基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序试剂盒。
背景技术
癌症是全球发病和死亡的主要原因，2012年全球约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死亡病例。2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球癌症发病人数的20％，居世界首位；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的1/4。在未来20年中，估计全球每年癌症病例将由2012年的1400万上升到2200万。恶性肿瘤治疗困难，医疗费用高。很多患者在发现癌症之时已经到了晚期，失去了治疗的最佳时机。因此，肿瘤早期诊断对于癌症预防及治疗具有极其重要的作用。
目前，传统的肿瘤诊断方法主要包括有影像学、内窥镜技术及组织病理学，并且一直构成了国际癌症诊断领域的主要部分，也是肿瘤确诊的主要诊断方法。但是这些诊断方法具有早期肿瘤检测灵敏度低、耗时长及对病人损害较大，从而使许多病人错过了癌症的最佳治疗时机。发展低成本、易操作、便携式、低损伤、高准确性和快速的肿瘤早期检测方法是当前所急需。
“液体活检”具有其他筛查方法不具有的低侵入性、覆盖所有肿瘤类型、能够随时检测肿瘤变化，在肿瘤的早期筛查、动态检测及治疗中被寄予厚望。“液体活检”在肿瘤的早期检测、动态监测及治疗中应用解决了部分肿瘤筛查的问题。目前有多种非侵入性血液标记应用于肿瘤的检测，例如血浆游离循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞，外泌体和循环蛋白质。在肿瘤中血浆游离DNA突变的检测一直都是研究的重点，主要利用高通量测序技术，对于血浆游离DNA进行测序，通过游离DNA中肿瘤DNA的突变信息进行极其高的测序深度才能完成检测，同时要求样本量较高，目前无法应用于普通人群筛查。
血小板是血液中含量第二的细胞，是由骨髓中成熟的巨噬细胞的细胞质脱落而成的。血小板不仅在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中发挥着重要作用，而且对癌症的发展及转移也起着重要作用。近年来的研究显示，肿瘤血小板检测可能会使基于肿瘤血液的癌症诊断变得更有效。但现有技术中，还没有对应成熟的技术利用肿瘤血小板对肿瘤进行较为准确的诊断。
目前血小板应用于癌症诊断的技术有多种，包括血小板蛋白检测，血小板RNA定量PCR检测。血小板蛋白检测的不足点为：取样量多，检测准确性低；血小板RNA定量PCR检测的不足点为：检测基因数有限、检测准确性低。
发明内容
本发明一个目的是提供一种基于BGISEQ-500的血小板RNA测序文库构建方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)提取待测样本的血小板RNA，反转录得到dscDNA；
2)用包埋接头的Tn5转座酶片段化所述dscDNA，得到片段化产物；
所述包埋接头的Tn5转座酶中的接头为接头1和接头2；
所述接头1由引物A和引物B退火得到；
所述接头2由引物A和引物C退火得到；
所述引物A的核苷酸序列为序列1；
所述引物B的核苷酸序列为序列2；
所述引物C的核苷酸序列为序列3；
3)对所述片段化产物进行PCR扩增，得到扩增产物；
所述PCR扩增的引物为引物F、引物R、Tn5-zebra F和Tn5-zebra R；
所述引物F的核苷酸序列为序列4；
所述引物R的核苷酸序列为序列5；
所述Tn5-zebra F的核苷酸序列为序列6；
所述Tn5-zebra R由序列甲、barcode序列和序列乙组成；所述序列甲的核苷酸序列为序列7，所述序列乙的核苷酸序列为序列8；
4)环化所述扩增产物，得到血小板RNA测序文库。
上述方法中，
所述引物A的5'末端磷酸化修饰；
或，在步骤1)前，还包括去除血小板RNA中的用于保存的RNAlater的步骤；
或，在步骤3)和4)之间，还包括从所述扩增产物中选取大小为150-500bp片段的步骤；
或所述选取方法具体采用磁珠纯化。
上述方法中，
所述环化采用的寡核苷酸的核苷酸序列为序列9。
