IVF-ET相关微小RNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及IVF-ET相关微小RNA及其应用。
背景技术
自辅助生殖技术在建立的几十年里获得了长足的进步。在人类不孕不育的治疗中，辅助生殖技术体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET，in vitro fertilization and embryotransfer)是目前的重要手段之一。因为人类正常妊娠的建立和维持需要经历胚胎植入、胎盘形成、胚胎发育等一系列重要环节，受到多层面不同系统的协同调控，其中任一环节发生障碍均会导致流产等不良妊娠结局。在IVF-ET周期中，胚胎移植后的临床妊娠率仅为40％，而妊娠后的流产率高达18％。由于辅助生殖技术中的胚胎植入率较低，所以筛选一些可靠的并且能用于预测IVF-ET妊娠结局的标志分子对于临床IVF-ET以及对不孕不育早期干预和治疗能起到重要的指导作用。
miRNA是一类在真核生物体内广泛表达的非编码RNA分子，多由21～25个核苷酸组成，通过与靶基因转录产物mRNA的3′-UTR互补结合，抑制其翻译过程而调控靶基因的表达。目前人类成熟miRNAs的统计量已达2578个(miRBase20.0)，调控着近50％的蛋白编码基因。
miRNA的表达具有组织特异性及时序性(即只在特定的组织中和发育阶段表达)，这就意味着其在细胞生长和发育过程中起多种调节作用，包括：细胞增殖、凋亡、代谢、维持干细胞多能性及分化等。已有研究发现，miRNA可能参与调控胚胎的发育和选择、子宫内膜容受性的形成、母胎界面的血管重铸和免疫功能调节等，而上述的这些生物过程均与人妊娠的建立有密切关系，虽然其确切的作用机制有待阐明，但miRNA作为鉴别IVF-ET胚胎移植后早期妊娠结局的的候选分子，其在临床应用上具有广阔的前景。
对miRNAs的研究之所以引起许多人的关注，一个原因是由于前面说过的miRNAs的生物学功能广泛，另外一个原因，就是其潜在的应用价值，比如疾病的生物学标志分子的筛选。在生物学标志分子的筛选中，最理想的是无创伤性的手段，比如血液。1997年，胎儿DNA首次从母体血液中被发现，基于这个发现，才有了后来的无创新产前诊断技术。在2008年，胎盘来源的miRNA在母体血浆中被检测到。这些研究基础，都为miRNA作为产前诊断以及疾病生物标志分子的开发奠定了基础。
然而，目前人们对IVF-ET胚胎移植后早期妊娠结局的鉴别以及预测方法知之甚少。
因此，本领域迫切需要开发能够用于IVF-ET胚胎移植后早期妊娠结局的鉴别和预测的生物标志分子。
发明内容
本发明的目的就是提供IVF-ET相关微小RNA及其应用。
在本发明的第一方面，提供了miRNA或其检测试剂的用途，用于制备判断体外受精-胚胎移植(IVF-ET，in vitro fertilization and embryo transfer)妊娠结局的试剂盒，所述miRNA选自下组：hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p、或其组合作为阳性对照。
在另一优选例中，所述的判断包括预先判断。
在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括血液或组织。
在另一优选例中，所述的组织包括绒毛组织或蜕膜组织。
在另一优选例中，所述miRNA选自下组：
(a)SEQ ID NO.:1-6任一所示的序列；
(b)与SEQ ID NO.:1-6任一所示序列互补的6个互补序列中的任一序列；或
(c)来自(a)或(b)的组合，且来自(a)的序列与来自(b)的互补序列互相不为互补。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。
在本发明的第二方面，提供了一种miRNA芯片，所述的miRNA芯片包括：
固相载体；以及
有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针含有：
互补结合区；和/或
与固相载体相连的连接区。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p或其检测试剂，和说明书，所述的说明书中注明所述的试剂盒(a)用于判断体外受精-胚胎移植的妊娠结局和/或(b)判断体外受精-胚胎移植的灵敏度和/或特异性。
在另一优选例中，所述的使用说明书注明以下内容：
当所测定所述样本(如血浆)中，hsa-miR-27a-3p的表达量Ea与对照基因表达量Ea0之比Ea/Ea0≥1.2，较佳地，≥1.5更佳地，≥1.6(如1.691)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的妊娠结局良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-27a-3p。
当所测定所述样本(如血清)中，对照基因表达量Ea0与hsa-miR-27a-3p的表达量Ea之比Ea0/Ea≥1.0，较佳地，≥1.2更佳地，≥1.3(如1.305)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的灵敏度和/或特异性良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-27a-3p。
当所测定所述样本(如血浆)中，hsa-miR-23a-3p的表达量Ea与对照基因表达量Ea0之比Ea/Ea0≥1.2，较佳地，≥1.5更佳地，≥1.7(如1.704)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的妊娠结局良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-23a-3p。
当所测定所述样本(如血浆)中，hsa-miR-100-5p的表达量Ea与对照基因表达量Ea0之比Ea/Ea0≥1.0，较佳地，≥1.2更佳地，≥1.4(如1.462)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的妊娠结局良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-100-5p。
