本的黑白图像。
图4A示出了移液管将试剂混合物吸入移液管枪头。
图4B示出了移液管将试剂混合物液滴施加到安装于载玻片的FFPE组织样本上。
图5是显微镜载玻片上的试剂混合物液滴的黑白图像。
图6A示出了用于在载玻片上搅拌试剂混合物的液滴同时刮擦安装在载玻片上的FFPE组织样本的移液管枪头。
图6B示出了移液管枪头将包含试剂混合物和FFPE组织样本的部分的反应混合物吸入移液管枪头。
图7是移液管枪头的黑白图像，所述移液管枪头从载玻片吸出反应混合物。
图8A示出了将反应混合物分配到独立反应容器中的移液管枪头。
图8B示出了将反应混合物分配到多孔板的反应孔中的移液管枪头。
图9示出了与传统移液管枪头相比的宽孔移液管枪头的实施方案。
图10是说明由常规FFPE制备方法制备的DNA文库和使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库的序列覆盖谱(sequence coverage profile)的图。
图11是凝胶电泳的带注释的黑白图像，其显示了使用本文公开的方法和组合物从各种FFPE组织样本制备的DNA文库中靶序列的碱基对长度。
图12是说明通过qPCR对使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库进行的定量测定的结果的图。
详细说明
本文公开了用于直接从安装于载玻片的FFPE组织样本有效制备DNA文库的方法和组合物。DNA文库是从生物体的组织样本获得的目标基因组DNA序列的集合。本文公开的方法和组合物被优化用于制备DNA文库以进一步用于下游的下一代测序(NGS)以进行癌症诊断和研究。由本文公开的方法和组合物产生的DNA文库可以与任何数量的NGS平台一起使用，包括需要以下的平台：将DNA片段固定到固体支持物上，使用自动化装置的环状测序反应，以及使用成像或半导体技术检测序列。例如，由本文公开的方法和组合物产生的DNA文库可以与以下一起使用：Illumina，Inc销售的边合成边测序(SBS)NGS平台(例如，Illumina MiniSeq，或系统)，由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的Ion Personal Genome Machine(PGM)系统，由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的NGS系统，或其组合。
图2说明了从安装在固体基板302上的FFPE组织样本300(参见图3A)制备DNA文库的改进方法200的实施方案(参见图3A)。方法200可以包括在步骤202中将试剂混合物402的液滴412(参见图4A，4B和5)施加到安装在固体基板302上的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织样本300(参见图3A)上。在一些实施方案中，固体基板302可以是玻璃载玻片(例如，玻璃显微镜载玻片)，惰性聚合物载玻片，或其组合。
可以使用具有移液管枪头404的移液管400来施加试剂混合物402的液滴412(参见图4A和4B)。在一些实施方案中，用于施加液滴412的移液管枪头404可以是连接到移液管400的宽孔移液管枪头900(参见图9)。在这些和其他实施方案中，宽孔移液管枪头900可具有介于约1.00mm至约1.25mm之间的孔口内径904(见图9)。
当安装于载玻片的FFPE组织样本300从诸如冰箱、冷藏室、冷却器或冷却容器、或其组合的冷藏容器中取出时，可以将试剂混合物402的液滴412施加到安装于载玻片的FFPE组织样本300上。在这些实施方案中，安装于载玻片的FFPE组织样本300可以处于约0℃至大约20℃之间的温度。或者，当FFPE组织样本300处于室温(或约20℃至约25℃)时，可将试剂混合物402的液滴412施加到安装于载玻片的FFPE组织样本300上。将试剂混合物402的液滴412施加到安装于载玻片的FFPE组织样本300上将在以下部分中更详细地讨论。
