一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地指依次在DNA末端高效地连接测序接头来实现对各种复杂样本及痕量DNA进行文库构建的技术。
背景技术
目前常规的建库策略是先对片段化的DNA进行末端修复，然后通过AT进行测序接头的连接，利用PCR实现对文库的扩增。但是这种常规的建库要求样本DNA质量较高，投入量较大，无法实现对破坏严重，尤其是主要以单链DNA存在的样本的正常建库。当投入量过低时常规建库也无法完成。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法和试剂盒，实现对各种痕量DNA样本的成功建库，打破了常规的建库手段，规避了末端修复造成的DNA的损失，尽可能的反应样本的真实信息。
本发明，一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、DNA 3'接头连接：先利用末端转移酶对待测DNA进行3'末端添加一段多聚寡核苷酸PolyA或者PolyC或者PolyG或者PolyT，得到DNA-多聚寡核苷酸结构，利用DNA修复酶、DNA聚合酶及DNA连接酶完成所述DNA-多聚寡核苷酸的3'末端和T7 Truncated Adapter接头的连接，合成DNA-多聚寡核苷酸-T7 Truncated Adapter；
步骤S1中所述待测DNA为单链DNA片段或者双链DNA片段，或者同时包括单链DNA片段和双链DNA片段，当待测DNA包含双链DNA时，在步骤S1中前还包括变性的步骤，所述变性步骤使双链DNA变性为单链DNA；
S2、互补链的合成：利用DNA聚合酶对加上步骤S2中所述DNA-多聚寡核苷酸-T7Truncated Adapter单链进行互补链的合成，合成双链DNA；
S3、DNA5'接头连接：利用DNA连接酶，通过平末端或者AT的连接方式，将T5Truncated Adapter接头连接到步骤S3中的所述DNA双链的5'末端；
S4、文库扩增：利用DNA聚合酶反应液，通过PCR文库扩增，得到可上机测序的文库样本；
所述T7 Truncated Adapter是由T7 Truncated Adapter第一条链和T7TruncatedAdapter第二条链组成，所述T7 Truncated Adapter第二条链为T7 Truncated Adapter链2a、T7Truncated Adapter链2b、T7 Truncated Adapter链2c或T7 Truncated Adapter链2d，所述T7Truncated Adapter第一条链的5'端区域和T7 Truncated Adapter第二条链的5'端区域互补成为双链DNA，所述T7 Truncated Adapter第二条链的3'端是多聚寡核苷酸，所述多聚寡核苷酸选自PolyT、PolyA、PolyG或者PolyC；所述T7 Truncated Adapter第一条链的5'末端进行磷酸修饰，所述T7 Truncated Adapter第一条链的3'末端进行封闭修饰，T7 Truncated Adapter第二条链的5'末端及其3'末端进行封闭修饰，所述封闭修饰基团选自氨基、C3Space、C6 Spacer或生物素；
所述T7 Truncated Adapter第一条链核苷酸序列号如SEQ ID No.1所示，所述T7Truncated Adapter链2a核苷酸序列号如SEQ ID No.2所示，所述T7 Truncated Adapter链2b核苷酸序列号如SEQ ID No.3所示，所述T7 Truncated Adapter链2c核苷酸序列号如SEQ ID No.4所示，所述T7 Truncated Adapter链2d核苷酸序列号如SEQ ID No.5所示；
所述T5 Truncated Adapter由T5 Truncated Adapter第一条链和T5 TruncatedAdapter第二条链组成，所述Truncated Adapter第一条链的3'端区域和T5 TruncatedAdapter第二条链的5'端区域互补成为双链DNA，T5 Truncated Adapter第一条链的5'端区域是单链形式存在；T5 Truncated Adapter第一条链的5'末端进行封闭修饰，所述T5Truncated Adapter第一条链的3'末端进行硫代修饰，T5 Truncated Adapter第二条链的5'末端及3'末端进行封闭修饰，所述封闭修饰基团选自氨基、C3 Spacer、C6 Spacer或生物素，所述T5 Truncated Adapter第一条链为T5 Truncated Adapter链1a或T5 TruncatedAdapter链1b；
所述T5 Truncated Adapter链1a核苷酸序列号如SEQ ID No.6所示，所述T5Truncated Adapter链1b核苷酸序列号如SEQ ID No.7所示，所述T5 Truncated Adapter第二条链核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示。