本发明另一个目的是提供一种基于BGISEQ-500的血小板RNA测序方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)按照上述方法构建基于BGISEQ-500的血小板RNA测序文库；
2)BGISEQ-500测序仪对所述文库进行测序。
本发明第3个目的是提供一种试剂盒。
本发明提供的试剂盒，其包括上述方法中的所述引物A、所述引物B、所述引物C、所述引物F、所述引物R、所述Tn5-zebra F和所述Tn5-zebra R。
上述试剂盒还包括Tn5转座酶。
上述试剂盒具有如下1)-6)中至少一种功能：
1)筛选或辅助筛选正常样本和癌症样本差异基因；
2)制备筛选或辅助筛选正常样本和癌症样本差异基因产品；
3)检测或辅助检测正常样本和癌症样本差异基因；
4)制备检测或辅助检测正常样本和癌症样本差异基因产品；
5)评估或辅助评估待测样本癌症风险；
6)制备评估或辅助评估待测样本癌症风险产品。
上述方法或上述的试剂盒在如下1)-6)中至少一种应用也是本发明保护的范围：
1)筛选或辅助筛选正常样本和癌症样本差异基因；
2)制备筛选或辅助筛选正常样本和癌症样本差异基因产品；
3)检测或辅助检测正常样本和癌症样本差异基因；
4)制备检测或辅助检测正常样本和癌症样本差异基因产品；
5)评估或辅助评估待测样本癌症风险；
6)制备评估或辅助评估待测样本癌症风险产品。
上述中，所述待测样本为离体外周血。
上述中，所述待测样本为离体外周血，所述离体外周血的体积小于等于1ml。
本发明通过摸索血小板RNA提取方法、基于BGISEQ-500的血小板RNA建库，建立一套适用于肿瘤早期检测的血小板RNA高通量测序的完整体系；初步采集癌症和正常样本评估血小板RNA测序用于肿瘤早期检测的准确性、灵敏性和特异性；实验证明，本发明采用低于1ml的全血，进行微量血小板mRNA文库构建,通过自主搭建的血小板分析流程，进行高灵敏性和高特异性的肿瘤早期筛查。
附图说明
图1为本发明的技术路线。
图2为差异基因聚类分析热图。
图3为SVM-LOOCV评估癌症风险。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为本发明的技术路线。
实施例1、基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序方法及应用
本发明主要基于BGISEQ-500测序仪对8例正常样本和15例癌症样本的血小板RNA进行测序分析，具体步骤如下：
(一)微量血小板RNA文库构建
1、血小板分离
采集2ml待测样本外周血于EDTA抗凝管中，充分混匀进行以下操作，所有离心过程都在4℃进行：
(1)将采血管置于离心机中120g离心20min，离心后立即将上清(含血小板)分装到多个1.5ml的离心管中；
(2)将(1)得到的装有上清的离心管置于离心机中360g离心20min，离心后，管中沉淀即为血小板，向沉淀中加入30ul RNAlater(Sigma)，然后于4℃过夜放置，然后转至-80℃保存；
2、血小板RNA提取(前处理为创新步骤，样本冻存后进行RNAlater离心去除，既可以不影响RNA提取还可以去除血浆中的干扰物质)
1)、前处理
将1得到的装有RNAlater的血小板样本管取出，4℃解冻后，放于冰盒内；向装有RNAlater的血小板中加入含0.8％EDTA的PBS，用移液枪缓慢混匀，4℃，3000g离心10min，去除上清液(去除RNAlater)，获得的血小板沉淀可直接用于RNA提取。
2)、RNA提取
采用NucleoSpin RNA Set for NucleoZOL(Macherey-Nagel)试剂盒提取，具体如下：
(1)向上述1中装有血小板的离心管(不含RNAlater)中加入500ul NucloZOL，漩涡混匀1min，短暂离心，得到裂解液。
(2)向(1)得到的裂解液中加入200ul RNase-free water，漩涡混匀30s，室温静置5-15min。
(3)将(2)处理后的离心管放于离心机中，4℃，12000g离心15min(离心后，将离心机温度调回室温)。
(4)离心后，将500ul上清液转移至新的1.5ml离心管(需自己准备)中。
(5)向上清液中加入500ul Buffer MX，漩涡混匀，短暂离心。
(6)取出