在一些实施方案中，试剂混合物402可包含试剂溶液406(参见图4A)和引物池溶液408(参见图4A)，其包含用于目标靶序列的多个正向引物和反向引物。试剂溶液406可包含一种或多种缓冲液，辅因子，非离子表面活性剂，甘油溶液，明胶溶液，多种dNTP，和DNA聚合酶。在某些实施方案中，一种或多种缓冲液可包含三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液(例如，Tris-盐酸(HCl)缓冲液)，氯化钾(KCl)缓冲液或其组合。
在一些实施方案中，辅因子或辅因子溶液可以是氯化镁(MgCl2)溶液。非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯溶液(例如聚山梨醇酯20溶液)。更具体的是，非离子表面活性剂可以是由Sigma-Aldrich，Inc.销售的20表面活性剂，由SEPPIC S.A.销售的MontanoxTM 20表面活性剂，或由Oxiteno S.A.销售的20表面活性剂。
在一些实施方案中，DNA聚合酶可以是热稳定DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。更具体的是，Taq DNA聚合酶是配置用于热启动PCR方案的热启动Taq DNA聚合酶。例如，Taq DNA聚合酶可以是由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的TrueStartTM热启动Taq DNA聚合酶或由Sigma-Aldrich，Inc.销售的JumpStartTM热启动Taq DNA聚合酶。
如本公开所构思的并且如本领域普通技术人员将理解的，试剂溶液406可以以不同浓度制备并且提供为1X至5X(例如，1X，2X，3X，4X或5X)主混合物。下表1中显示了试剂溶液406的示例性配方：
表1:2X试剂溶液的示例性组分
申请人做出的一个意外发现是，具有本文公开的组合物的试剂溶液可有效促进由石蜡固定在固体基质上的活检组织样本的释放，而不会过度干扰保存在这种组织样本中的核酸的质量。申请人另一个意外的发现是，具有本文公开的组合物的试剂溶液对于在安装于载玻片的FFPE组织样本上的液滴形式(以及稍后用于搅拌)的应用是理想的，而试剂溶液不会无意地跑出或流出载玻片。
在一些实施方案中，试剂混合物402可由50％(v/v)2X试剂溶液406、20％(v/v)5X引物池溶液408和30％(v/v)去离子水410组成。在这些和其他实施方案中，试剂混合物402的液滴412可具有约20微升(μL)的液滴体积。下表2中显示了应用于FFPE组织样本300的试剂混合物402的20μL液滴412的示例性配方：
表2：示例性液滴组合物
在一些实施方案中，引物池溶液408可包含正向引物和反向引物。例如，引物池溶液408可包含靶向某些目的基因序列的100至200个引物对(正向引物和反向引物)。在其他实施方案中，引物池溶液408可包含200至300个引物对。
方法200可以进一步包括在固体基板302上以圆周运动600搅拌试剂混合物402的液滴412(参见图6A)，同时刮擦安装在固体基板302上的FFPE组织样本300的部分以在步骤204中产生包含试剂混合物402和FFPE组织样本300的部分的反应混合物602。
在一些实施方案中，试剂混合物402的液滴412可以以顺时针圆周运动、逆时针圆周运动或其组合在固体基板302上被搅拌。用于施加液滴412(参见图4B)的相同移液管枪头404可用于搅拌固体基板302上的试剂混合物402的液滴412，同时刮擦安装于载玻片的FFPE组织样本300的部分。在某些实施方案中，用于施加液滴412的相同的宽孔移液管枪头900也可用于在固体基板302上搅拌试剂混合物402的液滴412，同时将安装于载玻片的FFPE组织样本300的部分刮到搅拌的液滴412中。在抽吸反应混合物602之前，可以搅拌液滴412并且可以将FFPE组织样本300刮擦，持续约1分钟至约5分钟。更具体的是，可以搅拌液滴412并可以将FFPE组织样本300刮擦，持续约2分钟至约3分钟。
