滤纸片干血斑的测序文库及其构建方法
技术领域
本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种滤纸片干血斑的测序文库及其构建方法。
背景技术
滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried%20blood%20spots，DBS)，有很好的生物稳定性和安全性，便于储存和运输，特别适用于发展中国家边远地区的样本采集、储存和运输。
目前，用于二代测序基因检测的样本主要来自受检者的口腔细胞、唾液以及外周血，但是这些方法在标本采集、保存和运输过程中不可避免的会遇到一些难题。同时，受生物危险品运输限制，全血需要专人冷链运输。特别是当筛查范围扩大到偏远、医疗地区，对于检测者采集、保存和运输带来了困难。此外，由于新生儿的总血容量一般为250ml-350ml，如果按照常规要求采集外周血(5ml)对新生儿来说无疑是非常危险的，并且口腔细胞以及唾液很难从婴儿口腔内获取，导致了样本来源稀缺。目前，对于滤纸片干血斑以其很好的生物稳定性和安全性被广泛使用，但是其主要应用于串联质谱或者对单一的遗传病进行基因检测，目前少有基于液相捕获技术的二代测序采用滤纸片干血斑进行多种遗传病基因检测的方法。
目前的滤纸片干血斑通常用来对艾滋病病毒I型DNA进行检测，以解决HIV-1感染者全血样本采集、运输和储存过程中存在的实际困难。其仅涉及一般DNA的检测，对DNA的浓度和纯度要求均较低，只要能够进行一般的PCR即可。具体操作为：对滤纸片干血斑进行DNA提取，针对HIV的env、gag、pol区，设计三对高度保守引物，套式PCR扩HIV-1DNA。
然而随着近年来分子水平研究的广泛开展以及高通量测序技术的迅猛发展，从外周血或组织中提取高产量、高纯度的基因组DNA进行文库构建以实现高通量测序，已经成为一种很重要且比较普遍的实验手段。鉴于高通量测序文库构建对DNA量的要求，对于不同来源的DNA的提取方法和提取质量也提出了相应的要求。
尽管自1869年人类首次发现核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)起，核酸的提取方法就一直在进行改进中，比如对各种实验材料进行优选和改进：柠檬酸钠、RNase、SDS、硫氰酸胍等先后用于核酸提取。现今核酸提取方法中仍有一些传统的方法，比如CTAB法、Trizol法、氯化锂法等。也有一些新兴的方法比如二氧化硅基质法、阴离子交换法以及纳米磁珠提取法等。不论采用何种方法，总的来讲，主要分为3个步骤：1)利用物理或化学的方法促进细胞破裂，释放核酸；2)将核酸与细胞内部的蛋白质等物质分离；3)对提取的核酸进行洗脱和富集。
虽然所有的提取方法具有相通的原理，但传统的核酸提取技术中提取步骤较为繁杂，费时长，效率低，且起始建库量至少为300ng，并且提取DNA及建库都是手工操作，提取DNA一天通量为48个样本，3天才能完成建库，增加了人为混样的风险。
而且，尽管目前也有少量针对低起始量的建库方法，主要有转座酶法建库和普通流程建库。转座酶法建库主要是利用转座酶随机切割基因组DNA，并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库，该方法是一种高效的低起始量(起始量DNA为60ng)建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点，就是其使用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰，导致打断建库失败。而普通流程采用80ng的起始量DNA进行建库时，对于滤纸片干血斑这种特殊的样本，其样本较少，DNA获取难度大，提取得到的基因组DNA少(低于或等于60ng)，因而按照目前现有的建库流程和方法，基本难以成功建库。
由此可见，针对滤纸片干血斑这一类特殊样本的DNA文库构建，现有技术中还没有相应的解决方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种滤纸片干血斑的测序文库及其构建方法，以解决现有技术中难以对滤纸片干血斑样本进行文库构建的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种滤纸片干血斑的测序文库构建方法，该构建方法包括：将滤纸片干血斑样本置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取；利用提取的DNA进行文库构建，得到测序文库。
