一种适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,更具体地,涉及一种适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法。
背景技术
高通量测序技术又称为下一代测序技术、以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和读长较短等为标志。第二代高通量illumina测序平台具有测序通量高、准确度高和成本低等优点,并广泛应用于多个领域。
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture,3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术,可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息,此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获,并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来,在第二代测序技术的迅速发展下,由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象,研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中,以整个细胞系为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息。将通过第二代测序得到的DNA序列对映射到参考基因组后,如果一对序列对应于不同的n段酶切片段,那么就认为这两个片段之间有n次相互作用,从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间接合频率的矩阵。利用这个频率矩阵,将基因组组装过程中形成的contig、scaffold进行染色体定位、方向没定位,延长拼接结果,辅助基因组组装,尤其对于获得群体困难无法构建遗传图谱的物种意义重大。
基于高通量进行染色体构象捕获的Hi-C技术,是染色体相互作用研究领域的一个巨大的飞跃。但是常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象,其染色质比较单一,虽然能获得比较好的结果,但是限制了其使用范围,如狐尾藻不同于细胞系,其细胞壁富含疏松的液泡组织,不能用单纯植物裂解细胞的方式释放细胞核;同时,实验发现,内源酶灭活效果不好也影响后续酶切反应效果,从而影响文库数据的有效性。因此有必要开发一种适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题,本发明提出了一种适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法,结合动物和植物的实验方法,针对狐尾藻细胞优化了实验条件,实现了狐尾藻的Hi-C高通量测序建库,扩大了Hi-C技术的使用范围,为植物Hi-C方法建库效果不佳的类似物种提供新的研究思路;该方法缩减实验流程,缩小实验体系,节约成本,提高实验质量。
为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法,包括如下步骤:
1)对狐尾藻样品进行甲醛交联获得交联后的物料并终止交联;
2)液氮研磨破碎细胞,释放细胞染色质;
3)收集细胞染色质并依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料;
4)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端补平,获得末端补平后DNA,并对末端补平后DNA进行分子内连接;
5)解交联分子内连接物料并去除未连接的末端生物素,获得纯化的DNA,超声波随机打断DNA形成利于测序的片段;
7)构建用于高通量测序的Hi-C文库;
8)特异性捕获标记了生物素的DNA片段并对捕获片段进行PCR扩增以达到高通量测序所需文库量;
9)文库质检。
进一步地,所述甲醛交联步骤包括:将幼嫩狐尾藻组织与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-50min进行甲醛交联,孵育结束后加入甘氨酸终止交联。
进一步地,所述灭活内源酶的步骤包括:
(1)取液氮研磨样品加入预冷的离心管,重悬沉淀于2mL的1.2×NEBuffer2.1;
(2)4℃1800g离心5min,弃上清;
(3)重悬沉淀于2mL的1.2×NEBuffer 2.1,4℃1800g离心5min收集裂解物;
(4)弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer 2.1,每管溶解染色质添加7.5μL20%的SDS,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫;
