用于化学传感的分子印迹聚合物
技术领域
本发明涉及与互补的荧光标记结合的分子印迹聚合物，以及所述材料用于检测水中的分析物的用途。
背景技术
在本说明书中列举或讨论在先出版的文档应没有必要被认为承认该文档是现有技术的一部分或是公知常识。
近年来，来自有毒浮游植物物种的全球藻华爆发在频率和分布上都有所增加。由有害藻华(HAB)尤其是双鞭毛藻(dinoflagellate)产生的植物性毒素，当它们超过一定阈值时可以毒害海洋生物和人类。还存在饮用水也可能被这些代谢物污染的担心(D.Caron,et al.,Water Research,2010,44,385-416)。
在发达国家，消费者对饮用水质量的评估超出了对于危害健康的化学和生物污染物的管理要求。水质被认为与饮用水的味道和气味有着复杂的联系，这已成为供水商日益关注的问题之一。两种化合物，土臭素(GSM)和2-甲基异冰片(2-MIB)，已被确定是水的泥土和发霉的味道以及气味的原因(J.Mallevialle,I.H.Suffet,Identification andTreatment of Tastes and Odors in Drinking Water,American Water WorksAssociation,Denver,1987)。这些化合物是无毒的天然污染物，由供水源中的各种藻类和细菌产生。当在集水区中发生藻华时，该问题尤其严重。
虽然目前存在检测藻类代谢物的方法，但它们缺乏实用性和有效性。通常，在不同的地点收集大量的水样，并对每个样品进行预处理以分离和浓缩物质，然后进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析。与GC-MS相结合的预处理方法的实例包括：
·闭环捕集分析(closed-loop stripping analysis)(D.Mitjans,et al.,WaterSci.Technol.,2005,52,145-150；M.J.McGuire,et al.,J.-Am.Water Works Assoc.,1981,73,530-537；S.W.Krasner,et al.,Abstr.Pap.Am.Chem.Soc.,1980,180,5-ENVR)；
·液-液微萃取(C.Cortada,et al.,J.Chromatogr.A,2011,1218,17-22；H.S.Shin,et al.,Chromatographia,2004,59,107-113)；
·搅拌棒吸附提取(R.R.Madrera,et al.,J.Food Sci.,2011,76,C1326-C1334；A.M.C.Ferreira,Anal.Bioanal.Chem.,2011,399,945-953；P.Grossi,et al.,J.Sep.Sci.,2008,31,3630-3637)；
·吹扫和捕集(A.Salemi,et al.,J.Chromatogr.A,2006,1136,170-175；X.W.Deng,et al.,J.Chromatogr.A,2011,1218,3791-3798)；
·固相微萃取(S.Suurnakki,et al.,Water Res.,2015,68,56-66；R.McCallum,et al.,Analyst,1998,123,2155-2160；Y.H.Sung,et al.,Talanta,2005,65,518-524；K.Salto,et al.,J.Chromatogr.A,2008,1186,434-437；J.Parinet,et al.,Int.J.Environ.Anal.Chem.,2011,91,505-515)；和
·膜提取(M.J.Yang,et al.,Anal.Chem.,1994,66,1339-1346；A.K.Zander,etal.,Water Res.,1997,31,301-309)。
整个检测过程是费力的，并因此仍然需要更有效的系统。
此外，理想的水监测方案需要证明的内容存在固有的局限性。在第一个实例中，准备用于分析的样品以及随后对每个样品的分析所需的时力必须很低，以便能够对任何可能的藻华有快速响应时间。此外，与所用仪器和/或使用复杂仪器时间有关的成本必须保持较低，以确保具有成本效益。最重要的是，检测方法必须灵敏且有选择性，以便其可用于准确检测水样中的目标分析物。
鉴于上述情况，仍然需要新的材料和/或装置来有效地现场检测水中的藻类代谢物。设想这些材料可用于在现场初步筛选水样以识别受影响的样品，然后再将受影响的样品送往实验室进行进一步定量分析。
可用于化学传感的一类材料是分子印迹聚合物(MIP)，其是被设计用来充当人工受体的合成聚合物。聚合物上的识别位点是通过印迹过程合成的，其中，围绕模板分子进行聚合作用以形成类似模具的外壳(L.Chen,et al.,Chem.Soc.Rev.,2011,40,2922-2942)。去除模板会在聚合物上产生其形状的印迹记忆。这种印记在大小、形状和理化性质上与目标分子互补，并且能够重复模板的结合(K.Haupt,et al.,Top.Curr.Chem.,2012,325,1-28)。
发明内容
以下编号的条款详细说明了本发明的各个方面和实施方式。
1.一种使用替代分子代替目标分子来提供分子印迹聚合物的方法，该方法包括以下步骤:
(i)选择目标分子，并然后选择具有至少0.80的形状相似度得分的替代分子；以及
(ii)使用替代分子，通过在替代分子的存在下使功能单体与交联剂反应来形成分子印迹聚合物库，其中替代分子与功能单体的比例为1:2至1:6，且功能单体与交联剂的比例在每个库成员中为1:1至1:2.5，并建立每个库成员与目标分子和/或替代分子的结合能力(QMIP)；
(iii)通过在不存在替代分子的情况下使功能单体与交联剂反应来形成对应的非分子印迹聚合物库，其中功能单体:交联剂在每个库成员中的比例为1:1至1:2.5，并建立每个库成员与目标分子和/或替代分子的结合能力(QNIP)；
(iv)选择用于检测目标分子的分子印迹聚合物，其中该分子印迹聚合物对于目标分子的结合效率(QMIP除以对应的QNIP)大于或等于2，和/或或对于替代分子的结合效率大于或等于2.5。
2.根据条款1所述的方法，其中，形状相似度得分是使用基于计算形状的筛选算法获得的，任选地，其中替代分子具有的形状相似度得分为至少0.85。
3.根据条款1或条款2所述的方法，其中，功能单体选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种。
4.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，交联剂选自由二甲基丙烯酸乙二醇酯和三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯组成的组中的一种或多种。
5.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，目标分子是微生物的代谢物。
6.根据条款5所述的方法，其中，微生物是藻类。
7.根据条款5或条款6所述的方法，其中，代谢物是土臭素(土臭味素)或2-甲基异冰片，任选地其中，在没有对含有土臭素的分析物进行预浓缩步骤的情况下，被选择用于检测土臭素的聚合物具有的检测限为60至80ppb，并且在没有对含有2-甲基异冰片的分析物进行预浓缩步骤的情况下，被选择用于检测2-甲基异冰片的聚合物具有的检测限为40至60ppb。
8.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，替代分子与功能单体的比例为1:2至1:4，并且功能单体与交联剂的比例为1:1至1:2.5。
9.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，功能单体和交联剂在替代分子的存在下的反应是自组装反应。
10.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，在条款1的步骤(iv)中所选的分子印迹聚合物是具有最大结合效率的聚合物。