在一个实施方案中，液滴412可以在固体基板302的实质上圆形的范围或区域中搅拌。在该实施方案中，液滴412可以在大约20.0mm2的实质上圆形区域中被搅拌(即，搅拌限制在载玻片的实质上圆形的区域，其面积约为20.0mm2)。在其他实施方案中，液滴412可以在大约12.5mm2和40.0mm2之间的实质上圆形区域中被搅拌。在一些实施方案中，液滴412还可以以矩形运动、椭圆运动、Z字形运动，螺旋运动、八字形运动或其组合来搅拌。在该搅拌和刮擦步骤之后，反应混合物602可以是浆液的形式，其包含试剂混合物402和FFPE组织样本300的破碎片。
申请人做出的一个意外发现是，试剂混合物402的一个液滴412可以直接施加在安装于载玻片的FFPE组织样本300上，并且保存在这种组织样本中的核酸可以直接从在固体基板302上的FFPE组织样本300、通过本文公开的方法简单地搅拌液滴412来提取。
方法200可以进一步包括，在步骤206中，将反应混合物602从固体基板302(例如玻璃载玻片)直接吸入移液管枪头404并将反应混合物602从移液管枪头404分配到反应容器800中(参见图8A和8B)。在一些实施方案中，反应混合物602可以使用宽孔移液管枪头900(参见图9)直接从固体基板302(例如玻璃载玻片)吸入宽孔移液管枪头900中。然后可以将反应混合物602从宽孔移液管枪头900分配到反应容器800中。
可以通过以下来抽吸反应混合物602：将移液管枪头404在搅拌区域上以实质上圆周的运动来拖拉，同时缓慢释放移液管400的柱塞。在其他实施方案中，反应混合物602也可以通过以下来抽吸：将移液管枪头404在搅拌区域上以实质上矩形的运动、椭圆运动、Z字形运动，螺旋运动、八字形运动或其组合来拖拉，同时缓慢地释放移液管400的柱塞。
在某些实施方案中，反应容器800可以是单个PCR反应管或容器。在其他实施方案中，反应容器800可以是多孔PCR板、例如96孔板或384孔板的一个孔。反应容器800内的反应混合物602可以被认为是PCR混合物或PCR就绪混合物。
方法200可以进一步包括在步骤208中使反应混合物602在反应容器800中经受聚合酶链式反应(PCR)方案。PCR方案可以包括(i)在第一温度下加热反应混合物602以在活化步骤中活化DNA聚合酶。PCR方案还可以包括(ii)在第二温度下加热反应混合物602，以在变性步骤中使反应混合物602内的模板DNA变性。PCR方案可以进一步包括(iii)将温度降低至第三温度以允许引物与模板DNA退火以及通过DNA聚合酶延伸或延长退火的引物。PCR方案还可以包括(iv)重复(ii)变性和(iii)退火和延伸步骤至少24个循环。
在一些实施方案中，(ii)变性和(iii)退火和延伸步骤可重复进行24个循环。在其他实施方案中，(ii)变性和(iii)退火和延伸步骤可以重复25个循环至30个循环。
在一个或多个实施方案中，PCR方案可以是热启动PCR方案，并且在试剂混合物402中使用的DNA聚合酶可以是热启动Taq DNA聚合酶。在该实施方案和其他实施方案中，热启动PCR方案的第一温度可为约95℃(即，活化温度可以是约95℃)，热启动PCR方案的第二温度可以是约99℃(即，变性温度可以是约99℃)，并且热启动PCR方案的第三温度可以是约60℃。
下表3中显示了使用本文所述方法200生成DNA文库的示例性热启动PCR方案：
表3：示例热启动PCR方案
然后，在经历上述PCR方案后从反应容器800获得的扩增序列可用于产生DNA文库以用于进一步的下游NGS反应或方案。例如，在经历上述PCR方案后从反应容器800获得的扩增序列可用于产生DNA文库，其用作以下的一部分(但不限于此)：NGS方案，Ion方案，NGS方案或其组合。
申请人做出的一个意外发现是，本文公开的PCR方案有效扩增从使用本文公开的方法和组合物制备的安装于载玻片的FFPE组织样本获得的靶序列。如将在以下部分中更详细讨论的，从上述PCR方案获得的扩增序列是均一的并且数量高。