再一步地，所述DNA连接酶选自T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶、E.coli DNA连接酶。
还进一步地，所述DNA聚合酶选自Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真的DNA聚合酶。
更进一步地，所述DNA修复酶选自T4 PNK Klenow、FEN1及Endonuclease V。
更进一步地，所述所述T7 Truncated Adapterd的连接体系为组合酶，所述组合酶选自TDT、E.coli DNA Ligase、T4PNK、Klenow、FEN1和Endonuclease V。
更进一步地，步骤S1中所述待测DNA为基因组gDNA、FFPE DNA、cell free DNA、ChIP DNA、古生菌、病毒DNA、RNA-seq的单链cDNA及Bisifute DNA中的一种。
本发明还提供了一种采用上述方法利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，包含如下组分：
(1)工具酶：所述工具酶包括末端转移酶、DNA修复酶、DNA聚合酶、DNA连接酶；
(2)工具酶反应体系：各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液；
(3)接头体系：T7 Truncated Adapter接头及T5 Truncated Adapter接头；
(4)延伸体系：T7引物；
(5)PCR反应体系；
(6)Low-EDTA-TE；
所述T7 Truncated Adapter及T5 Truncated Adapter为含有特殊修饰碱基的接头；
所述特殊修饰碱基包括用于增加5'末端连接效率和防止链延伸的碱基或防止目标DNA文库的3'端OH延伸的碱基；所述特殊修饰碱基为磷酸基团或氨基、C3 Spacer、C6Spacer及生物素等。
进一步地，所述T7 Truncated Adapter接头设计如图1所示；
所述T7 Truncated Adapter是由T7 Truncated Adapter第一条链和T7TruncatedAdapter第二条链组成，所述T7 Truncated Adapter第二条链为T7 Truncated Adapter链2a、T7Truncated Adapter链2b、T7 Truncated Adapter链2c或T7 Truncated Adapter链2d，所述T7Truncated Adapter第一条链的5'端区域和T7 Truncated Adapter第二条链的5'端区域互补成为双链DNA，所述T7 Truncated Adapter第二条链的3'端是多聚寡核苷酸，所述多聚寡核苷酸选自PolyT、PolyA、PolyG或者PolyC；所述T7 Truncated Adapter第一条链的5'末端进行磷酸修饰，所述T7 Truncated Adapter第一条链的3'末端进行封闭修饰，T7 Truncated Adapter第二条链的5'末端及其3'末端进行封闭修饰，所述封闭修饰基团选自氨基、C3Space、C6 Spacer或生物素；
所述T7 Truncated Adapter第一条链核苷酸序列号如SEQ ID No.1所示，所述T7Truncated Adapter链2a核苷酸序列号如SEQ ID No.2所示，所述T7 Truncated Adapter链2b核苷酸序列号如SEQ ID No.3所示，所述T7 Truncated Adapter链2c核苷酸序列号如SEQ ID No.4所示，所述T7 Truncated Adapter链2d核苷酸序列号如SEQ ID No.5所示；
所述T5 Truncated Adapter由T5 Truncated Adapter第一条链和T5 TruncatedAdapter第二条链组成，所述Truncated Adapter第一条链的3'端区域和T5 TruncatedAdapter第二条链的5'端区域互补成为双链DNA，T5 Truncated Adapter第一条链的5'端区域是单链形式存在；T5 Truncated Adapter第一条链的5'末端进行封闭修饰，所述T5Truncated Adapter第一条链的3'末端进行硫代修饰，T5 Truncated Adapter第二条链的5'末端及3'末端进行封闭修饰，所述封闭修饰基团选自氨基、C3 Spacer、C6 Spacer或生物素，所述T5 Truncated Adapter第一条链为T5 Truncated Adapter链1a或T5 TruncatedAdapter链1b；
所述T5 Truncated Adapter链1a核苷酸序列号如SEQ ID No.6所示，所述T5Truncated Adapter链1b核苷酸序列号如SEQ ID No.7所示，所述T5 Truncated Adapter第二条链核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示。
还进一步地，所述DNA修复酶，选自T4 PNK、Klenow、FEN1及Endonuclease V；