11.根据前述条款中任一条所述的方法，其中，该方法还包括形成含有所选分子印迹聚合物的检测装置的步骤。
12.一种适合于检测目标分子的分子印迹聚合物，该聚合物由以下形成：
功能单体，选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种；
交联剂，选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯；以及
替代分子，用于形成对目标分子有亲和力的在聚合物中的空腔，其中，该分子印迹聚合物具有：
对目标分子的结合能力为由使用目标分子本身产生的分子印迹聚合物获得的结合能力的至少60％；和
对目标分子的结合能力为10至30μmol/g；和/或
该聚合物包括具有多个空腔的交联聚合物，其中：
该聚合物由选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种的功能单体和选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯的交联剂形成；
空腔具有对替代分子的第一亲和力和对目标分子的第二亲和力，其中，第一亲和力大于或等于第二亲和力，其中，该分子印迹聚合物具有：
对目标分子的结合能力为由使用目标分子本身产生的分子印迹聚合物获得的结合能力的至少60％；和
对目标分子的结合能力为10至30μmol/g。
13.根据条款12所述的聚合物，其中：
(a)功能单体与交联剂的比例为1:1至1:2.5；和/或
(b)该聚合物具有的对目标分子的结合效率大于或等于2。
14.根据条款12或条款13所述的聚合物，其中，该聚合物还包括目标分子的荧光标记的替代物，其中该替代物是比目标分子更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于目标分子时就被从聚合物替代。
15.根据条款12至14中任一项所述的聚合物，其中，目标分子是土臭素，任选地其中该聚合物具有的对土臭素的结合能力为10至15μmol/g，诸如11.6μmol/g。
16.根据条款15所述的聚合物，其中，功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，且功能单体:交联剂的比例为1:1。
17.根据条款15或条款16所述的聚合物，其中，该聚合物还包括土臭素的荧光标记的替代物，其中该替代物是比土臭素更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于土臭素时就被从聚合物替代。
18.根据条款17所述的聚合物，其中，土臭素的荧光标记的替代物是2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸[(4aS,8aS)-十氢萘-1-基]酯([(4aS,8aS)-decalin-1-yl]-2-(7-amino-4-methyl-2-oxo-chromen-3-yl)acetate、[(4aS,8aS)-十氢萘-1-基]2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸酯)。
19.根据条款12至14中任一项所述的聚合物，其中，目标分子是2-甲基异冰片，任选地其中该聚合物具有的对2-甲基异冰片的结合能力为15至20μmol/g，诸如18.9μmol/g。
20.根据条款19所述的聚合物，其中，功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇酯，且功能单体:交联剂的比例为1:2.5。
21.根据条款19或条款20所述的聚合物，其中，该聚合物还包括2-甲基异冰片的荧光标记的替代物，其中该替代物是比2-甲基异冰片更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于2-甲基异冰片时就被从聚合物替代。
22.根据条款21所述的聚合物，其中，2-甲基异冰片的荧光标记的替代物是2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸环己基酯(cyclohexyl-2-(7-amino-4-methyl-2-oxo-chromen-3-yl)acetate、环己基2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸酯)。
23.一种用分子印迹聚合物检测样品中目标分子浓度的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(a)提供根据条款14、17、18、21和22中任一项所述的分子印迹聚合物和待分析的样品；
(b)将分子印迹聚合物与样品接触一段时间以形成样品-聚合物混合物；
(c)分离该样品-聚合物混合物以提供接触样品；以及
(d)通过观察该接触样品中荧光的存在来定性检测该接触样品中目标分子的存在，或通过使用荧光分光计测量该接触样品中的荧光来定量测定该接触样品中目标分子的浓度。
24.根据条款23所述的方法，其中，目标分子是土臭素或2-甲基异冰片，任选地其中，用于检测土臭素的聚合物具有的检测限为60至80ppb，并且用于检测2-甲基异冰片的聚合物具有的检测限为40至60ppb。
25.根据条款23或条款24所述的方法，其中，在步骤(b)之前，样品要进行预浓缩过程，该预浓缩过程包括以下步骤：
(i)用预浓缩材料接触样品以捕获至少目标分子；
(ii)随后从预浓缩材料中释放目标分子以提供随后在条款23的步骤(b)至(d)中使用的预浓缩的样品。
26.根据条款25所述的方法，其中，预浓缩材料是反相材料。
27.根据条款26所述的方法，其中，反相材料是C16-C18反相材料。
28.根据条款25所述的方法，其中，预浓缩材料是适用于捕获和释放目标分子的分子印迹聚合物，该聚合物由以下形成：
功能单体，选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种；
交联剂，选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯；以及
替代分子，用于形成对目标分子有亲和力的在聚合物中空腔，其中，该分子印迹聚合物具有：
对目标分子的结合能力为由使用目标分子本身产生的分子印迹聚合物获得的结合能力的至少60％；
对目标分子的结合能力为10至30μmol/g；以及
对目标分子的结合效率大于或等于2。
29.根据条款28所述的方法，其中，分子印迹聚合物中的功能单体与交联剂的比例为1:1至1:2.5。
30.根据条款28或条款29所述的方法，其中，目标分子是土臭素，任选地其中聚合物具有的对土臭素的结合能力为10至15μmol/g，诸如11.6μmol/g。
31.根据条款30所述的方法，其中，功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，且功能单体:交联剂的比例为1:1。
32.根据条款30或条款31所述的方法，其中，预浓缩步骤将检测限降低至样品中20ppt的土臭素。
33.根据条款28或条款29所述的方法，其中，目标分子是2-甲基异冰片，任选地其中聚合物具有的对2-甲基异冰片的结合能力为15至20μmol/g，诸如18.9μmol/g。
34.根据条款33所述的聚合物，其中，功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇酯，且功能单体:交联剂的比例为1:2.5。
35.根据条款33或条款34所述的方法，其中，预浓缩步骤将检测限降低至样品中14ppt的2-甲基异冰片。
36.一种在待分析的样品中定性和/或定量地检测目标分子的装置，其中，该装置包括：
预浓缩部，用于接收样品并在预浓缩材料上捕获至少目标分子；
预浓缩样品部，用于从预浓缩部接收预浓缩的样品；和
检测部，接收预浓缩的样品并定性地和/或定量地检测目标分子，其中：
检测部包括根据条款14、17、18、21和22中任一项所述的分子印迹聚合物。
37.根据条款36所述的装置，其中，预浓缩材料是条款26和27中所述的反相材料或条款12、13、15、16、19和20中所述的分子印迹聚合物。