当所测定所述样本(如血浆)中，hsa-miR-127-3p的表达量Ea与对照基因表达量Ea0之比Ea/Ea0≥1.2，较佳地，≥1.4更佳地，≥1.6(如1.620)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的妊娠结局良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-127-3p。
当所测定所述样本(如血清)中，对照基因表达量Ea0与hsa-miR-100-5p的表达量Ea之比Ea0/Ea≥1.0，较佳地，≥1.2更佳地，≥1.4(如1.462)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的灵敏度和/或特异性良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-100-5p。
当所测定所述样本(如血清)中，对照基因表达量Ea0与hsa-miR-486-5p的表达量Ea之比Ea0/Ea≥1.0，较佳地，≥1.1更佳地，≥1.2(如1.284)，则提示该检测体外受精-胚胎移植样本的灵敏度和/或特异性良好，所述对照基因是失败组的hsa-miR-486-5p。
在本发明的第四方面，提供了一种体外非诊断性的判断体外受精-胚胎移植妊娠结局的方法，包括步骤：
测定所述样本中，hsa-miR-27a-3p的表达量Ea，并将其与对照基因表达量Ea0进行比较，若Ea/Ea0≥1.2，较佳地，≥1.5，更佳地，≥1.6(如1.691)，则提示该检测样本的体外受精-胚胎移植的妊娠结局良好，对照基因是失败组的hsa-miR-27a-3p。
在另一优选例中，包括步骤：
测定所述样本中，hsa-miR-127-3p的表达量Eb，并将其与对照基因表达量Eb0进行比较，若Eb/Eb0≥1.2，较佳地，≥1.5，更佳地，≥1.6(如1.620)，则提示该检测样本的体外受精-胚胎移植的妊娠结局良好。
在另一优选例中，所述样本包括血浆。
在本发明的第五方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA选自：
(i)miR-23a～27a～24-2、miR-433/127、miR-125b1/let-7a-2/miR-100、hsa-miR-486或miR-23a～27a～24-2家族的miRNA，或
(ii)与miR-23a～27a～24-2、miR-433/127、、miR-125b1/let-7a-2/miR-100、hsa-miR-486、miR-23a～27a～24-2家族的miRNA互补的miRNA。
在另一优选例中，所述miRNA选自下组：hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p、或其组合。
在另一优选例中，所述miRNA选自下组：
(a)SEQ ID NO.:1-6任一所示的序列；
(b)与SEQ ID NO.:1-6任一所示序列互补的6个互补序列中的任一序列；或
(c)来自(a)或(b)的组合，且来自(a)的序列与来自(b)的互补序列互相不为互补。
在本发明的第六方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第五方面所述的miRNA。
在本发明的第七方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第五方面所述的miRNA。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在本发明的第八方面，提供了一种判断检测对象体外受精-胚胎移植妊娠结局的方法，包括步骤：
测定所述检测对象的样本中hsa-miR-27a-3p的表达量Ea，并将其与对照基因表达量Ea0进行比较，若Ea/Ea0≥1.2，较佳地，≥1.5，更佳地，≥1.6(如1.691)，则提示所述检测对象体外受精-胚胎移植的妊娠结局良好。
在另一优选例中，包括步骤：
测定所述检测对象的样本中hsa-miR-127-3p的表达量Eb，并将其与对照基因表达量Eb0进行比较，若Eb/Eb0≥1.2，较佳地，≥1.5，更佳地，≥1.6(如1.620)，则提示所述检测对象体外受精-胚胎移植的妊娠结局良好。
在另一优选例中，所述测定是通过real-time PCR实现。
在另一优选例中，所述样本包括血浆。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了IVF-ET成功妊娠和妊娠失败组病人血浆中差异表达的miRNAs。
图2显示了IVF-ET成功妊娠和妊娠失败组病人血清中差异表达的miRNAs。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一类微小RNA可以用于血液鉴别与IVF-ET早期妊娠结局。实验表明，在接受IVF-ET胚胎移植的病人中，在成功妊娠IVF-ET病人中，胚胎移植之前的血浆中hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-23a-3p等微小RNA的表达水平与胚胎移植失败组病人相比有显著差异；而在血清中hsa-miR-27a-3p和hsa-miR-100-5p的表达水平与对照组病人相比有显著差异(hsa-miR-27a-3p在妊娠失败组的表达是妊娠成功组的1.305倍，hsa-miR-100-5p在妊娠成功组的表达是失败组的1.261倍)。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
miRNA及其前体
本发明提供了一类新的从人中发现的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一种RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA具有如SEQ ID NO:1(uucacaguggcuaaguuccgc)所示的序列。为了提高miRNA的稳定性或其它性质，还可在所述的miRNA的至少一端加上至少一个保护性碱基，如“TT”等。