(7)弃除收集管中液体，再将离心管剩余液体全部转移至收集柱，8000g离心30s。
(8)将含有废液的收集管丢弃，将收集柱放在一个新的收集管上。
(9)加入700ul Buffer RA3至收集柱中，8000g离心30s，弃除废液。
(10)加入350ul Buffer RA3至收集柱中，8000g离心30s，弃除废液；将收集柱重新放回收集管上，12000g离心2min。
(11)将收集柱放于一个干净的1.5ml离心管(试剂盒已提供)上，打开收集柱盖子，室温放置3min。
(12)将60ul RNase-free water加到收集柱的膜上方，盖上管盖，室温孵育3min。
(13)12000g离心2min，丢弃收集柱，在离心管盖上标记样本编号，并立即将样本放于-80℃保存。
(14)用Agilent RNA 6000Pico kit对RNA的提取质量进行评估，所有样本的完整性均满足要求(RIN>8)，得到血小板总RNA。
3、微量血小板RNA文库构建
1)反转录得到dscDNA
a、cDNA第一链合成
取500pg-1ng上述2获得的血小板总RNA进行cDNA第一链合成，分为两步：首先进行RNA变性，各成分为2.5uM Oligo-dT primer、2.5mM dNTP Mix、4U RNase Inhibitor(NEB，cat.no.M0314L)总体积4ul，漩涡混匀，PCR仪72℃孵育3min，反应结束后置于冰上冷却2min；然后向以上反应体系中加入100U SuperScript II reverse transcriptase(INVITROGEN,cat.no.18064-014)、10U RNase Inhibitor(NEB，cat.no.M0314L)、5×Superscript II first-strand buffer(INVITROGEN,cat.no.18064-014)、2.5mM DTT、1MBetaine(SIGMA,cat.no.B0300-1VL)、9mM MgCl2、1uM TSO、补充Nuclease-free water至总体积为10ul。涡旋混匀后，按如下反应条件进行逆转录反应(75℃热盖)：42℃ 90min；50℃2min,42℃ 2min(10cycles)；70℃ 15min；4℃ hold，得到cDNA第一链。
Oligo-dT primer序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)-3’；
TSO序列为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-3’。
b、cDNA第二链合成
向上述a得到的cDNA第一链反应产物中继续加入2×KAPA HiFiHotStart ReadMix(KAPA BIOSYSTEMS,cat.no.KK2601)、0.1mM IS PCR primers(生工生物工程)，补充Nuclease-free water至总反应体积为25ul。反应程序为：98℃ 3min；98℃ 15s,67℃ 20s,72℃ 6min(15cycle)；72℃ 5min；4℃ hold，得到cDNA第二链。
c、磁珠纯化
使用1×AmPure XP Beads对上述(2)得到的cDNA第二链进行纯化，得到纯化后dscDNA。
纯化后dscDNA用Agilent DNA 2100High Sensitivity DNA kit检测片段大小分布。结果显示所有样本的产物条带范围均在300～2.2kb，且主要集中在1500-2000bp附近。
2)包埋2个接头的Tn5转座酶的构建
本流程采用基于BGISEQ-500平台自主研发设计的接头和引物序列，并且采用华大自主生产的Tn5转座酶和buffer(50mM TAPS-NaOH，pH8.5,25mM MgCl2，50％DMF)对cDNA样品进行文库制备，具体如下：
(1)包埋2个接头的Tn5转座酶
A、接头(Adapter Mix)制备
a.引物名称及序列：
PrimerA:5’-[磷酸化]CTGTCTCTTATACACATCT-3’(序列1)
PrimerB:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(序列2)