附图说明
图1描绘了使用替代模板合成MIP的构思，并使用与标记分子结合的MIP用于通过标记分子被分析物的取代来检测目标分析物。
图2描绘了以下的化学结构：GSM(1)，顺式-十氢-1-萘酚(3)作为其替代模板，和2-MIB(2)，1-溴代金刚烷(4)作为其替代模板。
图3描绘了(a)GSM与MIP-GSMS/MAA/TRIM2的吸附动力学曲线，其中GSM溶液的浓度为1.37mmol L-1；以及(b)2-MIB与MIP-MIBS/MAA/EDGMA2的吸附动力学曲线，其中2-MIB溶液的浓度为1.37mmol L-1。
图4描绘了组合制备的MIP-GSMS对GSM替代物(顺式-十氢-1-萘酚)的结合效率的比较(a-c)。样品标签的缩写如下：分子印迹聚合物-GSM替代物/功能单体/交联剂(条件编号)，例如MIP-GSMS/MAA/TRIM1。
图5描绘了组合制备的MIP-GSMS对GSM的结合效率的比较(a-c)。模板与功能单体的摩尔比为1:2、1:4和1:6。将功能单体与EGDMA的摩尔比设置为1:2.5，并将功能单体与TRIM的摩尔比设置为1:1。样品标签的缩写遵循图4的缩写。
图6描绘了(a)使用MAA作为功能单体，EGDMA或TRIM作为交联剂合成的各种MIP-MIBS与2-MIB的结合效率；以及(b)2-MIB溶液的浓度为1.37mmol L-1时，这些MIP-MIBS与2-MIB的结合能力。
图7描绘了(a-c)MIP-GSMS/MAA/TRIM2分别在x5,000、x2,500和x45,000放大倍数下的代表性FESEM图像；和(d)NIP-MAA/TRIM2在x2,000放大倍数下的代表性FESEM图像。聚合物纳米颗粒的尺寸直接从FESEM图像中测量，其中测量来自不同样品区域的至少50个颗粒。
图8描绘了(a)移除模板之前MIP-GSMS/MAA/TRIM2；(b)移除模板之后MIP-GSMS/MAA/TRIM2；和(c)NIP-MAA/TRIM2的FT-IR光谱。
图9描绘了(a)MIP-GSMS/MAA/TRIM2和(b)MIP-MIBS/MAA/EGDMA2分别对GSM和2-MIB的结合能力，GSM和2-MIB溶液两者的浓度均为1.37mmol L-1。
图10描绘了(a)通过将7-氨基-4-甲基-3-香豆酸(5)与顺式-十氢-1-萘酚(3)缀合合成荧光标记6；(b)MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2分别与荧光标记6和与GSM的结合能力的比较；(c)相对于从0.08至20mg L-1的GSM溶液浓度的被取代的荧光标记6的量；以及(d-e)分别在存在80ppb和160ppb的GSM的情况下，在将MIP-GSMS与结合荧光标记的底物温育之后溶液的荧光强度的视觉比较。对照样品含有相同量的材料和溶剂，但不含GSM。
图11描绘了(a)通过将7-氨基-4-甲基-3-香豆酸(5)与环己醇(7)缀合合成荧光标记8；(b)相对于从0.06至1.25mg L-1的2-MIB溶液浓度的被取代的荧光标记6的量；以及(c)在于1mL乙腈中存在不同浓度(60至320ppb)2-MIB的情况下，在将15mg的MIP-MIBS与结合荧光标记的底物温育之后溶液的荧光强度的视觉比较。对照样品含有相同量的材料和溶剂，但不含2-MIB。
图12描绘了MIP-GSMS/MAA/TRIM2分别对GSM和1-萘胺的结合能力的比较，两种溶液的浓度均为1.37mmol L-1。
图13描绘了(a)预浓缩过程，以获得浓缩的GSM样品，用于使用有结合荧光标记的底物的MIP-GSMS进行检测；(b)在通过SPE预浓缩之后，预浓缩的水库水的杂质的GC-MS色谱图。化合物A被鉴定为2-(2-丁氧基乙氧基)乙烷-1-醇，而化合物E被鉴定为2,4,7,9-四甲基癸-5-炔-4,7-二醇。化合物B、C和D未知。
图14描绘了(a)在各种样品中，在将15mg的MIP-GSMS与结合荧光标记的底物6温育之后溶液的荧光强度的视觉比较：对照1含有1mL MeOH/H2O(v/v 50:50)；样品“1mL现场水”含有10ng L-1土臭素于MeOH/H2O(v/v 50:50)中；对照2含有1mL的MeOH；且样品“1mL浓缩的现场水”含有1mL浓缩的现场样品于MeOH中；以及(b)从各自样品中取代的荧光标记的底物6的量。
具体实施方式
已令人惊讶地发现，所选替代分子可用于大规模制造分子印迹聚合物(MIP)，该分子印迹聚合物可用于检测无法以足以在商业规模上产生MIP的量提供的目标化合物。
因此，在本发明的第一方面，提供了用于使用替代分子代替目标分子来提供分子印迹聚合物的方法，该方法包括以下步骤:
(i)选择目标分子，并然后选择具有至少0.80的形状相似度得分的替代分子；以及
(ii)使用替代分子，通过在替代分子的存在下使功能单体与交联剂反应来形成分子印迹聚合物库，其中替代分子与功能单体的比例为1:2至1:6，且功能单体与交联剂的比例在每个库成员中为1:1至1:2.5，并建立每个库成员与目标分子和/或替代分子的结合能力(QMIP)；
(iii)通过在不存在替代分子的情况下使功能单体与交联剂反应形成对应的非分子印迹聚合物库，其中功能单体:交联剂在每个库成员中的比例为1:1至1:2.5，并建立每个库成员与目标分子和/或替代分子的结合能力(QNIP)；
(iv)选择用于检测目标分子的分子印迹聚合物，其中该分子印迹聚合物对于目标分子的结合效率(QMIP除以对应的QNIP)大于或等于2，和/或对于替代分子的结合效率(QMIP除以对应的QNIP)大于或等于2.5。
上述方面可以是普遍适用的，但已在本文中关于土臭素(GSM)和2-甲基异冰片(2-MIB)进行了证明。如上所述，对GSM和MIB的检测系统的设计基于用于识别GSM和2-MIB的分子印迹聚合物(MIP)。显然，模板的选择决定了印迹方法对于分子识别的有效性。在理想的情况下，模板就是目标分子本身。然而，由于它们是稀缺的，这是不合理的，且当代谢物有毒时，在处理毒素中还存在安全性问题。为了解决这个问题，在选择合适的模板(替代物)用于聚合物合成时使用了计算选择方法。因此，根据选择标准，使用最佳模拟GSM或2-MIB的模板(或替代物)来合成一系列MIP。
由于功能单体和交联剂的库很大，因此确定最佳的聚合物前体绝非易事。为了克服这个问题，选择组合方案并用于制备MIP。该方法涉及使用所选的替代物聚合物和交联剂以各种比例制造MIP，从而产生MIP库，然后对其进行分析。此外，聚合物和交联剂也是不同的。然后，选择“最佳的”MIP-GSM和MIP-MIB模板，由于它们对所需分析物具有相对较高的特定选择性(即结合效率)。
为了更容易地确定目标分析物的存在，还开发了使用所选MIP的简单的定性和定量荧光测试。检测概念的图画描绘在图1中示出。如下文更详细讨论的，还设计并合成了能够很好地与MIP结合的荧光标记的底物。选择这种底物是重要的，因为这种底物需要具有对MIP的良好的结合能力(以最小化浸出)，但结合效率必须低于待测试的实际分析物的结合效率。这样，在存在分析物的情况下，置于MIP的空腔内的标记底物就会被取代，且荧光可被观察和测量。最初的发现表明，使用预负载有荧光标记的底物的MIP，能够建立对土臭素和2-MIB的最低检测阈值分别为80ppb和60ppb。
在图1中，使用替代模板110生成MIP 100，然后使用常规方法将替代模板移除。然后，所得到的MIP 100可与荧光标记的替代化合物120温育，后者结合在MIP的空腔内以形成复合物130。当将目标化合物140引入MIP-复合物130时，荧光标记的替代化合物120从MIP中的空腔中被取代，并形成MIP-目标复合物150。然后，可以检测荧光标记的替代化合物120，优选在将MIP从样品溶液中分离之后。
在本文的实施方式中，词语“包括”可以理解为需要所提及的特征，但不限制其他特征的存在。可替代地，词语“包括”也可以涉及以下情形，其中仅所列出的组成/特征是旨在存在的(例如，词语“包括”可以用短语“由……组成”或“基本上由……组成”替换)。明确地设想了较广泛和较狭义的解释两者均可适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括”及其同义词可以用短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词替换，反之亦然。