所述DNA聚合酶，选自Taq聚合酶、A家族DNA聚合酶、B家族高保真的DNA聚合酶；
所述DNA连接酶，选自T4 DNA连接酶、Taq DNA连接酶及E.coli DNA连接酶。
更进一步地，所述所述T7 Truncated Adapter的连接体系为组合酶，所述组合酶选自TDT、E.coli DNA Ligase、T4PNK、Klenow、FEN1和Endonuclease V。
本发明的有益效果为：本发明实现对各种DNA样本的成功建库，打破了常规的建库手段，规避了末端修复造成的DNA的损失，尽可能的反应样本的真实信息。本发明尤其在针对5pg～1μg的痕量DNA样本建库时，相对现有技术具备较大优势：1、本发明对于DNA样品没有选择性，待测DNA可以是双链DNA、单链DNA、完整的DNA或者受损的DNA片段；2、本发明可以针对痕量DNA样本进行建库，样本重量可低至5pg～1μg；3、针对简单样本或者复杂样本都可以试验高效的DNA建库。
附图说明
图1是采用本发明方法的T7 Truncated Adapter结构示意图；
图2是采用本发明方法的T5 Truncated Adapter结构示意图；
图3是采用本发明方法的在寡核苷酸N1的末端加PolyA效率分析示意图；
图4是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的末端转移酶在不同孵育时间的加PolyA效率分析示意图；
图5是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的3'接头效率分析示意图；
图6是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的3'接头效率分析示意图；
图7是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的互补链的合成分析示意图；
图8是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的5'接头效率分析示意图；
图9是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的PCR扩增效率分析示意图；
图10是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的不同样本的文库制备示意图；
图11是本发明提供的一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法的痕量样本的文库制备示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1
1.1)DNA末端PolyA的添加：
本实施例中，使用N1(上海捷瑞生物公司)寡核苷酸作为研究底物，N1核苷酸列如SEQ ID No.9所示，利用末端转移酶(Terminal Transferase，TdT，New England Biolabs/NEB，M0315)在N1 3'末端进行PolyA的添加示例分析：
1.2)具体的PolyA的添加步骤：
配制反应体系如下：
运行反应程序：37℃/15min，72℃/10min，4℃/hold。
1.3)测试结果：
通过比较不同的10×TdT Buffer组分，如下表，发现不同的反应缓冲液对寡核苷酸末端加尾能力不同，如图3所示，其中1号为阴性对照N1，2～6号分别为10×TdT Buffer1～5，其中10×TdT Buffer 5加PolyA效果最好，可以加到10个PolyA以上。10×TdT Buffer5在37℃不同的孵育时间上表现基本一致，加PolyA个数相差较小，如图4所示，其中1号为阴性对照N1，2～4号分别为10×TdT Buffer 5在37℃分别孵育15min、20min和30min。
实施例2
2.1)DNA3'接头连接效率测试：
本实施例使用的是来自质粒pBC4(NEB，N0354)随机扩增的～150bp(S1)和～300bp(S2)为DNA底物进行3'接头效率测试。扩增S1的引物核苷酸序列如SEQ ID No.10、11所示。扩增S2的引物核苷酸序列为如SEQ ID No.12、13所示。使用试剂10×TdT Buffer 5，商业化的10U TdT(NEB，M0315)，60U E.coli DNA ligase(NEB，M0205)，10U T4 PNK(T4Polynucleotide Kinase，NEB，M0201)，其中，TdT可以完成对DNA3'末端单核苷酸的添加，E.coli DNA ligase可以完成PolyA和T7接头的Nick的连接，T4 PNK可以对DNA 5'末端进行修复，利于5'接头的连接。测试具有3'-5'外切酶活性的Klenow(NEB，M0212)、pol1(NEB，M0210)、FEN1(NEB，M0645)及Endonuclease V(NEB，M0305)对3'接头连接效率的影响，这些外切酶可以补足或切掉多余的PolyA。该过程完成了通过PolyA和T7TruncatedAdapter接头的连接。T7 Truncated Adapter接头结构如图1所示，核苷酸序列是：第一条链核苷酸序列号如SEQ ID No.1所示，第二条链核苷酸序列号如SEQ ID No.2所示。T7接头的5'端为磷酸基团修饰的腺嘧啶，3'端为氨基修饰的胞嘧啶，T7接头的化学修饰可以抑制非特异性延伸，增加和PolyA的连接效率。