(5)依次65℃900rpm孵育40min、37℃900rpm孵育20min,并立即放置冰上,瞬时离心以移除管盖液体。
更进一步地,所述灭活内源酶还包括采用Triton X-100中和SDS,所述Triton X-100的质量浓度为20%,中和后Triton X-100的终浓度为3%。
进一步地,所述步骤(3)中酶切反应具体操作为:向每管内源酶灭活物料中加5000units/mL的MboI核酸内切酶150U,900rpm 37℃反应4h。
进一步地,所述步骤(5)中去除未连接的末端生物素的反应体系包括以下用量的各组分:解交联分子内连接后物料1μg、10x NEBuffer2.1 10μL、10mM dATP 1μL、3U/μLT4DNA Polymerase 1.67μL、水86.33μL;所述去除未连接的末端生物素的反应条件为:12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明提出的适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法,针对狐尾藻细胞的特殊结构,设计合适的细胞破碎方法、甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,减少了分析阶段背景噪音的干扰,解决了狐尾藻细胞壁结构对Hi-C实验的影响,同时本实验最终使用异于常规植物稀释Hi-C的In sit u Hi-C方法进行后续实验,简化了实验流程,减少了细胞核的损失,扩大了Hi-C技术的适用范围。
(2)在工具酶的选择上,选用适用性较广的MboI,使整个反应体系全部可以使用NEB Buffer 2.1,省去了频繁更换缓冲液体系的步骤,大大简化了操作步骤。
(3)本发明的方法采用In situ Hi-C方法操作流程简便,可以复制到其他具备分子生物学基础的其他实验室。
(4)本发明构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。
附图说明
图1为本发明的适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法流程图。
图2为鉴定基因组完整性、酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图3为本发明的方法构建的文库大小分布结果示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例,且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进,所有这些改进,均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:
本实施例以狐尾藻为研究对象,对幼嫩狐尾藻组织进行甲醛交联、裂解细胞释放染色质,再经消化染色质、生物素标记、分子内连接、超声打断,最后进行文库构建(如图1所示),具体实验过程如下:
1.甲醛交联细胞
(1)取2g幼嫩狐尾藻组织,剪成约0.5cm大小的碎片装入50mL离心管,并于离心管中加入预冷的35mL NIB裂解液(反应前加入35μL巯基乙醇和35μL 100mM PMSF)和2mL约37%的甲醛溶液(终浓度2%),抽真空40min,建议冰上操作。
(2)加入5mL 2.0M甘氨酸并在真空下处理5min终止交联。
2.细胞裂解
(1)去除溶液并用灭菌超纯水清洗2-3次;灭菌滤纸完全擦干叶片上的水,液氮磨碎样本。
(2)液氮研磨的样本装入-80℃预冷的空50mL离心管中,留存于-80℃冰箱或置于干冰中运输。
(3)把磨碎的狐尾藻样本加入50mL预冷的离心管中,重悬沉淀于2mL的1.2×NEBuffer 2.1;4℃1800g离心5min,弃上清。
(4)重悬沉淀于2mL的1.2×NEBuffer 2.1,4℃1800g离心5min收集裂解物。
(5)弃上清,重悬沉淀于500μL的1.2×NEBuffer 2.1。
(6)通过添加7.5μL 20%SDS(终浓度0.3%SDS)每管溶解染色质,吹打混匀,重悬所有细胞碎片并避免形成泡沫。
(7)65℃900rpm孵育40min,37℃900rpm孵育20min,并立即放置冰上(长时间高温会解交联),瞬时离心以移除管盖液体。
3.酶切消化
(1)中和SDS:添加50μL的20%Triton X-100每管至终浓度2%,重悬细胞碎片并避免形成气泡,37℃950rpm震荡1h。
(2)每管加入150U限制性内切酶(MboI,5000units/mL),900rpm 37℃4h(终体积610μL)。
质控:①取20μL酶切前体系加入750μL CTAB与5μL蛋白酶K解交联;②取20μL酶切前体系加入750μL CTAB作为交联阴性对照;③取20μL酶切后体系加入750μL CTAB与5μL蛋白酶K解交联;④取200ng gDNA进行酶切作为酶切阳性对照,验证交联效果与酶切效果。
