一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用。
背景技术
咖啡牛奶斑又称咖啡斑，颜色类似咖啡与牛奶混合后的颜色，是较为常见的色素沉着性皮肤病，10％～20％正常人群可在出生时见到一个或多个牛奶咖啡斑。牛奶咖啡斑色泽自浅褐色、棕褐色至暗褐色，但每一片的颜色相同且十分均匀，深浅不受日晒的影响，大小自数毫米至数十厘米，边界清晰，表面皮肤质地完全正常。
多发性牛奶咖啡斑是指皮肤出现多处牛奶咖啡斑表现。牛奶咖啡斑的出现、增多或变大，均可能提示存在伴有多系统临床表现的遗传性疾病，如神经纤维瘤病、Albright综合征、结节性硬化病、Waston综合征及共济失调毛细血管扩张症等，这些疾病可以统称为多发性牛奶咖啡斑相关疾病。一方面，多发性牛奶咖啡斑可能是严重遗传疾病的早期皮肤表现，另一方面，多发性牛奶咖啡斑又可能仅为单纯的皮损表现。由于多发性牛奶咖啡斑相关疾病在儿童期早期多无其它特征临床表现或症状不典型，医生无法准确地做出临床病因诊断，例如神经纤维瘤病，仅当患者出现特征性的皮下结节以及影像学表现时才能临床确诊，这导致当新生儿或婴儿出现多发性牛奶咖啡斑时，家长都十分的恐慌。因此，快速、准确地筛查致病基因对分析多发性牛奶咖啡斑的遗传学病因，对患者做出精确诊断、预后判断、家庭咨询计划制定的必须前提条件。
目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对多发性牛奶咖啡斑相关疾病的众多基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。下一代测序(next generation sequencing，NGS)也称高通量测序，与传统的Sanger测序技术相比具有高通量等优势。由于多发性牛奶咖啡斑在正常人群中也有较高的比例出现，因此结合已有遗传学、临床医学知识，筛选多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因，并有针对性的检测，可以有效地提高检测速度，并进一步的降低检测费用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库。
本发明的目的之二在于提供所述DNA文库的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病的DNA文库，该文库包括51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因，其中，所述51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因如下表所示：
本发明提供的DNA文库覆盖包括神经纤维瘤病、Albright综合征、结节性硬化病、Waston综合征及共济失调毛细血管扩张症多种常见的以多发性牛奶咖啡斑为主要临床表现的遗传病，包含51个多发性牛奶咖啡斑致病相关基因。这51个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)。这51个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。
本发明根据51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻±20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确多发性牛奶咖啡斑的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。
一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病的致病基因。
所述应用包括下列步骤：
1)收集多发性牛奶咖啡斑患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本，如受检者的唾液、毛发或口腔黏膜等。
2)提取样本的基因组DNA，优选的，提取方法包括DNA提取试剂盒或各种手工提取方法；
3)对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：
a)将基因组DNA进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；
b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；
c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；
d)将连接产物利用通用引物进行PCR扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
e)使用针对上述51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；
f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；
j)获得目标区域捕获文库。
4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；
5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪；
6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。
一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA文库。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.多发性牛奶咖啡斑既可以出现在正常人，也可以是严重遗传疾病的早期皮肤表现。因此确定多发性牛奶咖啡斑背后的遗传学病因，对于牛奶咖啡斑表现者不仅有很大的临床价值，对于其心理压力的缓解同样重要。由于牛奶咖啡斑相关遗传病的种类繁多，临床表现多样，更存在遗传异质性和表现度差异，通过对致病基因的筛查和分析有助于对临床疑似病例和非典型表现型做出准确的诊断。本发明旨在探索多发性牛奶咖啡斑相关疾病的遗传学病因，不仅能帮助大部分多发性牛奶咖啡斑表现者排除遗传病可能，更能帮助多发性牛奶咖啡斑相关遗传病患者早期临床确诊，对预后判断、产前诊断和为今后的基因治疗奠定基础。
2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。因神经纤维瘤、范可尼贫血等多发性牛奶咖啡斑相关疾病对个人健康的危害巨大，基因检测可为患者本人及其家属提供更多的遗传信息。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保将来下一胎的健康。多发性牛奶咖啡斑相关疾病有常染色显性、常染色体隐性多种遗传模式，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现仅有皮肤表现的幼儿致病基因携带者也有助于更早制定家庭医疗和康复计划。
3.本申请的DNA文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国多发性牛奶咖啡斑临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用ClinGen等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，从众多的多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因中选择的51个基因。所选基因兼顾了全面性、准确性和科学性。本发明优选51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因，设计探针池，建立针对51个多发性牛奶咖啡斑致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的51个基因检测区域能够检测包括遗传性色素异常、Cowden综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Noonan综合征、LEOPARD综合征、范可尼贫血、McCune-Albright综合征、心面皮综合征、神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、结节性硬化症等多种多发性牛奶咖啡斑相关疾病，对多发性牛奶咖啡斑的病因诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