本方法能够实现对不同底物预变性为单链的DNA进行3'末端加PolyA及T7Truncated Adapter接头的连接过程。
2.2)实验过程：
配制反应体系如下：
在37℃温度下，反应15分钟，95℃温度下，灭活2分钟。
1.8×AMPure XP磁珠全回收。
2.3)实验结果
如图5所示，其中A为S1阴性对照，B为实验组1，C为实验组2，D为实验组3。
如图6所示，其中A为S2阴性对照，B为实验组1，C为实验组2，D为实验组3。
可见，Klenow、FEN1及IndoV都可以对S1/S2进行3'接头连接效率到达90％以上的。
实施例3
3.1)互补链的合成：
继续使用来自质粒pBC4(NEB，N0354)随机扩增的～150bp(S1)和～300bp(S2)为DNA底物进行互补链的合成。使用商业化的试剂2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix(KapaBiosystems/Kapa，KM2618)，测试互补链的合成效率。该过程完成了变性的单链DNA的互补链的延伸。T7引物核苷酸序列号如SEQ ID No.14所示。
本方法能够实现对不同底物加尾单链的DNA的互补链的合成过程。
3.2)实验过程：
配制反应体系如下：
反应条件如下：
反应结束，1.2×AMPure XP磁珠捕获，使用10μL的Low-EDTA-TE洗脱；
3.3)实验结果：如图7所示，其中A为S1阴性对照，B为S1的延伸，可见使用本方法可以对S1进行完全延伸。
实施例4
4.1)DNA5'接头连接效率测试：
继续使用来自质粒pBC4(NEB，N0354)随机扩增的～150bp(S1)和～300bp(S2)为DNA底物进5'接头连接效率测试。使用的试剂为T4 DNA Ligase(NEB，M0202)、T5接头和2×Quick ligation buffer(132mM Tris-HCl、20mM MgCl2、2mM DTT、2mM ATP及15％PEG)，测试DNA 5'接头连接效率。该过程完成了DNA延伸结束后T5 Truncated Adapter接头的连接。T5 Truncated Adapter接头结构如图2所示。T5 Truncated Adapter接头核苷酸序列是：第一条链核苷酸序列号如SEQ ID No.6所示，第一条链核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示。其中我们对T5 Truncated Adapter接头5'端进行修饰，可以增加连接效率，降低接头二聚体的产生。所述T5 Truncated Adapter接头5'端为氨基修饰的腺嘧啶，所述T5接头3'端为硫代胸腺嘧啶。
4.2)实验过程：
配制反应体系如下：
反应条件如下：
反应结束，1.0×AMPure XP磁珠捕获，使用21μL的Low-EDTA-TE洗脱；
4.3)实验结果：如图8所示，其中A为S1阴性对照，B为S1的5'接头的连接，由图可知，使用本方法可以对S1进行5'接头连接。
实施例5
5.1)文库扩增效率测试：
继续使用来自质粒pBC4(NEB，N0354)随机扩增的～150bp(S1)和～300bp(S2)为DNA底物进PCR扩增效率测试。使用商业化的试剂2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix(Kapa,KM2618)进行PCR的扩增。扩增引物是Universal PCR引物(Universal PCR Primer,RM20248,Abclonal)和Index引物(Index,RM22201,Abclonal)。
本方法能够实现对不同底物DNA的PCR扩增过程。
5.2)实验过程：
配制反应体系如下：
反应条件如下
6个循环反应结束，1.0×AMPure XP磁珠捕获，使用31μL的Low-EDTA-TE洗脱；
实验结果：如图9所示，其中A为S1的PCR扩增，B为S2的PCR扩增，可见此方法可对S1/S2进行PCR扩增。
实施例6
不同样本文库制备的测试：
本实施例采用上述的一种DNA文库制备的连接技术，对常见的不同来源的DNA样本进行建库测试。我们测试了四种样本：包括动植物基因组、FFPE DNA、cfDNA及BisifuteDNA。以下是所示的是基本的DNA文库构建步骤，为了检测可靠性，每个样本设置了两个重复。
6.1)95℃预处理DNA样本
根据下表投入DNA样本，充分混匀样本，95℃孵育2min，立即冰上放置，使双链DNA充分变性为单链DNA。
6.2)DNA3'接头连接
配制反应体系如下，将10U TdT，60U E.coli DNA ligase，10U T4PNK及10UKlenow组成混合Enzyme mix使用。
运行反应程序：37℃/15min，95℃/2min，4℃/hold.