进一步地，将滤纸片干血斑样本置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取的步骤包括：将滤纸片干血斑样本置于孔板中进行裂解；将孔板置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取。
进一步地，将滤纸片干血斑样本置于孔板中进行裂解之前，构建方法还包括：利用打孔器对滤纸片干血斑样本进行打孔，获取打孔样本；将打孔样本置于孔板中；向孔板中添加裂解液进行裂解。
进一步地，打孔器的直径为6～12mm，优选孔板为96孔板；优选裂解是在50～60℃孵育15～45min。
进一步地，将孔板置于全自动液体处理工作站的核酸提取室，并选取干血斑提取模式进行DNA提取。
进一步地，利用提取的DNA进行文库构建，得到测序文库的步骤包括：利用60～80ng提取的DNA进行文库构建，得到测序文库。
进一步地，文库构建包括：对60～80ng提取的DNA进行打断，得到片段DNA；对片段DNA进行末端修复和加A，得到修复带A片段；对修复带A片段进行接头连接，得到带接头片段；对带接头片段进行PCR扩增，得到测序文库。
进一步地，对60～80ng提取的DNA进行打断后，对打断后的DNA进行电泳凝胶纯化，得到片段DNA。
进一步地，对带接头片段进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行磁珠纯化，得到测序文库。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种滤纸片干血斑的测序文库，测序文库通过上述任一种构建方法构建而成。
应用本发明的技术方案，利用全自动液体处理工作站对滤纸片干血斑样本进行DNA提取，不仅能够实现高质量(纯度高)的DNA提取，而且能够实现针对滤纸片干血斑样本成功构建测序文库。解决了滤纸片干血斑样本低起始量建库的困难，使得此类微量样本能够利用高通量进行测序。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
由于目前现有技术中没有针对滤纸片干血斑这类特殊样本进行文库构建的方案，为弥补这一空白，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种滤纸片干血斑的测序文库构建方法，该构建方法包括：将滤纸片干血斑样本置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取；利用提取的DNA进行文库构建，得到测序文库。
利用全自动液体处理工作站对滤纸片干血斑样本进行DNA提取，不仅能够实现高质量(纯度高)的DNA提取，而且能够实现针对滤纸片干血斑样本成功构建测序文库。解决了滤纸片干血斑样本低起始量建库的困难，使得此类微量样本能够利用高通量进行测序。
具体将滤纸片干血斑样本置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取的步骤按照仪器的操作说明进行操作即可。在一种优选的实施例中，将滤纸片干血斑样本置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取的步骤包括：将滤纸片干血斑样本置于孔板中进行裂解；将孔板置于全自动液体处理工作站中进行DNA提取。
将滤纸片干血斑样本置于孔板中的方式可以有多种，可以直接将干血斑剪成小碎块儿置于孔板中，也可以采用其他能够使孔板容纳干血斑的方式。在一种优选的实施例中，将滤纸片干血斑样本置于孔板中进行裂解之前，该构建方法还包括：利用打孔器对滤纸片干血斑样本进行打孔，获取打孔样本；将打孔样本置于孔板中；向孔板中添加裂解液进行裂解。打孔器进行取样可以使得取样面积大小均匀，如果干血斑的载样量相同的话，取样面积携带的样本量也相对均匀。
上述打孔器取样时，具体选取的打孔器的直径大小可根据需要进行选择。在一种优选的实施例中，打孔器的直径为6～12mm，优选孔板为96孔板；优选裂解是在50～60℃孵育15～45min。裂解温度和时间可根据样本具体情况不同而进行适当调整。