当在本文使用时，术语“目标分子”涉及可以使用MIP有效检测的任何物质。更具体地，本文中的术语“目标分子”是指无法以足以在商业规模上直接产生MIP量获得的分子。这样的目标分子的实例可以是已知有问题的微生物的代谢产物(例如，它的存在导致环境/质量问题，诸如由于微生物的代谢物而影响水体的气味、供人类饮用的水的气味或毒性问题)。这样的有问题的微生物的实例包括藻类，已知在某些情况下藻类会在藻华时以指数增长其群体。本文可提到的目标分子的特定实例包括土臭素和2-甲基异冰片，它们由某些微生物(诸如藻类)以微量产生。
值得注意的是，在目标分子供应充足且廉价的情况下，应优选使用所述分子，优先于使用替代物。因此，本文所述的方法可以是特别有用的，其中，目标分子要么根本无法在商业上获得，要么很难制造，要么在适合于基于其的MIP的商业开发的规模上(制造或购买)是极其昂贵的。
当在本文使用时，“替代分子”是指用于替代目标分子以产生对所讨论目标分子有有效选择性的MIP的分子。可以使用任何合适的形状相似度模型，基于至少0.80(例如0.85等)的形状相似度得分来选择替代分子。一般来说，与考虑的所有其他分子相比，被选择的替代分子将具有最高可获得的形状相似度得分。提供用于选择替代分子的形状相似度得分的合适的形状相似度模型可以是基于计算形状的筛选算法。这种算法的实例可以是来自
本文所述的分子印迹聚合物可以通过自组装制成，这涉及通过组合MIP的所有元素来形成聚合物，并允许分子间相互作用形成交联聚合物，其中模板分子(在此情况下为替代分子)结合在聚合物基体内。然后通过简单的提取技术移除替代分子。形成MIP的第二种方法涉及将印迹分子(即替代分子)与所使用的单体(一种或多种)或交联剂(一种或多种)共价连接。聚合之后，替代分子可从聚合物中被化学切割(例如参见Tse Sum Bui,Bernadette,Anal Bioanal Chem.2010,vol.398,pp 2481–2492)。
当在本文使用时，“分子印迹聚合物库”是指许多不同MIP的产生，通过使用组合技术来生成许多独特的MIP。在库中制成的MIP的数量并非特别限制的(例如从10至10,000)，但是对随后步骤中为确定结合效率而测试的组合可以有多少可能有实际的限制。可以使用任何合适的组合方法来形成许多独特的MIP，但通常可涉及与替代分子组合使用的功能单体(一种或多种)和交联剂(一种或多种)的变体，以及改变这些成分的比例。应认识到，相应的非分子印迹聚合物是使用相同技术形成的——唯一区别是替代分子没有作为反应混合物的一部分提供。
分子印迹聚合物库和非分子印迹聚合物库可以使用任何合适的功能单体(一种或多种)和交联剂(一种或多种)以任何合适的比例形成，以生成许多用于测试的MIP。当在本文使用时，功能单体是指可以用于形成聚合物的单体材料——可单独使用也可与其他单体材料组合以形成共聚物。应认识到，共聚物需要使用至少两种单体材料。可能适合于在MIP的组合文库中使用的功能单体包括但不限于甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸甲酯及其组合。可能适合于在MIP的组合文库中使用的交联剂包括但不限于二甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯(三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯)及其组合。
如上所述，组合库(以及由此得到的MIP)可包含不同比例的功能单体(一种或多种):交联剂(一种或多种)、替代分子:功能单体(一种或多种)和潜在地替代分子:交联剂(一种或多种)。本文可提到的替代分子与功能单体(一种或多种)的合适比例将为1:1至1:6，或者更特别地，1:2至1:4。本文可提到的功能单体(一种或多种)与交联剂(一种或多种)的合适比例将为0.5:1至1:5，或者更特别地，1:1至1:2.5。本文可提到的替代分子与交联剂(一种或多种)的合适比例将为1:1至1:15，或者更特别地，1:2至1:10，诸如1:2至1:4。
如上所述，然后对在上述步骤(ii)和(iii)的库中产生的MIP和非分子印迹聚合物进行测试，以获得每个库成员的结合能力(Q)，其之后在步骤(iv)中用于确定每个MIP的结合效率(QMIP/QNIP)。可以使用替代分子或更优选目标分子，使用任何合适的方法，诸如下文在实施例部分描述的方法，来建立结合能力。应认识到，MIP的结合能力(和因此的效率)将根据使用替代分子还是目标分子而不同。可以预期，对替代分子的结合效率将高于对目标分子的结合效率(由于使用替代分子作为产生MIP的模板)。因此，当使用替代分子来选择用于检测目标分子的MIP时，结合效率可以为至少2.5。相比之下，当使用目标分子来选择用于检测目标分子的MIP时，结合效率反而可以为至少2.0。在这两种情况下，应认识到，所选择的MIP将通常是所讨论库中结合效率最高/最大的MIP。
所选择的MIP可具有以十亿分之几(ppb)测量的检测限。例如，当代谢物是土臭素时，在没有对含有土臭素的分析物进行预浓缩步骤的情况下，所选择的用于检测土臭素的聚合物可具有从60至80ppb的检测限。当代谢物是2-甲基异冰片时，在没有对含有2-甲基异冰片的分析物进行预浓缩步骤的情况下，所选择的用于检测2-甲基异冰片的聚合物可具有从40至60ppb的检测限。如上所述，检测限可以指使用已负载荧光底物的MIP，其具有的结合效率低于目标分子的结合效率，使得其很容易被所述目标分子取代。下文将对此进行更详细的讨论。
应认识到，所选择的MIP可用作检测装置的一部分。下文将更详细地讨论这样的装置。
在本发明的第二方面，提供了适合于检测目标分子的分子印迹聚合物，该聚合物包括具有多个空腔的交联聚合物，其中：
该聚合物由选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种的功能单体和选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯的交联剂形成；
空腔具有对替代分子的第一亲和力和对目标分子的第二亲和力，其中，第一亲和力大于或等于第二亲和力，其中，该分子印迹聚合物具有：
对目标分子的结合能力为由使用目标分子本身产生的分子印迹聚合物获得的结合能力的至少60％；和
对目标分子的结合能力为10至30μmol/g。
本发明的第二方面还可描述为适合于检测目标分子的分子印迹聚合物，该聚合物由以下形成：
功能单体，选自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯组成的组中的一种或多种；
交联剂，选自二甲基丙烯酸乙二醇酯和/或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯；以及
替代分子，用于形成对目标分子有亲和力的在聚合物中的空腔，其中，该分子印迹聚合物具有：
对目标分子的结合能力为由使用目标分子本身产生的分子印迹聚合物获得的结合能力的至少60％；
对目标分子的结合能力为10至30μmol/g。
值得注意的是，MIP是极其稳定的且可以重复使用多次，无论是在预浓缩步骤中还是在下文讨论的检测步骤中。
功能分子(一种或多种)、交联剂(一种或多种)和替代分子如上文所定义。功能分子(一种或多种)与交联剂(一种或多种)的比例也可如上文所定义。此外，MIP对目标分子的结合效率可以为如上文所述(例如为至少2)。
本发明的MIP的定义特征是用于形成MIP的替代分子所留下的空腔。考虑到这些，应认识到MIP基本上不含替代分子。MIP可以用于目标分子的检测，或用于如下文所讨论的预浓缩材料。
应理解，本文所使用的MIP具有通过上述方法由使用替代分子产生的多个空腔。显而易见，MIP对替代分子的亲和力(例如结合能力和/或结合效率)将大于或等于(即大于)MIP对目标分子的亲和力。