6.3)互补链的合成
配制反应体系如下：
运行反应程序：98℃/45s，63℃/30s,68℃/5min，4℃/hold.
6.4)互补链合成后纯化
按照1.2×AMPure XP磁珠比例进行DNA纯化。21μL洗脱磁珠。取20μL DNA用于后续5'接头连接反应。
6.5)5'接头连接反应
配制反应体系如下：
运行反应程序：25℃/15min，4℃/hold.
6.6)5'接头连接后纯化
按照1.0×AMPure XP磁珠比例进行DNA纯化。21μL洗脱磁珠。取20μL连接后DNA用于后续PCR反应。
6.7)文库扩增
配制反应体系如下：
运行反应程序：98℃/45s；7/9/13/8cycles(98℃/10s，60℃/30s，72℃/30s)；72℃/1min；4℃/hold。
8.文库扩增后纯化
使用1.0×AMPure XP DNA纯化磁珠进行DNA的PCR cleanup。31μL水洗脱磁珠。取30μL DNA文库。
Qubit定量，产量如下：
每个样本随机取一个进行2100分析，如图10所示，其中A为200bp片段化的HumangDNA，B为200bp片段化的Human gDNA的测序文库，C为150bp片段化的FFPE DNA，D为150bp片段化的FFPE DNA的测序文库，E为cfDNA，F为cfDNA的测序文库，G为150bp片段化的BisifuteDNA，H为150bp片段化的Bisifute DNA的测序文库，文库大小合适，符合Illumina测序标准。
实施例7
7.1)痕量样本文库制备的测试：
本实施例采用上述的一种DNA文库制备的连接技术，对痕量DNA样本进行建库测试。我们测试了100pg和10pg投入量的建库。参照实施案例6，对100pg样本DNA进行了17个PCR文库扩增，对10pg样本DNA进行了18个PCR文库扩增。建库产量如下表所示：
每个样本随机取一个进行2100分析，如图11所示，其中A为200bp片段化的HumangDNA 5pg建库，B为200bp片段化的Human gDNA 10pg建库，C为200bp片段化的Human gDNA100pg建库，文库大小合适，符合Illumina测序标准。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
序列表
<110> 上海英基生物科技有限公司
<120> 一种利用高效地连接技术快速制备DNA测序文库的方法和试剂盒
<130> 201908
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> T7 Truncated Adapter 1
<400> 1
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag t 31
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> T7 Truncated Adapter 2a
<400> 2
tgctcttccg atcttttttt tt 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> T7 Truncated Adapter 2b
<400> 3
tgctcttccg atctaaaaaa aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> T7 Truncated Adapter 2c
<400> 4
tgctcttccg atctgggggg gg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> T7 Truncated Adapter 2d
<400> 5
tgctcttccg atctcccccc cc 22
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> T5 Truncated Adapter 1a
<400> 6
ctgactttcc ctacacgacg ctcttccgat ct 32
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> T5 Truncated Adapter 1b
<400> 7
ctgactttcc ctacacgacg ctcttccgat ctt 33
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> T5 Truncated Adapter 2
<400> 8
agatcggaag agc 13
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> N1
<400> 9
ctgaggagaa gtctgccgtt actgccctgt ggggctaggt gaa 43
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> S1primer F
<400> 10
cagagcagat tgtactgaga gtgc 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> S1primer R
<400> 11
agctggcgta atagcgaaga g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> S2 primer F
<400> 12
agcggcagac atgcagggca 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> S2 primer R
<400> 13
ctgcgtggaa ctttcgatcc c 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> T7 primer
<400> 14
gtgactggag ttcagacgtg 20