在一种优选的实施例中，将孔板置于全自动液体处理工作站的核酸提取室，并选取干血斑提取模式进行DNA提取。
在利用全自动液体处理工作站将滤纸片干血斑提取出高质量高纯度的DNA后，具体的建库步骤可采用常规的文库构建方法。在一种优选的实施例中，利用提取的DNA进行文库构建，得到测序文库的步骤包括：利用60～80ng提取的DNA进行文库构建，得到测序文库。
在一种优选的实施例中，文库构建包括：对60～80ng提取的DNA进行打断，得到片段DNA；对片段DNA进行末端修复和加A，得到修复带A片段；对修复带A片段进行接头连接，得到带接头片段；对带接头片段进行PCR扩增，得到测序文库。
在一种优选的实施例中，对60～80ng提取的DNA进行打断后，对打断后的DNA进行电泳凝胶纯化，得到片段DNA。
在一种优选的实施例中，对带接头片段进行PCR扩增，对PCR扩增的产物进行磁珠纯化，得到测序文库。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种滤纸片干血斑的测序文库，该测序文库通过上述任一种构建方法构建而成。
下面将结合具体实施例进行详细解释本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例如无特殊说明，试剂或耗材都来购于天根生化科技有限公司。
以全外周血滤纸片干血斑(DBS)为实验材料进行测序文库构建，具体步骤如下：
1、DNA提取
1)用打孔器将6mm直径大小的DBS打入1.5ml的离心管中，用烧灼和酒精擦拭的方法消毒打孔器头部，避免交叉污染。
2)向装有血片的离心管中加入500ul裂解液，56℃孵育0.5小时；
3)将经过孵育处理的液体加入96孔板中，所有标本加入完成后，放入核酸提取室，选取干血斑提取模式，仪器自动完成提取。
2、60ng起始量建库
1)取人的标准品，稀释100倍，振荡混匀，用Qbuit精确测定浓度。
2)按测定的浓度计算60ng所需要添加的体积。
3)使用Bioruptor仪器超声打断样本。
4)DNA打断后进行检测，将样本、配制好的marker进行点胶、电泳检测，电泳条带在处于200bp-300bp位置时，进行纯化；
5)末端修复和加A，反应体系如下表1。
表1:
修复加A的反应程序如下：
37℃30min，
72℃30min，
4℃%20Hold。
6)接头连接：反应结束后将样本放置于冰上，反应体系如下表2所示：
表2：
反应程序如下：
20℃30min。
7)将连接后的产物进行M270链霉亲和素磁珠纯化，纯化后的样本进行PCR扩增，反应程序如下：
8)将扩增后的产物使用M270链霉亲和素磁珠纯化：
9)文库定量:检测所建文库的浓度为5ng/μL(文库浓度应≥5ng/μL，否则文库视为构建失败)。
10)文库杂交：取出杂交试剂和封闭试剂，配制成杂交反应体系，浓缩DNA文库，加入杂交缓冲溶液和探针(此处的探针为检测表3所示的55个基因的1282条探针的组合物，该55个基因在UCSC覆盖的CDS区域长度为101001bp，目标区域覆盖度为101184bp，探针委托IDT公司设计合成，合成后统计共1282条，全部覆盖了捕获区域)，过夜杂交。
表3：
11)捕获和洗脱杂交的文库：用M270链霉亲和素磁珠捕获杂交文库，并进行PCR扩增，使其不断富集。
12)扩增后的DNA文库用M270链霉亲和素磁珠纯化：
13)用Qubit准确定量文库浓度，稀释文库，送库检。
将扩增后的产物使用1倍M270链霉亲和素磁珠纯化，将得到的纯化产物使用0.7～0.85倍M270链霉亲和素磁珠进行片段分选，即在0.7倍磁珠纯化时留上清，补加至0.85倍M270链霉亲和素磁珠，纯化得到文库大小在300-600bp。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明将建库起始量降低到60ng，同时应用大型自动液体工作站自动完成样本核酸提取工作，与传统手工操作相比具有几下优势：1)无交叉污染；2)自动化系统在每次工作中，操作者只需要做好安装工作、布置孔板，提取整个过程不需要人为参与，省时省力；3)提取样本通量大，为384份/天，且提取的核酸质量纯度较好。本发明通过优化建库流程和方法，解决了低起始量建库的困难，使得微量样本能够利用高通量进行测序。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