图3A是安装或固定在固体基板302上的FFPE组织样本300的实例的黑白图像。固体基板302可以是由惰性材料的部分制成的支撑物或背衬。如前所述，固体基板302可以是载玻片，例如显微镜载玻片。在一些实施方案中，固体基板302可以是玻璃显微镜载玻片，惰性聚合物或塑料显微镜载玻片，或其组合。更具体的是，固体基板302可以是熔融二氧化硅显微镜载玻片，聚苯乙烯显微镜载玻片或丙烯酸显微镜载玻片。
FFPE组织样本300在固体基板302上的位置由虚线圆圈示出。FFPE组织样本300可以表现为覆盖固体基板302的部分的白色或灰色层或膜。下面的组织样本可以被用于将组织样本固定到固体基板302的白色或混浊石蜡遮蔽。从固体基板302的表面测量，FFPE组织样本300可具有约4μm和10μm之间的厚度。
在某些实施方案中，对于为约1,875mm2的总表面积，固体基板302可具有约75.0mm的长度和约25.0mm的宽度。在一些实施方案中，FFPE组织样本300可占据该总表面积的约100mm2至约200mm2。
固体基板302上的FFPE组织样本300可以在用于本文公开的方法之前储存在例如冰箱、冷藏室、冷却器或冷却容器、或其组合的冷藏容器中。或者，固体基板302上的FFPE组织样本300可在使用前储存在室温(或约20℃至约25℃)。
本文公开的方法(例如，方法200)和组合物可以成功地应用于多种FFPE组织样本300。例如，本文公开的方法和组合物可用于从以下制备DNA文库：FFPE膀胱组织样本，FFPE乳腺组织样本，FFPE宫颈组织样本，FFPE结肠直肠组织样本，FFPE食道组织样本，FFPE胃组织样本，FFPE肾组织样本，FFPE肝组织样本，FFPE肺鳞状组织样本，FFPE淋巴样组织样本，FFPE皮肤组织样本(例如，FFPE恶性黑素瘤组织样本)，FFPE鼻咽组织样本，FFPE卵巢组织样本，FFPE前列腺组织样本和FFPE甲状腺组织样本。
图3B是提供用于比较的脱石蜡安装于载玻片的FFPE组织样本的黑白图像。例如，通过将包含FFPE组织样本的整个载玻片浸没在二甲苯中，可以使图3B中所示的安装于载玻片的FFPE组织样本脱石蜡。然后可以用乙醇洗涤包含FFPE组织样本的载玻片。此时，可以用解剖刀或剃刀刀片刮除脱石蜡的组织样本，以便用另外的试剂进一步处理。
图4A示出了移液管400将试剂混合物402吸入到与移液管400连接的移液管枪头404中。在一些实施方案中，移液管400可以是固定容积的微量移液管或可调容积的微量移液管。例如，移液管400可以是由Mettler-Toledo Rainin，LLC销售的Rainin手动单通道移液管。也可以使用其他微量移液管，例如由Thermo Fisher Scientific Inc.和Sigma-Aldrich，Inc.销售的微量移液管。在一些实施方案中，移液管枪头404可以是宽孔移液管枪头900(参见图9)。在以下部分中将更详细地讨论宽孔移液管枪头900。
图4A还示出了试剂混合物402可包括试剂溶液406，引物池溶液408和去离子水410。在一个实施方案中，试剂混合物402可包含50％(v/v)2X试剂溶液406，20％(v/v)5X引物池溶液408和30％去离子水410。例如，可以通过以下来制备20μL体积的试剂混合物402：将10μL的2X试剂溶液406，4μL的5X引物池溶液408和6μL的去离子水410吸入独立的或单一的反应管或试管中。然后可以将试剂混合物402充分混合和/或离心，并且可以将整个20μL体积的试剂混合物402吸入移液管枪头404中以递送到安装于载玻片的FFPE组织样本300上。
图4B示出了移液管400将试剂混合物402的液滴412施加到安装或固定在固体基板302上的FFPE组织样本300上。如前所述，固体基板302可以是玻璃载玻片(例如，玻璃显微镜载玻片)，惰性聚合物载玻片或其组合。
通过将液滴412从移液管枪头404直接分配到FFPE组织样本300的表面上，移液管400可以将试剂混合物402的液滴412施加到FFPE组织样本300上。在一些实施方案中，移液管枪头404可以是宽孔移液管枪头900。
可以将液滴412施加到FFPE组织样本300的中间或中心部分。在某些实施方案中，液滴412可以具有10μL和30μL之间的液滴体积。例如，液滴412可具有约20μL的液滴体积。