反义寡核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可以设计出了其反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的miRNA的表达。如本文所用，“反义寡核苷酸(antisense-oligonucleotides，AS-Ons或ASO)”又称为“反义核苷酸”，是指长度约为18-26nt(更特别的约19-22nt)的DNA分子或RNA分子或其类似物。
在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。核酸锁(locked nucleicacid，LNA)通常是指通过一个亚甲基桥将核糖的2’氧原子和4’碳原子连接起来的修饰技术。LNA能延长miRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度。基于核酸链骨架的修饰技术发展出的反义药物在可溶性，抗核酸酶降解等方面大有改善，且易于大量合成。寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，例如将脱氧核苷酸链硫代修饰为硫代脱氧核苷酸链。该方法是将DNA骨架上的磷酸键的氧原子用硫原子替代，可抵抗核酸酶降解。应理解，任何能够保持所述反义寡核苷酸的大部分或全部活性的修饰都包含在本发明中。
作为本发明的优选方式，对反义寡核苷酸进行核酸锁修饰；更佳地还进行硫代修饰。
将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人体内后，它们能够明显下调相关miRNA的表达。
多核苷酸构建物
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向
式I
式I中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：
式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
芯片
microRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种microRNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种microRNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的microRNA的转录水平进行检测。
利用本发明所述的miRNA序列，还可以制备相应的miRNA芯片，进而研究其表达谱以及miRNAs的调节方式。
在另一方面，本发明还提供一种用于分析miRNA表达谱的芯片，所述的芯片可用于区分自然反复流产样本和正常样本。
本发明的所述的miRNA芯片包括固相载体以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括SEQ ID NO:1所示的序列。
具体地，可根据本发明所述的miRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science,1997；278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。
另一方面，本发明还提供了一种通过miRNA芯片检测人组织中miRNA表达谱的方法，包括步骤：
(1)提供分离自人组织的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；
(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；
(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的miRNA的表达谱。
从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。
更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在10-100之间(小片段RNA)。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获miRNA的准确性。本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。
对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。
将上述的RNA与miRNA芯片进行杂交时，可以先将miRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明所述的RNA与miRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。
然后根据标记信号在miRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。
检测试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测miRNA的表达谱；或用于诊断体外受精-胚胎移植的妊娠结局，优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。
本发明的主要优点包括：
1)本发明首次发现hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-23a-3p可用于鉴别诊断体外受精-胚胎移植的妊娠结局。
2)本发明提供本领域急需能够用于IVF-ET胚胎移植后早期妊娠结局的鉴别和预测的生物标志分子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1.
