一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学及高分子材料技术领域，更具体的说是涉及一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料及其制备方法。
背景技术
因外伤、感染及肿瘤等原因导致骨缺损的患者越来越多，虽然人体骨组织具有一定的自愈能力，但在大段骨缺损、并发感染或肿瘤条件下，其自愈能力大大减低，如何提高骨缺损修复的效率是人们关注的热点。目前，常见的骨填充材料包括：自体骨、异体骨及人工骨。在患者身体健康程度较好的情况下，传统的自体骨、异体骨植入能够较好的提高骨修复的速度，但当患者存在骨组织周围存在感染或肿瘤的情况时，传统的骨缺损治疗效果会大大降低。同时，自体骨来源有限，异体骨又易造成外源污染的风险，因此应用受到限制。
理想的骨替代材料应具有良好的生物相容性、强度较好、多孔及成骨诱导性，且应保证来源易得，成本低。目前，市场上的人工骨替代材料各有特点。它们虽具有生物相容性，能在一定程度上满足临床需求，但它们的骨诱导性较差，并缺少对复杂疾病条件骨再生的促进。
因此，如何提供一种能够同时具有对抗并发症及加速骨修复的多种功能的骨填充材料是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料及其制备方法，该制备方法制备出的骨填充材料能对抗并发症及加速骨修复，并且具有良好生物相容性，能够搭载黑磷纳米片和纳米氧化镁，为细胞生长提供平台，同时壳聚糖具有一定程度的抗菌性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料，材料包括：黑磷纳米片、纳米氧化镁、聚乙烯醇、壳聚糖。
黑磷纳米片是一种新兴的二维材料，具有良好的生物可降解性、生物相容性及光热效应，其降解产物为磷酸盐，能够与钙离子结合形成钙磷复合物，是骨组织重要无机组成成分；同时，在近红外光的刺激下，黑磷纳米片具有良好的光热转换效率，能够通过光热效应杀伤细菌。
纳米氧化镁可降解可形成碱性微环境，可以促进磷酸盐与钙离子的结合，加快钙磷沉积；同时，降解缓释出的镁离子能够促进血管新生及骨组织再生。
聚乙烯醇和壳聚糖都是具有良好生物相容性的聚合物，通过冻融的物理交联方法可以制备水凝胶用于搭载上述两种纳米材料，能够很好地促进骨组织再生。同时，壳聚糖是一种具有抗菌性的聚合物，在一定程度上能够抑制细菌生长。
优选地，所述黑磷纳米片、所述纳米氧化镁、所述聚乙烯醇、所述壳聚糖的质量比为0.05～0.2:1～5:5～10:0.5～1。
优选地，所述纳米氧化镁的粒径为50nm，该粒径的纳米氧化镁更易在凝胶中分散。
优选地，所述壳聚糖的脱乙酰度≥95％，该脱乙酰度在弱酸中的溶解性更好。
上述所述一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按上述所述骨填充材料称取材料；
(2)将所述聚乙烯醇和所述壳聚糖分别溶解后混合制成水凝胶；
(3)将所述纳米氧化镁、所述黑磷纳米片依次加入所述水凝胶中，搅拌、超声分散均匀后，得到混合物；
(4)将所述混合物倒入模具中重复冻融过程3～5次，最后放入冷冻干燥器中冻干，即得所述骨填充材料。
本发明凝胶采用冻融的物理交联方法，反复冻融促进水凝胶交联，并且不引入额外的化学交联剂，不影响材料的生物相容性，且冻干形成的多孔结构也有利于组织长入。
优选地，其特征在于，步骤(2)所述水凝胶的制备方法为：
S1：将所述聚乙烯醇加入去离子水中搅拌溶解，得到聚乙烯醇溶液；
S2：将所述壳聚糖加入1％醋酸溶液中搅拌溶解，得到壳聚糖溶液；
S3：将所述聚乙烯醇溶液冷却至室温后和所述壳聚糖溶液按体积比1:1～2混合，搅拌1～1.5h，即得所述水凝胶。
优选地，S1步骤中所述聚乙烯醇溶液的质量分数为10～20wt％；S2步骤中所述壳聚糖溶液的质量分数为1～2wt％。
优选地，S1步骤所述搅拌溶解的条件为：在90～95℃条件下转速为400～500rpm，加快聚乙烯醇在水中溶解；S2步骤所述搅拌溶解的条件为：在室温下转速为400～500rpm，方便壳聚糖溶解；S3步骤所述搅拌的条件为：在室温下转速为600～800rpm，使聚乙烯醇和壳聚糖充分混匀。
优选地，步骤(3)所述黑磷纳米片加入时先制备成黑磷纳米片溶液。
优选地，所述黑磷纳米片溶液的制备方法为：
1)将黑磷晶体溶于N-甲基吡咯烷酮中，配比为1mg：1mL；并在冰浴条件下超声8～10h，得混合液1；
2)将混合液1在3000～4000rpm下离心15～20min，弃沉淀，取上清液；