在从冷藏容器(例如冰箱、冷藏室，冷却器或冷却容器或其组合)取回FFPE组织样本300之后，可以将试剂混合物402的液滴412施加到安装于载玻片的FFPE组织样本300上。在这些实施方案中，FFPE组织样本300可以处于约0℃至约20℃之间的温度。或者，可以在从冷藏容器取出后使FFPE组织样本300解冻或达到室温。在这种情况下，当FFPE组织样本300处于室温(或约20℃至约25℃)时，可将试剂混合物402的液滴412施加到安装于载玻片的FFPE组织样本300上。
图5是用作固体基板302的玻璃显微镜载玻片上的试剂混合物402的液滴412的黑白图像。如图5中可见，试剂混合物402的液滴412当施加到玻璃显微镜载玻片的表面上时，最初可以形成小球。在一些实施方案中，当首次施加到玻璃显微镜载玻片上时，液滴412最初仅占据玻璃显微镜载玻片表面上约4.0mm2至约5.0mm2的空间。
图6A示出了用于在固体基板302上搅拌试剂混合物402的液滴412同时刮擦安装在固体基板302上的FFPE组织样本300的移液管枪头404。如图6A所示，固体基板302可以是载玻片，例如玻璃显微镜载玻片。在一些实施方案中，移液管枪头404可以是宽孔移液管枪头900。
刮擦安装或固定在固体基板302上的FFPE组织样本300可以在将固体基板302上的试剂混合物402的液滴412搅拌的同时进行。FFPE组织样本300可以用移液管枪头404的远端刮擦或破碎。更具体的是，FFPE组织样本300可以用移液管枪头404的远端的边缘刮擦或破碎。在一些实施方案中，FFPE组织样本300可以用宽孔移液管枪头900的远端刮擦。可以用移液管枪头404的远端的边缘刮擦或破碎FFPE组织样本300，而移液管枪头404的靠近远端的节段用于搅拌液滴412。
用于施加液滴412的相同移液管枪头404(参见图4B)可用于搅拌固体基板302上的液滴412，同时刮擦安装于载玻片的FFPE组织样本300的部分。例如，用于施加液滴412的相同的宽孔移液管枪头900也可用于在固体基板302上搅拌试剂混合物402的液滴412，同时将安装于载玻片的FFPE组织样本300的部分刮到搅拌的液滴412中。
在一些实施方案中，试剂混合物402的液滴412可以在圆形运动600中在固体基板302上被搅拌。更具体的是，试剂混合物402的液滴412可以在固体基板302上以顺时针圆周运动、逆时针圆周运动或其组合被搅拌。
当使用移液管枪头404以实质上圆形运动600搅拌液滴412时，固体基板302上的搅拌范围或搅拌区域可以是实质上圆形的范围或区域。例如，在一个实施方案中，液滴412可以在约12.0mm2至约20.0mm2之间的实质上圆形区域中被搅拌(即，搅拌被限制在固体基板302的实质上圆形的区域，其面积在约12.0mm2至约20.0mm2)。在其他实施方案中，液滴412可以在约20.0mm2和约40.0mm2之间的实质上圆形区域中被搅拌。
在其他实施方案中，液滴412还可以以矩形运动、椭圆运动、Z字形运动，螺旋运动、八字形运动或其组合来搅拌。搅拌和刮擦的目的是产生包含试剂混合物402和FFPE组织样本300的小碎片的反应混合物602。反应混合物602可以是浆液或粘稠溶液的形式。
可以搅拌液滴412并且可以刮擦FFPE组织样本300，持续约1分钟至约5分钟以形成反应混合物602。更具体的是，可以搅拌液滴412和可以将FFPE组织样本300刮擦，持续约2分钟至约3分钟以形成反应混合物602。可以通过以下来形成反应混合物602：将FFPE组织样本300的破碎片段加入试剂混合物402中以形成浆液或粘稠溶液，使得形成包含试剂混合物402和FFPE组织样本300的片段的浆液或粘稠溶液。在将反应混合物602吸入移液管枪头404之前，可以在固体基板302上形成反应混合物602。