在本发明的特定实施方式中，MIP可还包括目标分子的荧光标记的替代物，其中所述替代物是比目标分子更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于目标分子时就被从聚合物替代。应认识到，该目标分子的荧光标记的替代物设置在MIP的空腔内。这种布置是特别有利的，因为它允许通过检测荧光来定性和/或定量检测分析物中的目标分子。此外，该组合的MIP和设置在MIP的空腔内的荧光标记的替代物可以表现出优异的稳定性质。例如，该组合材料可稳定大于一个月。此外，应认识到，由于基础的MIP材料非常稳定，因此可以将组合材料在使用后再生。例如，可以通过执行提取步骤来去除结合的材料，然后重新引入荧光标记的替代物，从而实现这种再生。
如上所述，目标分子可以是土臭素。在这样的情况下，MIP对土臭素的结合能力可以为10至15μmol/g，诸如11.6μmol/g。本文可提到的可能适合于结合土臭素的MIP可以是其中功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯，且功能单体:交联剂的比例为1:1的MIP。所得到的MIP可能在检测之前对土臭素的预浓缩中特别有用。为了能够定量和/或定性检测，MIP可负载有土臭素的荧光标记的替代物，其中该替代物是比土臭素更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于土臭素时就被从聚合物替代。合适的土臭素的荧光标记的替代物的实例是2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸[(4aS,8aS)-十氢萘-1-基]酯。
如上所述，目标分子可以是2-甲基异冰片。在这样的情况下，MIP对2-甲基异冰片的结合能力可以为15至20μmol/g，诸如18.9μmol/g。本文可提到的可能适合于结合2-甲基异冰片的MIP可以是其中功能单体是甲基丙烯酸，交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇酯，且功能单体:交联剂的比例为1:2.5的MIP。所得到的MIP可能在检测之前对2-甲基异冰片的预浓缩中特别有用。为了能够定量和/或定性检测，MIP可负载有2-甲基异冰片的荧光标记的替代物，其中该替代物是比2-甲基异冰片更弱的结合物，使得它在聚合物暴露于2-甲基异冰片时就被从聚合物替代。合适的2-甲基异冰片的荧光标记的替代物的实例是2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基苯并吡喃-3-基)乙酸环己基酯。
如上所述，本文产生的MIP在检测目标分子的存在方面可能尤其有用，即使当目标分子仅以微量存在于样品中时。这对于检测可能对水体构成健康和/或环境风险的微生物实体的存在可能是特别有用的。因此，在本发明的另一方面，提供了用分子印迹聚合物检测样品中目标分子浓度的方法，其中，该方法包括以下步骤：
(a)提供如上所述的包括目标分子的荧光标记的替代物的分子印迹聚合物和供分析的样品；
(b)将分子印迹聚合物与样品接触一段时间以形成样品-聚合物混合物；
(c)分离该样品-聚合物混合物以提供接触样品；以及
(d)通过观察该接触样品中荧光的存在来定性检测该接触样品中目标分子的存在，或通过使用荧光分光计测量该接触样品中的荧光来定量测定该接触样品中目标分子的浓度。
MIB和荧光替代物的使用在许多情况下都可以是完全可用的，因为该方法的灵敏度已可达到十亿分之几级。例如，当目标分子是土臭素时，所选择的MIP可具有60至80ppb的检测限，而当目标分子是2-甲基异冰片时，所选择的MIP可具有40至60ppb的检测限。
为了进一步改进检测能力，可以在方法中并入预浓缩步骤。例如，在检测方法的步骤(b)之前，可以对样品进行预浓缩过程，该过程包括以下步骤：
(i)用预浓缩材料接触样品以捕获至少目标分子；
(ii)随后从预浓缩材料中释放目标分子以提供随后在检测方法的步骤(b)至(d)中使用的预浓缩的样品。
可以用来捕获目标分子并然后释放它的任何材料都可用作预浓缩材料。例如，预浓缩材料可以是反相材料(例如C16-C18反相材料)，或者它可以是没有如上所述的荧光替代物分子的MIP。当在该方法中使用预浓缩步骤时，得到的检测限可降低大于一个数量级，例如检测限可以为万亿分之几级(ppt)。在其中目标分子是土臭素的本发明的实施方式中，所选择的MIP在有预浓缩步骤时可具有的检测限为约20ppt。在其他实施方式中，当目标分子是2-甲基异冰片时，所选择的MIP在有预浓缩步骤时可具有的检测限为约14ppt。
在下面的实施例中提供了有和没有预浓缩步骤的检测方法的其他细节。
如上所述，可以形成包括本文制成的MIP的装置。这样的装置可用于定性和/或定量地检测待分析样品中的目标分子，其中，该装置包括：
预浓缩部，用于接收样品并在预浓缩材料上捕获至少目标分子；
预浓缩样品部，用于从预浓缩部接收预浓缩的样品；和
检测部，接收预浓缩的样品并定性地和/或定量地检测目标分子，其中：
检测部包括含有如上所述的荧光替代分子的分子印迹聚合物。
预浓缩材料可为如上文所定义的。装置可以为单个统一的结构，也可以是一套部件。
现将描述体现本发明的某些方面的非限制性实施例。
实施例
材料和方法
顺式-十氢-1-萘酚、1-溴代金刚烷、甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酰胺(MAD)、甲基丙烯酸甲酯(MMA)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯(TRIM)、(±)土臭素(GSM)标准品和2-甲基异冰片(2-MIB)标准品、7-氨基-4-甲基-3-香豆素基乙酸和环己醇购自Sigma-Aldrich(美国)，以及2,2-偶氮异丁腈(AIBN)购自SinopharmChemical Reagent Co.Ltd.(新加坡)。盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺(EDC.HCl)和二异丙基乙胺从Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.(TCI)获得。N,N-二甲基氨基吡啶从Alfa Aeser获得。使用Innovative Technology Pure-Solv溶剂净化系统获得无水DMF。所有溶剂均为HPLC级且购自Sigma Aldrich(美国)，且不经进一步纯化而使用。
在Merck预涂覆的硅胶板上进行薄层色谱(TLC)。在UV光下或通过用KMnO4溶液染色来使薄层色谱可视化。除非另有说明，否则化合物是在使用Merck硅胶60(230-400目)的柱上通过闪蒸色谱纯化的。在与Shimadzu LCMS-2020质谱仪联用的Shimadzu Nexera-X2HPLC系统上记录质谱。在以CDCl3或DMSO-d6作为溶剂的Bruker光谱仪上，以400MHz用于1H且以100MHz用于13C，记录NMR谱。化学位移以ppm给出，使用质子溶剂残留信号(CDCl3:δ＝7.26；DMSO-d6:δ＝2.50)作为1H NMR谱中的参考。溶剂的氘耦合信号用作13C NMR中的参考(CDCl3:δ＝77.0；DMSO-d6:δ＝39.5)。使用以下缩写来描述信号：s＝单重态，d＝双重态，t＝三重态，m＝多重态，br＝宽信号。
使用Agilent 7890A GC与5979C惰性MSD进行GC-MS分析。GC柱是Agilent DB5-MS(30m x 0.25mm x 0.25μM)。在不分流模式下以1mL min-1的流速使用氦作为载气。GSM的GC程序如下：80℃持续1min，5℃min-1至100℃，15℃min-1至280℃。2-MIB的GC程序如下：40℃持续3min，10℃min-1至160℃，20℃min-1至280℃，保持2min。在扫描或选择性离子监测(SIM)模式下操作MS。在从50至800amu的扫描模式下进行采集。对于SIM模式，使用电子电离(电子加速电压：70V)。以下目标m/z比值用于定量，其他m/z比值用于分析物确认：MIB：95(目标离子)，107，108，135。荧光测量在Cary Eclipse荧光分光光度计(AgilentTechnologies)上进行。
实施例1
使用所选择的替代模板合成MIP-GSMS和MIP-MIBS