3)将所述上清液在8000～12000rpm下离心15～20min，取沉淀，用去离子水重悬所述沉淀，在8000～12000rpm下再次离心15～20min，重复重悬离心1-2次；
4)将所得沉淀重悬于适量去离子水中，即得所述黑磷纳米片溶液，将其浓度调整为1mg/mL。
上述制备方法中采用超声可以获得黑磷纳米片，冰浴条件下可防止制备的黑磷纳米片氧化；重复离心、重悬的操作可将有机溶剂充分去除，避免有机溶剂对细胞产生毒副作用。
优选地，步骤(3)所述搅拌的转速为600～800rpm，所述搅拌的时间为0.5～1h；所述超声的时间为2～3min，功率为1200W，开/关时间：2s/2s。
优选地，步骤(4)所述的冻融步骤为：首先在-25～-20℃条件下冷冻20～22h，然后置于室温中解冻2～4h。
优选地，步骤(4)所述的冻干条件为：温度≤-80℃，时间≥24h。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料及其制备方法，具有以下技术效果：
(1)PVA-CS水凝胶具有良好生物相容性，能够搭载BPNs和MgO，为细胞生长提供平台，同时CS具有一定程度的抗菌性；
(2)BPNs降解产生的磷酸盐能够捕获钙离子，为新生骨形成提供无机成分。同时，具有光热效应能够增强抗菌性能；
(3)添加的镁降解形成的碱性微环境，促进钙磷结合。同时，产生的镁离子能够促进新生骨形成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1骨填充材料的表面形貌图；
图2是本发明实施例1骨填充材料在SBF浸泡溶液pH值变化图；
图3是本发明实施例1骨填充材料ALP活性分析图；
图4是本发明实施例1骨填充材料24h抗菌性能图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种含黑磷纳米片的多功能骨填充材料的制备方法，包括以下步骤：
1、黑磷纳米片溶液的制备
(1)按黑磷晶片与N-甲基吡咯烷酮比例1mg：1mL，称取50mg黑磷(BP)晶体溶于50mL有机溶剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，在冰浴条件下超声8h，超声功率：400W，得混合溶液1；将混合液1在3000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液；
(2)将步骤(1)中的上清液在10000rpm下离心20min后，取沉淀，用去离子水重悬所述沉淀，在10000rpm下再次离心20min，重复重悬离心1-2次；
(3)将步骤(2)所得的沉淀重悬于去离子水中，配为1mg/mL的黑磷纳米片(BPNs)溶液。
2、制备水凝胶
(1)将10g聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)加入100mL去离子水中，使质量分数为10wt％，在90℃，500rpm下磁力搅拌至完全溶解；将2g脱乙酰度≥95％的壳聚糖(chitosan,CS)加入100mL醋酸溶液(1v/v％)中，使质量分数为2wt％，室温下，500rpm磁力搅拌至完全溶解；
(2)取PVA溶液(10g)冷却至室温后和CS溶液(10g)混合，800rpm磁力搅拌1h。
3、制备负载BPNs和MgO的水凝胶
(1)称取0.2g粒径为50nm的纳米氧化镁(nano-MgO)，加入上述混合溶液中，使nano-MgO的质量分数为1wt％；而后加入BPNs(4mg)，使BPNs的含量在200μg/g；
(2)将步骤(1)中的混合物在800rpm下磁力搅拌1h混匀，而后在探头超声(1200W，开/关：2s/2s)下振荡2min，使nano-MgO及BPNs分散均匀，而后将混合物倒入定制的模具中；
(3)将步骤(2)中含混合物的模具放入-20℃冰箱中冷冻20h，而后取出放于室温中解冻4h，重复冻融过程4次使凝胶充分交联，即得到骨填充材料；
(4)将步骤(3)中的骨填充材料置于冷冻干燥器中冻干备用。将制备的骨填充材料置于显微镜下观察，从图1可以看出得到的骨填充材料具有多孔粗糙结构，将有利于细胞长入。
实施例2
1、黑磷纳米片溶液的制备
(1)按黑磷晶片与N-甲基吡咯烷酮比例1mg：1mL，称取50mg黑磷(BP)晶体溶于50mL有机溶剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，在冰浴条件下超声8h，超声功率：400W，得混合溶液1；将混合液1在3000rpm下离心15min，弃沉淀，取上清液。