申请人做出的另一个意外发现是，可以使用本文公开的方法和组合物从一个安装于载玻片的FFPE组织样本300产生多个DNA文库。由于该方法不需要脱石蜡，多次洗涤步骤，或将样品从载玻片刮到反应管中，临床医生或实验室技术人员可以将试剂混合物402的一个液滴412施加在FFPE组织样本300的一部分上并将搅拌和刮擦定位到FFPE组织样品300的那部分。一旦将反应混合物602吸入移液管枪头404，就可以将试剂混合物402的另一个液滴412施加到FFPE组织样本300的未受干扰的部分上以形成另一个反应混合物602。当活检的FFPE组织样本很少或难以获得时，这是特别有益的。
图6B示出了移液管枪头404将包含试剂混合物402和刮下的FFPE组织样本300的部分的反应混合物602从固体基板302直接吸入移液管枪头404中。如前所述，移液管枪头404可以是宽孔口移液管枪头900。在一些实施方案中，用于抽吸反应混合物602的移液管枪头404可以是用于搅拌液滴412并刮擦安装或固定在固体基板302上的FFPE组织样本300的相同移液管枪头404。
可以通过以下来抽吸反应混合物602：将移液管枪头404在搅拌区域以实质上圆周的运动拖拉，同时缓慢释放移液管400的柱塞。在其他实施方案中，也可以通过以下抽吸反应混合物602：将移液管枪头404在搅拌区域上以实质上矩形的运动、椭圆运动、Z字形运动，螺旋运动、八字形运动或其组合拖拉，同时缓慢地释放移液管400的柱塞。
在一些实施方案中，通过移液管枪头404吸移或抽吸的反应混合物602可为约20μL。在其他实施方案中，通过移液管枪头404吸移或抽吸的反应混合物602可以在约15μL和约25μL之间。抽吸的反应混合物602的体积可取决于最初施加到FFPE组织样本300的试剂混合物402的液滴412的体积。
图7是移液管枪头404的黑白图像，所述移液管枪头已将反应混合物602直接从玻璃显微镜载玻片吸入移液管枪头404。在一些实施方案中，FFPE组织样本300的一些部分可以在从固体基板302抽吸反应混合物602(或其一部分)之后，仍然保留在固体基板302(例如玻璃载玻片)上。
图8A和8B各自示出了将反应混合物602分配到反应容器中的移液管枪头404。反应容器可以指独立反应容器800或多孔板804的反应孔802。例如，如图8A所示，独立反应容器800或可以是单一PCR反应管或容器。而且，如图8B所示，反应孔802可以是多孔PCR板的一个孔。例如，多孔板804可以是96孔板或384孔板。一旦反应混合物602在独立反应容器800或反应孔802内，反应混合物602可以被认为是PCR混合物或PCR就绪混合物。然后可以使反应容器中的反应混合物602经受PCR方案，例如本文所述的热启动PCR方案。
图9示出了与传统移液管枪头902相比的宽孔移液管枪头900的实施例。如前所述，宽孔移液管枪头900可用于将试剂混合物402的液滴412施加到FFPE组织样本300中，搅拌液滴412，刮擦FFPE组织样本300，并将反应混合物602直接从固体基板302吸入宽孔移液管枪头900中。
在一些实施方案中，宽孔移液管枪头900可以是一次性移液管枪头。宽孔移液管枪头900可具有比传统移液管枪头902更宽的孔径。
如图9所示，宽孔移液管枪头900可具有孔内径904。在一些实施方案中，宽孔移液管枪头900可具有介于约1.00mm和1.25mm之间的孔内径904。更具体的是，宽孔移液管枪头900可具有介于1.10mm和1.20mm之间的孔内径904。
申请人做出的一个意外发现是，宽孔口移液管枪头900对于以下是理想的：施加试剂混合物402的液滴412，将液滴412在固体基板302(例如，玻璃显微镜载玻片)上搅拌，和抽吸反应混合物602或由试剂混合物402和FFPE组织样本300碎片形成的浆液返回至宽孔移液管枪头900中。例如，试剂混合物402和反应混合物602都是稍微粘稠的溶液，不易被传统的移液管枪头902抽吸或分配。此外，宽孔移液管枪头900的较大圆周使移液管枪头具有更多边缘表面以刮擦FFPE组织样本300。
图10是说明使用常规FFPE制备试剂盒制备的DNA文库和使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库的序列覆盖谱的图。使用由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的Ion Personal Genome(PGM)系统获得图10中所示的所有测序覆盖数据。