替代模板选择
虽然GSM和2-MIB均可商购获得，但这两种化合物都非常昂贵，以至于不能在它们各自的MIP的合成中作为模板使用。当需要大量的这些化合物来合成大规模应用的MIP时，这是不实际的。因此，使用基于形状的筛选工具针对形状查询(GSM和2-MIB)来对Maybridge、ChemBridge和Asinex数据库进行筛选，其中形状相似度搜索方法根据其形状以及其原子类型来识别相似的化合物。所有计算均使用
使用GSM替代模板合成的MIP被命名为MIP-GSMS，而使用2-MIB替代模板合成的MIP被命名为MIP-MIBS。
MIP-GSMS和MIP-MIBS的合成
通过改变并优化反应物的组成，诸如不同的功能单体、交联剂和模板-功能和单体-交联剂摩尔比例，从而合成MIP-GSMS AND MIP-MIBS的组合库。在这些研究中，对制备聚合物的功能单体(FM)的选择是甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酰胺(MAM)或甲基丙烯酸甲酯(MMA)，而交联剂(CL)是二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)或三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯(TRIM)。酸性功能单体MAA的羧酸官能团被认为具有优异的氢键供体-受体能力，其可以参与与模板(即顺式-十氢-1-萘酚)的氢键相互作用。
通常，在100-mL圆底烧瓶中将模板和功能单体溶解于乙腈中，然后加入交联剂和30mg的引发剂AIBN。在超声发生器浴中对混合物进行超声处理，直到获得澄清的溶液。将该混合物保持在0℃下10min，用温和的氮气流吹扫并密封在氮气气氛下。将烧瓶保持在油浴中，温和搅拌。在1h的时间段内温度从室温升高至60℃，并然后在该温度下保持恒定24h。聚合之后，通过离心收集聚合物颗粒。在索氏(Soxhlet)提取器中使用甲醇:乙酸(9:1v/v)洗涤MIP，以从其聚合物基体中除去模板。对MIP进行洗涤，直至使用GC-MS没有检测到模板的进一步解吸。然后用氯仿清洗MIP三次。使用顺式-十氢-1-萘酚或1-溴代金刚烷作为替代模板，在不同的摩尔比例下，对功能单体和交联剂的不同组合重复合成方案。
样品标签的缩写如下：分子印迹聚合物-GSM或2-MIB替代物/功能单体/交联剂(条件编号)，例如MIP-GSMS/MAA/TRIM1。
使用上述相同的条件在没有替代模板的情况下来合成非印迹聚合物(NIP)。在聚合之后，通过离心收集NIP颗粒，并用氯仿洗涤以去除未反应的前体。最后，在热风烘箱中于70℃下干燥所有聚合物，并储存在室温下进行进一步实验和表征。
表1列出了使用顺式-十氢-1-萘酚(3)作为替代模板的不同MIP-GSMS和相应的NIP的组合制备参数。
表2列出了使用1-溴代金刚烷(4)作为替代模板的不同MIP-MIBS和相应的NIP的制备。
表1.MIP-GSMS和相应的NIP的组合制备。
a合成了各种微球聚合物。MIP-分子印迹聚合物；NIP-非分子印迹聚合物；T：模板；FM：功能单体；CL：交联剂；MAA-甲基丙烯酸；MAD-甲基丙烯酰胺；MMA-甲基丙烯酸甲酯；EGDMA-二甲基丙烯酸乙二醇酯；TRIM-三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯。
表2.MIP-MIBS和相应的NIP的组合制备。
实施例2：确定MIP-GSMS和MIP-MIBS的结合效率和结合能力
用下文给出的方法，一式三份分批进行MIP与GSM和2-MIB的结合实验，以研究MIP在水溶液中的识别性能。
动力学研究以确定最佳温育时间
通过将15mg的MIP-GSMS/MAA/TRIM2与1.37mmol L-1的GSM或15mg的MIP-MIBS/MAA/EDGMA2与1.37mmol L-1的2-MIB溶液平衡30min至最长达10h的固定时间段，来研究接触时间。对混合物进行离心，并使用GC-MS分析上清液的GSM或2-MIB。计算MIP与GSM或2-MIB的结合能力，并确定最优温育时间段。观察到，MIP-GSMS/MAA/TRIM2和MIP-MIBS/MAA/EDGMA2两者在1h后都达到了结合平衡(分别为图3a和图3b)。因此，确定最佳结合持续时间为1h。
结合能力研究
由标准溶液制备1.37mmol L-1GSM或2-MIB溶液。将每种标准溶液的1mL等分量与15mg聚合物混合，并摇晃1h。然后将混合物离心，并使用GC-MS分析上清液的GSM或2-MIB。
使用式(1)计算MIP和NIP的结合能力Q(μmol g-1)：
Q＝[(C初始-C最终)xV溶液]/W(1)
其中，C初始和C最终分别是GSM溶液的初始浓度和最终浓度。V溶液是GSM溶液的体积，且W是聚合物的重量。
MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2的吸附等温线表明，前者与相应的NIP相比对GSM具有更高的结合能力。实验最大吸附能力分别计算为，MIP-GSMS/MAA/TRIM2为11.6μmol g-1，相应的NIP为5.7μmol g-1。这意味着分子识别位点是在聚合过程中由模板在MIP-GSMS上生成的，因此允许MIP-GSMS与GSM特异性结合。
确定最佳性能的MIP
基于其对各自的分析物和/或替代物的结合效率以及结合能力来选择最佳MIP-GSMS和MIP-MIBS。为了建立MIP-GSMS和MIP-MIBS对各自的分析物和/或替代物的结合效率(QMIP/QNIP)，确定了在相同温育条件下MIP-GSMS的结合能力与NIP的结合能力之比。
图4a-c示出了替代分子(顺式-十氢-1-萘酚)的整个聚合物库的结合效率(QMIP/QNIP)。如图4a-c所示，许多MIPS表现出对替代物从2至3的合理的结合效率(完整的结合效率范围为约1.1至2.8)。这些MIP-GSMS/MAA/TRIM2(模板：FM:CL＝1:4:4，其中MAA是FM且TRIM是CL)中最佳的被认为是该最初筛选中最有前景的，并被选择用于进一步分析。
为了进一步确认MIP-GSMS/MAA/TRIM2的选择确实是正确的，再次运行上述方案，这次使用土臭素而不是替代分子。正如预期的，如图5a-c中所示，对土臭素的结合效率低于对替代分子的结合效率(完整的结合效率范围为0.9至2.15)，但这些结果表明，MIP-GSMS/MAA/TRIM2仍然是所得聚合物中的最佳的。最重要的是，该最佳聚合物是基于对目标分子而不是替代分子具有最高结合效率而选择的。
还获得了MIPs-MIB与作为分析物的2-MIB(目标物)的结合能力和结合效率。相对于相应的NIP测量MIPs-MIB结合效率(QMIP/QNIP)，范围为2.2至4.0。这表明了2-MIB在MIPs-MIB的印迹位点上的选择性结合。因此，MIP-MIBS/MAA/EGDMA2(T:FM:CL＝1:4:10)被选为最佳MIP，由于其与2-MIB的较高的结合能力(18.9μmol g-1)和结合效率(即4)(图6a和b)。
实施例3：使用场发射扫描电子显微镜(FESEM)表征MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2
将聚合物样品涂上一层薄金膜，然后在5.0kV下通过FESEM(JEOL JSM-6700F)对它们进行分析。MIP-GSMS/MAA/TRIM2在不同放大倍数下的形态如图7a-c所示。与NIP-MAA/TRIM2的形态相比(图7d)，MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2两者均表现为均匀的球形颗粒。此外，MIP-GSMS/MAA/TRIM2的尺寸与NIP-MAA/TRIM2的尺寸几乎一样，其为直径2μm。
实施例4：使用傅里叶变换红外(FTIR)光谱表征MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2