4.本发明采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的51个相关致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在多发性牛奶咖啡斑相关疾病的基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的多发性牛奶咖啡斑基因检测技术。
5.综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对多发性牛奶咖啡斑具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1是实施例1中对先证者样本的51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因建立目标区域靶向DNA文库的质控信息。
图2是实施例1中对先证者样本的51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息。
图3是实施例1中对先证者样本的51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的目标区域进行测序的数据量信息。
图4是实施例1中所述的多发性牛奶咖啡斑家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。
具体实施方式
本发明提供了一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Hiseq平台，并进行数据分析，通过确定多发性牛奶咖啡斑表现者是否携带致病基因，判断其是否为多发性牛奶咖啡斑相关疾病患者。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
本实施例是采用Illumina公司的Hiseq测序平台对受检人外周血基因组DNA进行检测，具体实施步骤如下：
1.样本来源
来自中国福建省的皮肤多发性牛奶咖啡斑表现者家系，其中先证者为5岁女性，于出生后发现皮肤有浅褐色咖啡斑，主要分布在躯干，共有7处，大小不一，不凸出与皮肤(直径2-7mm)；4岁时于腋窝处发现雀斑样黄色斑点。无骨骼畸形，无神经系统异常，智力正常，无大小便等其它异常。父母及其他亲属无上述皮肤临床表现。该患者的家系谱如图4所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。获得所有参与者的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10mL(EDTA抗凝处理)，用于检测。
2.标本基因组DNA的提取：
按照商家提供的说明书操作，使用Magen公司的基因组DNA提取试剂盒(HiPureBlood&Tissue DNA Kit)从外周血样本中提取基因组DNA，使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。
3.基因组扩增文库的建立：
按照商家提供的说明书操作，使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：
1)基因组DNA片段化反应，反应体系如下：
反应条件：37℃反应12min。
2)末端修复和3'末端加A反应，反应体系如下：
反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温。
3)接头链接反应，反应体系如下：
反应条件：20℃反应20min。
4)第一次PCR扩增反应，反应体系如下：
反应条件：98℃45s；(98℃15s，60℃30s，72℃30s)×6cycles；72℃1min；12℃保存
5)DNA定量和质检：
使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。
4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向DNA文库：
按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用IGT公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的51个多发性牛奶咖啡斑致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：
1)探针杂交：
将步骤3获得PCR产物5μg与5μL Cot-1human DNA混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5×Ampure XP beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：
杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜。
2)使用80μL链霉亲和素标记的磁珠(M-270Streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μL的1×Bead WashBuffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用20μL NF H2O重悬。
3)对捕获到的目标序列进行第二次PCR扩增反应，反应体系如下：
反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)×7cycles；72℃1min；4℃保存。
5)PCR产物定量和质检：
使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。
5.测序数据的生信分析和变异解读：
使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定51个多发性牛奶咖啡斑相关致病基因区域的变异。利用RemoveRun Common Variants和Remove Global Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等，并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT、PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，分析得到对多发性牛奶咖啡斑相关疾病诊断有意义的突变位点。
6.测序结果说明及分析
通过本发明中提供的一种检测诊断多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因的DNA文库，一次性对3个受检者51个多发性牛奶咖啡斑相关疾病致病基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得DNA文库大小主要分布在200-800bp，平均长度为328bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。DNA文库包括51个基因的编码区长度为149193bp，非编码区长度为21771bp，共计170964bp。其中编码区的10×覆盖度为99.61％，20×覆盖度为99.36％(如图2)。总共获得230822个片段读长数据(Total Reads)，匹配率(Aligned)为90.25％(如图3)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，多发性牛奶咖啡斑相关疾病(神经纤维瘤病1型)的致病基因变异，如下表所示：
经过本实施例，在先证者的外周血基因组DNA中检出NF1基因的NM_000267.3:c.5560_5563del(p.Asn1854Phefs*5)杂合致病变异，即编码区第5560_5563位碱基缺失，该变异导致编码蛋白的氨基酸从第1854位发生移码突变(天冬酰胺变成苯丙氨酸)，在移码突变4个新氨基酸后，翻译终止。该变异可能引起蛋白截短或激活无义介导的mRNA降解，从而影响NF1基因编码蛋白产物的功能。该变异在先证者父母外周血DNA中未检出，提示该变异为新发变异。该新发致病变异提示先证者患有神经纤维瘤病，为临床诊断提供了依据。先证者在进行基因检测时仅有多发性牛奶咖啡斑表现，但根据文献报道仍有50％的几率出现学习障碍，并由一定概率出现神经系统、皮肤、眼部、心肌受累临床表现。因此，建议患者定期到上述专科随访，并可尝试定期进行MRI筛查。同时，由于先证者父母均未检出致病变异，如有生育计划，后代再发神经纤维瘤病的风险不高(<1％)，但仍不能排除该变异存在于先证者父母生殖细胞中(生殖细胞嵌合体)，因此可根据个人意愿在再次妊娠时进行羊水细胞的变异位点验证。(如图4)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