PrimerC:5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(序列3)
b.使用Annealing Buffer(10mM Tris-HCl PH7.8,1mM EDTA PH8.0,50mM NaCl)溶解PrimerA、PrimerB、PrimerC至100μM。
c.分别配制如下表1所示的反应体系：
表1为反应体系
d.分别将反应1和反应2涡旋震荡充分混匀，并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内，进行如下反应程序(热盖温度105℃):
75℃,15min；60℃,10min；50℃,10min；40℃,10min；25℃,30min
实现将PrimerA和PrimerB退火得到接头1，PrimerA和PrimerC退火得到接头2。
e.反应结束后，将反应1(含有接头1)和反应2(含有接头2)等体积混合，命名为Adapter Mix，-20℃保存。
B、接头(Adapter Mix)包埋：
a.在灭菌PCR管中依次添加表2所示的各反应组分：
表2为接头(Adapter Mix)包埋组分
b.使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。(重要！一定要轻轻吹打混匀，不宜震荡混匀)
c.将反应置于25℃反应1h。反应产物命名为Tagment Enzyme Advanced Mix V5S，置于-20℃储存，即为包埋2个接头的Tn5转座酶。
3)利用包埋2个接头的Tn5转座酶片段化cDNA
a.于室温解冻5×TAG Buffer(BGI,BGE005BO1)，上下颠倒混匀后备用；确认0.1％SDS处于室温，并轻弹管壁确认有无沉淀。如有沉淀，可于37℃加热并剧烈震荡充分混匀沉淀即会溶解；
b.在灭菌PCR管中依次添加5ng 1)得到的dscDNA产物、0.6ul 2)得到的TagmentEnzyme Advanced Mix V5S、5×TAG Buffer，补充水至20ul。将反应体系置于55℃温浴7min后，添加5μL 0.1％SDS室温5min终止反应，得到Tn5转座酶片段化产物。
4)片段化产物的PCR扩增
a.取5ul 3)得到的Tn5转座酶片段化产物，并向其中加入5×KAPA FidelityBuffer(KAPA BIOSYSTEMS，cat.no.KK2101)、3mM each dNTP、0.02U KAPA HiFi DNApolymerase(KAPA BIOSYSTEMS，cat.no.KK2101)、0.2μM Primer F、0.2μM Primer R、0.01μM Tn5-zebra F、0.01uM Tn5-zebra barcode R，其余用Nuclease-free water补齐，得到总体积为50ul的PCR扩增体系；
Primer F(该引物序列是Tn5-zebra F的一部分)序列为：
5’-[Phos]GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’(序列4)；
Primer R(该引物序列是Tn5-zebra barcode R的一部分)序列为：
5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTC-3’(序列5)；
Tn5-zebra F(该引物序列一部分包含PrimerB序列)序列为：
Tn5-zebra barcode R(该引物序列一部分包含PrimerC序列)序列为：
b.使用移液器轻轻吹打上述a得到的PCR扩增体系10次充分混匀后，置于PCR仪中，设置如下反应程序：72℃,5min；95℃,3min；98℃20s,60℃15s,72℃25s(15Cycles)；72℃5min；4℃,forever；进行PCR扩增，得到Tn5转座酶片段化产物的扩增产物。
5)文库片段选择及纯化
采用0.8×AMPure XP beads+0.2×AMPure XP beads(Backman
coulter,cat.no.A63881)进行选择性纯化。
(a)向50ul片段化扩增产物中加入40ul XP beads,移液器吹打混匀，室温孵育10min后，置于磁力架上静置5min.