为了进一步表征MIP-GSMS，对MIP-GSMS/MAA/TRIM2和相应的NIP-MAA/TRIM2的FT-IR光谱进行了比较，如图8所示。使用FT-IR光谱仪(IR-Affinity-1,Shimadzu)记录聚合物的FT-IR光谱。将样品用无水KBr研磨，并以KBr小球的形式进行分析。由平均45次扫描获得每个光谱，并在4000和400cm-1之间记录。
移除模板前后的MIP-GSMS/MAA/TRIM2的FT-IR光谱分别在图8a和b中示出。可以在从其基体中移除模板之前的MIP-GSMS/MAA/TRIM2的FT-IR光谱中观察到由于MAA的–OH伸缩振动产生的在3580cm-1处的宽带(图8a)，而在移除模板之后观察到在3610cm-1处的–OH伸缩振动(图8b)。在模板移除之前出现在较低振动频率处的宽带似乎表明模板顺式-十氢-1-萘酚可能通过氢键与聚合物的官能团结合。在移除MIP-GSMS/MAA/TRIM2中的模板之后，该带移动到更高的值(在3610cm-1处)(图8b)。图8c中3612cm-1处的峰值对应于NIP-MAA/TRIM2中MAA的-OH伸缩。对于NIP-MAA/TRIM2，由于其基体中不存在模板，因此没有观察到-OH伸缩的振动频率向较低波数移动。
在移除模板前后的MIP的光谱中以及在NIP的光谱中观察到的其他重要的带为：羰基伸缩(1739cm-1)、–C–O伸缩(1161cm-1)和由于聚合物网络中的甲基基团的对称与非对称C-H伸缩(在2978cm-1、1473cm-1、1392cm-1和975cm-1处的峰)。MIP和NIP主干中的相似性是由于交联剂TRIM的并入。
实施例5：通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法对MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2进行形态学表征
通过Brunauer–Emmett–Teller(BET)方法对微晶粒状ASAP-2020分析表面积、总孔体积和平均孔径。在分析之前，将样品在100℃下脱气4h。
BET表面积表征表明，MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2的表面积分别为110.34m2 g-1和86.22m2 g-1。这些结果表明，分子印迹分子显著改善了表面积。此外，观察到与NIP相比，MIP具有更大的孔体积和孔表面积。MIP和NIP两者均表现出均匀的微孔，平均直径分别为2.78nm和2.50nm，且孔体积分别被估计为3.39m3 g-1和2.82m3 g-1。
为了确定聚合物在水中的溶胀程度，在微管中将50mg干燥聚合物悬浮于1.5mL蒸馏水中并剧烈混合2min，然后平衡5h。在过滤掉多余的溶剂之后测量湿样品的最终重量。重复该程序三次，并使用下式计算百分比溶胀率：
溶胀(％)＝(Ws-Wd)/Wd×100 (2)
其中Wd＝聚合物重量Ws＝溶胀聚合物重量
MIP-GSMS/MAA/TRIM2和NIP-MAA/TRIM2在水中的百分比溶胀率分别为5％和6％。这种溶胀能力表明了MIP中的适度交联，这有利于与GSM结合。
如所认识到的，溶胀率也可以根据聚合物的初始和最终体积来测量。考虑到这一点，MIP-MAATRIM2(模板:FM:CL＝1:4:4)和NIP-MAATRIM’s(FM:CL＝1:1)在水中具有的溶胀率(按体积计)分别为73％和83％。这通过以下公式计算：
体积溶胀率(％)＝干聚合物的体积/溶胀聚合物的体积×100
MIP聚合物基体的溶胀可以改变印迹空腔的形状，并从而改变MIPs-GSM的结合能力和性能。然而，MIPs-GSM的中度溶胀对土臭素提取方案是有利的。
实施例6：使用MIP-GSMS/MAA/TRIM2和MIP-MIBS/MAA/EGDMA2的交叉选择性研究
通过评估MIP-GSMS/MAA/TRIM2和MIP-MIBS/MAA/EGDMA2对GSM和MIB的交叉选择性，来评价印迹方法的保真度。如图9a所示，MIP-GSMS/MAA/TRIM2对GSM表现出比2-MIB更高的特异性结合能力，在其结合能力方面，相对于MIB，对GSM的选择性因子为3.9。高选择性是由于存在具有对GSM有特异性的尺寸、形状和立体化学的模板印迹空腔。当使用MIP-MIBS/MAA/EGDMA2时，获得相对于GSM的对MIB选择性因子为4.3(图9b)。这些研究表明，模板印迹方法确实可以基于所使用的不同模板来区分两个不同的有机化合物。
实施例7：使用真实土臭素作为模板合成MIP-GSM
作为比较研究，使用真实GSM作为模板的MIP-GSM通过与实施例1中概述的相同的方案合成。在这种情况下，功能单体是MAA，且交叉剂是TRIM。GSM、功能单体和交联剂的摩尔比保持在1:4:4，与使用GSM替代物作为模板的摩尔比相同。与使用GSM替代物合成的MIP-GSMS/MAA/TRIM2相比，这种MIP-GSM/MAA/TRIM实现了更高的选择性吸附和结合效率。MIP-GSM/MAA/TRIM的结合能力为17.5μmol g-1，而MIP-GSMS/MAA/TRIM2的结合能力为11.6μmolg-1。虽然在大规模范围内使用GSM作为模板是不可行的，但本研究表明，当使用实际分析物作为模板来合成MIP时，可以进一步提高MIP对GSM的结合效率。
实施例8：使用MIP-GSMS/MAA/TRIM2和荧光标记6检测GSM
使用MIP检测感兴趣的分析物背后的构思如图1所示。在从合成的MIP中移除模板之后，可以添加分析物类似物的荧光标记来与空腔结合。在存在分析物的情况下，荧光标记则被分析物从空腔中取代。在这种方法中，标记的类似物应是比分析物本身更弱的结合物，因此，不应该存在由标记的类似物引起的任何干扰。溶液中荧光标记的量可以使用荧光光谱法来定量，且荧光强度与样品中分析物的量直接相关。
2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸十氢萘-1-基酯(6)的合成
使用上述原理，首先通过将荧光分子7-氨基-4-甲基-3-香豆酸(5)与顺式-十氢-1-萘酚(3)缀合，来合成GSM类似物的荧光标记(图10a)。
将DIEA(84mg，0.65mmol)加入到酸5(100mg，0.43mmol)、顺式-十氢-1-萘酚(3)(80mg，0.52mmol)、EDC.HCl(125mg,0.65mol)和DMAP(5mg，0.043mmol)在DMF(3mL)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物16h。用水(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(3×10mL)萃取水层。将合并的有机相用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将残余物通过快速色谱法(PE/EtOAc，7:3)纯化以得到缀合物6(40.9mg，26％)为白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39(d,J＝8.0Hz,1H),6.57(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),6.54(d,J＝2.4Hz,1H),4.81(dt,J＝11.6,5.2Hz,1H),4.11(br s,2H),3.55(s,2H),2.32(s,3H),1.96-2.01(m,1H),1.15-1.79(m,15H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.1,162.1,154.4,149.7,149.2,125.9,115.0,112.0,111.8,101.1,39.9,35.5,33.1,31.5,26.0,25.9,21.4,15.2；ESI-MS:(m/z)370.1calcd for C22H27NO4[M+H]+，计算值370.2。
MIP-GSMS/MAA/TRIM2与6的结合能力和对GSM的检测限
测量了MIP-GSMS/MAA/TRIM2对标记的类似物6的结合能力，并发现与GSM相比，6是比较弱的结合物(图10b)。