(2)将步骤(1)中的上清液在8000rpm下离心15min后，取沉淀，用去离子水重悬所述沉淀，在8000rpm下再次离心15min，重复重悬离心1-2次。
(3)将步骤(2)所得的沉淀重悬于去离子水中，配为1mg/mL的黑磷纳米片(BPNs)溶液。
2、制备水凝胶
(1)将PVA(10g)加入100mL去离子水中，使质量分数为10wt％，在90℃，400rpm下磁力搅拌至完全溶解；将1g脱乙酰度≥95％的CS加入100mL醋酸溶液(1v/v％)中，使质量分数为1wt％，室温下，400rpm磁力搅拌至完全溶解；
(2)取PVA溶液(10g)冷却至室温后和CS溶液(10g)混合，600rpm磁力搅拌1h。
3、制备负载BPNs和MgO的水凝胶
(1)称取0.2g粒径为50nm的纳米氧化镁(nano-MgO)，加入上述混合溶液中，使nano-MgO的质量分数为1wt％；而后加入1mg BPNs，使BPNs的含量在50μg/g。
(2)将步骤(1)中的混合物在600rpm下磁力搅拌0.5h混匀，而后在探头超声(1200W，开/关：2s/2s)下振荡2min，使nano-MgO及BPNs分散均匀，而后将混合物倒入定制的模具中。
(3)将步骤(2)中含混合物的模具放入-20℃冰箱中冷冻20h，而后取出放于室温中解冻2h，重复冻融过程3次使凝胶充分交联，即得到骨填充材料。
实施例3
1、黑磷纳米片溶液的制备
(1)按黑磷晶片与N-甲基吡咯烷酮比例1mg：1mL，称取50mg黑磷(BP)晶体溶于50mL有机溶剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)中，在冰浴条件下超声10h，超声功率：400W，得混合溶液1；将混合液1在4000rpm下离心20min，弃沉淀，取上清液。
(2)将步骤(1)中的上清液在12000rpm下离心20min后，取沉淀，用去离子水重悬所述沉淀，在12000rpm下再次离心20min，重复重悬离心1～2次。
(3)将步骤(2)所得的沉淀重悬于去离子水中，配为1mg/mL的黑磷纳米片(BPNs)溶液。
2、制备水凝胶
(1)将PVA(30g)加入100mL去离子水中，使质量分数为30wt％，在95℃，500rpm下磁力搅拌至完全溶解；将1.5g脱乙酰度≥95％的CS加入100mL醋酸溶液(1v/v％)中，使质量分数为1.5wt％，室温下，400rpm磁力搅拌至完全溶解；
(2)取PVA溶液(10g)冷却至室温后和CS溶液(20g)混合，600rpm磁力搅拌1h。
3、制备负载BPNs和MgO的水凝胶
(1)称取1.5g粒径为50nm的纳米氧化镁(nano-MgO)，加入上述混合溶液中，使nano-MgO的质量分数为5wt％；而后加入6mg BPNs，使BPNs的含量在200μg/g。
(2)将步骤(1)中的混合物在800rpm下磁力搅拌1h混匀，而后在探头超声(1200W，开/关：2s/2s)下振荡3min，使nano-MgO及BPNs分散均匀，而后将混合物倒入定制的模具中。
(3)将步骤(2)中含混合物的模具放入-25℃冰箱中冷冻22h，而后取出放于室温中解冻4h，重复冻融过程5次使凝胶充分交联，即得到骨填充材料。
对比例
对比例中未加入纳米氧化镁，其余材料用量及制备步骤与实施例1完全相同。
应用例
检测成骨性及抗菌性能
1)将实施例1制备的骨填充材料置于模拟体液(SBF)中，放置8天，骨填充材料在SBF浸泡溶液pH值变化如图2，可以发现pH值在逐步上升，BPNs降解产生的磷酸盐能够促进钙磷沉积，为新生骨形成提供原料，并且碱性微环境能够促进上述过程。
2)将实施例1与对比例制备的骨填充材料进行兔间充质干细胞诱导成骨分化，检测碱性磷酸酶活性，结果从图3可以看出，无论第4天还是第7天，实施例1的制备的骨填充材料碱性磷酸酶活力明显高于对比例，说明含BPNs和MgO复合骨填充材料具有良好的成骨诱导能力。
3)将100μL菌液(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)滴于实施例1与对比例制备的骨填充材料的表面，并经808nm近红外光照射3min后，在37℃恒温培养箱中共培养，检测24h后的抗菌性，从图4可以看出含BPNs和MgO骨填充材料具有良好的抗菌性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