(b)吸取上清至一新的1.5mlEP管,丢弃磁珠。向上清液中加入10ul XP beads，用移液器吹混匀，室温孵育5分钟后，置于磁力架上静置5min。
(c)去除上清，加入200ul新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清。重复该步骤一次，总计漂洗两次。
(d)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟。
(e)将EP管从磁力架中取出，加入25ul灭菌超纯水洗脱。
纯化的文库片段用Agilent 2100DNA 1000Reagent检测产物片段大小。结果表明，所有纯化的文库片段的条带范围均在150-500bp，且在300bp附近有一个主峰。
6)文库热变性及环化
每8个样品进行pooling，每个样品取20ng至一200ul EP管，并补充水至总体积为40ul。将Pooling文库放置于PCR仪上进行变性，反应条件94℃3min；反应结束后，迅速将样品转移至冰上冷却2min。
继续向变性后的pooling文库中加入10×TA buffer(Epicentre,Cat.No.TA6115)、1mM ATP、2U T4DNA ligase(ENZYMATICS,cat.no.L6030)、16.7uM SplintOligo进行环化，总体系60ul。将反应体系置于PCR仪上37℃孵育30min，得到环化后文库，即为微量血小板RNA文库。
上述Splint Oligo序列为5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’(序列9)。
(二)微量血小板RNA文库测序
上述(一)得到的环化后文库(微量血小板RNA文库)用BGISEQ-500测序仪,SE100测序策略进行测序。
环化文库通过测序方法得到fastq文件，再将fastq文件用soap过滤质量值<10的碱基占50％以上的reads，过滤N的比例大于10％的reads，得到去除低质量的初过滤reads；再将初过滤reads进行rRNA序列的过滤，得到过滤后的reads；再将过滤后的reads采用STAR进行全基因组比对(参考基因组为hg19)得到唯一比对的reads；再将唯一比对的reads通过bam的CIGAR字串特征筛选跨越内含子的剪接reads(IS reads)，并用htseq对原始bam和ISbam进行reads计数，得到IS reads数。以每Mb数据量的reads数(CPM)的log2对数值(logCPM)作为基因表达量定量值。
对下机后的测序数据进行分析，平均每个样本获得大约78M的raw reads，平均每个样本的唯一比对率为73.35％。采用soap对原始reads进行过滤，并用STAR将过滤后reads比对到hg19参考基因组，得到8例正常样本的血小板RNA测序结果和15例癌症样本的血小板RNA测序结果。
平均每个样本得到8M的IS reads用于后续的分析。
(三)、基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序的应用
一、差异基因筛选
将(二)获得的8例正常样本的血小板RNA测序结果和15例癌症样本的血小板RNA测序结果，采用trimmed mean of M-values(TMM)方法进行标准化系数的计算，为了排除不同基因之间长度差异带来的影响。得到8例正常样本的血小板RNA的标准化后基因和15例正常样本的血小板RNA的标准化后基因。
分别从8例正常样本的血小板RNA的标准化后基因和15例正常样本的血小板RNA的标准化后基因中筛选logCPM>3且覆盖25％以上样本的基因，按照训练集样本的分组情况，进行方差分析(ANOVA)，以FDR<0.001为筛选限，共筛选出1063个差异基因。
癌症样本与正常样本相比，523个为上调基因，540个为下调基因。依据1063个差异基因对各样本进行无监管分层集群(Unsupervised hierarchical clustering)分析，结果显示癌症样本和正常样本明显分为两支(如图2)。
经过分析1063个差异基因得确为现有技术公知的癌症和正常样本的差异基因。证明，本发明的方法正确，能够对癌症样本和正常样本的血小板RNA准确测序。
二、预测模型构建与留一验证
以上述数据作为训练集，在筛选的差异基因范围内构建SVM预测模型，分类方法为“C-classification”。对该预测模型进行留一交叉验证(LOOCV)，即对训练集中每一例样本，以剩余样本做训练集构建SVM预测模型来对其进行类型预测，从而评估该预测模型的准确性。确定好稳定可靠的训练集后，即可用该预测模型对待测样本进行SVM分类，从而判断癌症风险。
依据一得到的1063个差异表达基因，采用SVM-LOOCV方法(即对训练集中每一例样本，以剩余样本做训练集构建SVM预测模型)对23例样本根据其类型相似度定义癌症风险评估值，结果如图3所示。由图可知，肿瘤样本的癌症风险评估值均在80％以上，正常样本的癌症风险评估值均在20％以下；23例所有正常样本均被预测为正常，所有癌症样本均被预测为癌症，即灵敏性、特异性和准确性均为100％。
从以上结果表明，本专利发明的基于BGISEQ-500的微量血小板RNA肿瘤早期检测试剂盒，在用于肿瘤筛查上具有较高的准确性和可行性。后期需要采用大量的癌症样本和正常样本进行验证。
序列表
<110>深圳华大生命科学研究院
<120>基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序检测试剂盒
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ctgtctctta tacacatct 19
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gaacgacatg gctacgatcc gactt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
tgtgagccaa ggagttgttg tcttc 25
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
gaacgacatg gctacgatcc gactttcgtc ggcagcgtc 39
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
tgtgagccaa ggagttgttg tcttc 25
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
gtctcgtggg ctcg 14
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
gccatgtcgt tctgtgagcc aagg 24