通常，使用乙腈作为溶剂制备1.37mmol L-1的GSM或标记6溶液。然后，将制备好的溶液(1mL)加入到15mg的MIP-GSMS/MAA/TRIM2中，并混合1h。然后将混合物离心，并使用GC-MS对上清液进行分析。使用实施例2中的式(1)计算MIP和NIP的结合能力Q(μmol g-1)。
为了通过荧光光谱法进行定量，将MIP-GSMS/MAA/TRIM2与标记6溶液的混合物离心，并提取上清液用于通过荧光光谱仪来定量荧光强度。使用激发波长为350nm的UV灯观察有荧光的可视化相片。
在最初的研究中，对GSM的检测限(LOD)被确定为80ppb(十亿分之几)，其提供关于检测灵敏度的信息。从重复研究中，发现在没有预浓缩的情况下，LOD为0.38μM(69μg L-1)。基于3σ/s计算LOD，其中σ是空白测量的标准偏差，且s是校准曲线的斜率。被取代的荧光标记6的量与水样中GSM的浓度的关系如图10c所示。此外，在空白和GSM样品之间存在明显的、可见的荧光差异，如图10d和e所示。
实施例9：使用MIP-MIBS/MAA/EGDMA2和荧光标记8检测2-MIB
2-(7-氨基-4-甲基-2-氧亚基-2H-苯并吡喃-3-基)乙酸环己基酯(8)的合成
通过将7-氨基-4-甲基-3-香豆酸(5)与环己醇(7)(其是2-MIB的部分结构)缀合来合成针对MIP-MIBS的荧光标记8。除了使用环己醇代替顺式-十氢-1-萘酚之外，合成条件与6的合成条件类似(参见实施例8)(图11a)。在反应完成之后，将粗残余物通过快速色谱法(PE/EtOAc，3:2至1:1)纯化以得到缀合物8(20.5mg，15％)为白色固体。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.47(d,J＝8.8Hz,1H),6.58(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),6.41(d,J＝2.0Hz,1H),6.07(s,2H),4.65-4.69(m,1H),3.26(s,2H),2.27(s,3H),1.73-1.769m,2H),1.60-1.64(m,2H),1.23-1.42(m,6H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.8,161.5,154.0,152.5,149.8,126.4,112.4,111.4,109.0,98.4,72.2,32.7,31.0,24.8,23.0,14.8；ESI-MS:(m/z)316.1calcd for C18H21NO4[M+H]+，计算值316.2。
8的结合能力和对2-MIB的检测限
通过实施例8中所述的方法测定在乙腈中MIP-MIBS/MAA/EDGMA2对标记8和2-MIB的结合能力。在1mL乙腈中聚合物对荧光标记8的结合能力被确定为9.2μmol/g，而在1mL乙腈中对2-MIB的结合能力为21.4μmol/g。
在最初的研究中，确定检测2-MIB的LOD为60ppb(十亿分之几)。通过重复研究并使用实施例8中概述的类似方法，确定在没有预浓缩的情况下检测MIB的LOD为0.29μM(48μgL-1)。被取代的荧光标记8的量与水样中2-MIB的浓度的关系如图11b所示。
实施例10。在水中存在胺污染物的情况下MIP-GSMS/MAA/TRIM2对GSM的选择性
在MIP合成中使用MAA作为单体的一个担忧是可能由于水样中可能存在的胺的相互作用而出现假阳性。因此，进行了MIP与GSM和普通胺在河流/水库水中的竞争性再结合试验。选择了1-萘胺，因为据报道它是河流水中的重要污染物(M.Akyuz and S.Ata,J.Chromatogr.A.,2006,1129,88-94)。
分别测定了MIP-GSMS/MAA/TRIM2对水样中1.37mmol/L的浓度的GSM和1-萘胺的结合能力。如图12所示，得到对1-萘胺的结合能力为4.8μmol g-1，其远低于得到的对GSM的结合能力。
此外，还在存在1-萘胺的情况下评估了MIP-GSMS/MAA/TRIM2对GSM的竞争性再结合能力测试，每种物质的浓度相同，均为1.37mmol/L。结果发现，在胺的存在下，观察到的MIP-GSMS/MAA/TRIM2对GSM的结合能力存在微小变化(约7％)。这表明MIP-GSMS/MAA/TRIM2对GSM具有相对于胺很高的选择性。
实施例11：检测来自水库的现场样品中的GSM
通过固相萃取法(SPE)预浓缩含有GSM的水样
为了检测现场水样中的GSM和MIB，需要引入包括固相萃取(SPE)的预浓缩步骤(图13a)。通常，首先将样品穿过吸收剂，该吸附剂捕获目标分析物和分析物样品中少量的其他物质(一种或多种)。然后用合适的介质洗脱吸收剂以从吸收剂中提取分析物，并最后得到较高浓度的分析物以及也被捕获的少量其他物质(一种或多种)。然而，这些其他物质的干扰并不会影响对目标分子的检测，如图14所示。
具体地，在SPE柱(12mL，填充有2g的MIP-GSMS/MAA/TRIM2)上对2L有10ng L-1GSM的现场水进行预浓缩。首先通过以每秒一滴的速率使12mL甲醇然后12mL去离子水经过该柱来对该柱进行预处理。之后，以4mL/min的速率使样品溶液经过该柱，并通过通空气10min来干燥该柱。然后，以1mL/min的速率，使用12mL甲醇人工洗脱与吸附剂结合的分析物。然后，使用旋转蒸发器将洗脱液的体积减少至0.5mL。通过GC-MS测定预浓缩之后GSM的浓度，并使用下式计算富集因子：
富集因子＝C最终/C最初，
其中，C最初为预浓缩之前现场样品中GSM的浓度，且C最终为预浓缩之后现场样品中GSM的浓度。
GSM水样(各2L)浓度为25ppt、250ppt、2.5ppb、25ppb和50ppb。在Strata C18-ESPE柱(12mL，2g，Strata，Phenomenex，美国)上对这些样品溶液进行SPE程序。优化程序的各种分析参数(例如水样的浓度)、洗脱条件(例如洗脱液的体积、流速)和吸附剂的选择及其吸附能力。结果，这给出用SPE然后旋转蒸发器的3230的富集因子和85％的高回收率。使用此SPE，GSM的LOD可被降低至20ppt。选择C18二氧化硅(12mL，2g，Strata，Phenomenex，美国)作为吸附剂，由于其可商购且易于应用。此外，C18柱回收率高、洗脱容易且吸附能力强。
为了改善吸附剂对GSM或2-MIB的选择性和吸附，改为使用MIP-GSMS/MAA/TRIM2或MIP-MIBS/MAA/EGDMA2作为SPE吸附剂。通过遵循与上述相同的程序，与C18柱的相比，对GSM/MIB的结合效率(MIP/NIP)和结合选择性分别提高至2.6和3.2。使用MIP吸附剂，富集因子可高达3490。
使用来自集水区水库的水样通过荧光标记的MIP-GSMS/MAA/TRIM2检测GSM
为了验证可以用来自水库的水样进行预浓缩步骤和检测系统，将1L的现场样品(水库水)使用2g的MIP-GSMS/MAA/TRIM2作为吸附剂预浓缩，并随后用甲醇洗脱以得到1mL的最终体积。使用GC-MS分析浓缩的样品的组成，且该水样中的一些主要成分被鉴定为2-(2-丁氧基乙氧基)乙烷-1-醇和2,4,7,9-四甲基癸-5-炔-4,7-二醇(图13b)。
然后，将15mg的有结合的荧光标记化合物6的MIP-GSMS/MAA/TRIM2分别与含有10ng L-1GSM的1mL未处理的现场水和1mL浓缩的现场水温育。温育之后，将样品通过孔径为0.22μm的针筒式滤器过滤，以在检测之前移除MIP。替代地，可以在提取上清液进行分析之前，通过离心分离样品。两种样品的荧光强度没有视觉上可观察到的差异，且这一点通过荧光光谱分析进一步得到了证实(图14a和b)。这些结果表明，水污染物的存在并没有从MIP中取代荧光标记，且因此没有造成假阳性结果。当预浓缩的水样掺有80μg L-1GSM时，观察到了荧光，且其通过荧光光谱分析进一步得到证实。从被取代的荧光标记的MIP-GSM中获得的荧光的量被确定为0.00034μmol/g，且该结果与图10c中示出的检测结果相当。这些结果表明可以在水样中检测到80μg L-1的GSM，且水污染物的存在不会影响该结果。