血清标志物的筛选
hsa-miR-23a-3p表达水平的实时荧光定量PCR检测
实验试剂及其配制
(1)RT引物：由锐博生物公司提供(RN：R10031.2)，按说明书进行操作，冻干粉配用Rnase-free的水配制成5μM的引物储存液后，分装存储；使用前，稀释10倍(45μl水+5μl储存液)，配制成500nM的RT引物工作液。
(2)RT酶：为TOYOBOe公司产品。
(3)10×PCR Buffer：为AB公司产品。
(4)实时荧光定量PCR仪：美国ABI公司的7300Real-Time PCR System
血浆和血清RNA的提取
(1)血浆分离：采集全血样品，于EDTA抗凝管中。轻柔颠倒混匀后使用4℃低温离心机，1600×g离心10min，离心后将上清(血浆)分装到多个的离心管中在吸取血浆过程中注意不要吸到中间层的白细胞；
(2)血清分离：采集到的全血样本，转入RNA酶free的离心管中，低温静置，待血液凝固，血清析出(约30-60min)，3000rpm/min离心15min，血液分离成上下两层，小心吸取上层，转移到新的离心管中保存，注意不要吸到下层的血细胞等其他杂质，收集好的的血清标记后，立即转移到-80℃冰箱保存；
(3)将预先收集的血浆和血清-80℃冰箱取出，RNA的抽提按照QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma提取试剂盒中提供的说明书进行。
(4)每200μl血浆或者血清加入1ml TRIZOL/ml，混匀后，室温放置5min；
(5)按TRIZOL/ml加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置2-3min；
(6)，4℃，12000rpm离心15min；
(7)收集上清，按TRIZOL/ml加入500μl异丙醇，室温放置10min；
(8)4℃，12000rpm离心10min；弃上清，RNA沉于管底；
(9)按TRIZOL/ml加入1ml 75％乙醇，Vortex悬浮沉淀；
(10)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；
(11)室温干燥5-10min；
(12)用DEPC水溶解RNA(12μl体积)；
(13)测OD值，对RNA进行定量。
RT反应
引物浓度按说明书设定，按下表配制RT反应溶液，所有操作均在冰浴中进行：
混匀后瞬时离心，70℃中放置10分钟后在冰浴中放置2分钟，在上述引物反应液中，按下表加入试剂，建立50ul的RT反应体系：
为了避免加样误差，实际操作中，将上述反应体系中相同的部分合并混匀后再分别上样，其中设立一个阴性对照反应管(不加RT酶)。RT反应条件：42℃，60分钟；70℃，10分钟。
PCR反应
用ddH2O将RT产物稀释5倍，即：50μl RT产物+200μl ddH2O；按下表建立10μl的PCR反应体系：
同理，为了减少避免加样误差，实际操作中同样先准备混合物后再分别加入不同引物。设立1个对照反应(NE)，不加RT产物(用H2O代替)，将PCR反应液加到384孔PCR板(ABI公司)，设3个复孔。按下表设置热循环参数：
数据处理
ΔCt＝(目的基因Ct-内参Ct)的平均值；ΔΔCt＝(待测样品中目的基因ΔCt-参照样品中目的基因ΔCt)的平均值，若无参照样品则默认参照样品ΔCt＝10进行计算，本实验以CDA/VA样品为参照样品，相对样品初始模板量＝(2-ΔΔCt)的平均值。
结果：
结果发现与妊娠失败组相比，妊娠成功组血浆中miR-23a-3p的的表达增高，其比值为1.704；妊娠成功组血浆中miR-27a-3p的表达增高，与妊娠失败组的比值为1.691；妊娠成功组血浆中miR-100-5p的表达增高，与妊娠失败组的比值为1.462；妊娠成功组血浆中miR-127-3p的表达增高，与妊娠失败组的比值为1.620。以上这些结果说明血浆中miR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-100-5p，miR-127-3p的表达水平可用于判断IVF-ET妊娠结局。
实施例2.
为验证上述方法的灵敏度和特异性，我们在血清中检测了几种miRNA的表达，验证其在IVF-ET病人血清中的表达和变化。结果发现miR-100-5p在妊娠成功组的表达升高，与妊娠失败组的比值为1.462；miR-486-5p在妊娠成功组的表达升高，与妊娠失败组的比值为1.284；miR-27a-3p在妊娠失败组的表达升高，与妊娠成功组的比值为1.305。以上验证实验说明我们上述方法的灵敏度和特异性良好。
综上所述，发明人建立了一种，发明人利用IVF-ET外周血血浆和血清检测hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-23a-3p和has-miR-486-5p的表达，建立了一种可用于预测IVF-ET妊娠结局的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市计划生育科学研究所
武汉大学人民医院
<120> IVF-ET相关微小RNA及其应用
<130> P2018-0089
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
uucacagugg cuaaguuccg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
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<210> 3
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
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<210> 4
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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aacccguaga uccgaacuug ug 22
<210> 5
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<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
uccuguacug agcugccccg ag 22
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
aucacauugc cagggauuuc c 21