4.生物素标记与补平末端
(1)瞬时离心去除管盖液体;
(2)每管加入表1所示试剂(终体系600μL)
表1
(3)加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积600μL),混匀后,37℃孵育2h;
(4)变性内切酶:65℃孵育20min灭活MboI,反应结束立即放冰上。
5.分子内连接
(1)配制连接体系如表2所示:
表2
(2)管加入1mL以上混合液于冰上放置的1.5mL离心管;
(3)转移每个Hi-C反应体系至上述1.5mL离心管,轻柔颠倒混匀;
(4)16℃孵育连接反应4-8h,每小时颠倒混匀。
6.解交联
(1)每管加入6μL 20mg/mL蛋白酶K 65℃3h;
(2)将反应混合液冷却到室温,转移每个反应至一个2mL离心管,一倍氯仿分离回收上清,加入3/4体积异丙醇室温沉淀10min,两次75%乙醇清洗(弹起沉淀),吹干,回收产物溶解在50μL EB,通过添加2μL 1mg/mL RNAse在37℃温育30min以降解所有的RNA。Qubit测定浓度,浓度为29ng/μL(store at-20℃)。
(3)通过琼脂糖凝胶电泳图谱鉴定基因组完整性、酶切效果、连接效果。脂糖凝胶电泳图谱如图2所示,图为正常的完整基因组DNA条带明显无拖尾;酶切效果明显,DNA片段整个下移;连接效果明显,DNA条带上移;说明酶切连接均达到预期效果,可以进行下步实验。
7.末端去生物素
(1)取3μg样品1×Ampure XP beads纯化后Qubit测定浓度;
(2)取1μg样品用于末端去生物素,反应体系如表3所示:
表3
(3)12℃反应4h,2μL 0.5M EDTA终止反应。
8.DNA打断
(1)使用130μL超声体系在Covaris上超声片段至400bp左右,超声选择400bp程序90s进行1次;
(2)1×Ampure XP beads回收DNA,溶解于52μL EB,Qubit测定浓度,浓度为15ng/μL。
(3)Illumina试剂盒建库试剂盒(NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit forIllumina)补平末端并+A及+Adaptor;
(4)Illumina试剂盒建库试剂盒的Ampure Beads纯化回收步骤,回收+Adaptor后的DNA。
9.生物素捕获
生物素捕获使用试剂盒(
10.Illumina试剂盒扩增嵌合片段
(1)Illumina试剂盒建库(100μL,PCR至6cycles,分别取3微升摸索循环数6,8,10,12cycles),选取能扩增出足量产物的最低循环数;
(2)1.5%agarose凝胶回收400-600bp条带;
(3)回收产物对文库大小分布进行检测,文库大小合适分布均匀,可以进行高通量测序。从图3中可以看出,文库大小集中在400-600bp之间,与凝胶回收预期范围一致。
11.对质控得到的clean data,使用ICE3软件对数据进行迭代比对,并进行噪音reads过滤。
表4狐尾藻数据分析结果说明
注:为SE(Single End)数据,其它均为PE(Paired End)数据。Hi-C测序数据中主要reads类型包括,valid pair,single side,self circles,dangling e nds及unmapped等类型。其中:valid pair是指符合Hi-C实验预期,由补平并携带生物素标记的酶切位点将基因组上不同位点DNA连接在一起形成的嵌合体DNA片段;single side是指,仅有一端序列可以唯一匹配到基因组上的DNA片段;self circles是指同一位点DNA环化连接形成的DNA,它主要由单一酶切片段两端相连接,经超声波打断,捕获并测序产生;dangling ends是指双端均在同一位点的DNA片段,它源自未经过连接反应,最终却被捕获测序产生的数据;unmapped是指双端均无法唯一匹配到基因组上的DNA片段。在Hi-C分析中,仅valid pair可以反映基因组上位点与位点间的互作信息。因此,非重复的valid pair所占的比例是评估Hi-C文库质量的重要指标。
因此,本发明提出的适用于狐尾藻的Hi-C高通量测序建库方法,针对狐尾藻细胞的特殊结构,设计合适的细胞破碎方法、甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶,减少了分析阶段背景噪音的干扰,解决了狐尾藻细胞壁结构对Hi-C实验的影响,同时本实验最终使用异于常规植物稀释Hi-C的In sit u Hi-C方法进行后续实验,简化了实验流程,减少了细胞核的损失,扩大了Hi-C技术的适用范围。本发明的方法构建的Hi-C文库测序数据不仅仅可以用于基因表达调控的研究,还可以用于辅助基因组组装。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。