图10中所示的实线表示使用常用的常规FFPE制备试剂盒(例如，IonDirect FFPE DNA Kit)制备的DNA文库的序列覆盖谱，而其余三条虚线表示使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库的序列覆盖谱。使用从相同来源组织获得的安装于载玻片的FFPE组织样本制备所有这些DNA文库。如图10所示，使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库的序列覆盖谱与使用常用的常规FFPE制备试剂盒制备的DNA文库的序列覆盖谱是大体上相匹配的。另外，使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库的序列覆盖谱也彼此保持高水平的精确度。
此处还需要注意的是，使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库各自在较短的时间内制备，并且没有繁琐的多步DNA提取或纯化步骤。另外，使用本文公开的方法和组合物制备的DNA文库也需要更少的FFPE组织起始材料。
图11是凝胶电泳的带注释的黑白图像，其显示了使用本文公开的方法和组合物从各种FFPE组织样本制备的DNA文库中的扩增子的碱基对长度。如图11所示，DNA文库由各种类型的组织样本制备，所述组织样本显示出癌性生长的迹象。例如，如图11所示，从以下制备DNA文库：FFPE宫颈组织，膀胱组织，甲状腺组织，乳腺组织，卵巢组织，胃组织，结肠直肠组织，肾组织，食道组织，鼻咽组织，肺组织，直肠组织，肝组织和皮肤组织。
使用包含约200对正向和反向引物的相同引物池制备所有此类DNA文库。设计所有这些引物以产生约100至200个碱基对(bp)的扩增子。凝胶电泳显示由14个组织样本制备的DNA文库显示主要含有约100至200bp的扩增子。图11提供了进一步的证据，即本文公开的文库制备方法和组合物对不同类型的FFPE组织样本同样有效。
图12是说明定量测定的结果的图，所述定量测定通过从多种FFPE组织样本制备的多个DNA文库的定量实时PCR(qPCR)进行。使用本文公开的方法和组合物制备所有这些DNA文库(除系统对照外)。使用由Thermo Fisher Scientific Inc.销售的Ion Library定量试剂盒进行这种定量测定。如图12所示，定量DNA文库并与定量试剂盒提供的系统对照(例如，大肠杆菌DH10B对照文库)进行比较。所有DNA文库(包括系统对照)用1:20、1:2000和1:20000的稀释量稀释，并使用相同的引物池制备这些文库。此外，由于循环阈值(或Ct)值与样品中的靶序列的量相反，稀释量越大，这种样品的Ct值应该越高。
这种定量测定的结果显示，靶序列量在所有文库中是一致的。而且，如图12所示，这些文库的所有Ct值与系统对照密切对齐，并且任何差异都在预期的误差范围内。
本文描述和示出的各个变体或实施方案中的每一个具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其他变型或实施方案的特征分离或组合。可以进行修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、过程动作或步骤适应本发明的目的、精神或范围。
本文所述的方法可以以逻辑上可能的所述事件的任何顺序以及所列举的事件顺序来执行。此外，可以提供额外的步骤或操作，或者可以消除步骤或操作以实现期望的结果。
此外，在提供一系列值的情况下，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该所述范围内的任何其他所述或中间值都包含在本发明内。而且，所描述的本发明变型的任何可选特征可以独立地被阐述和要求保护，或者与本文描述的任何一个或多个特征组合。
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