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人工合成玉(方法工艺3篇)

2020-08-20 14:43:31

  人工合成玉1

  一种人工合成玉基料和基于该基料制备的佛光玉及其制造方法

  第一、技术领域

  本发明涉及一种人工合成玉基料及其制造方法,还涉及基于该基料制备的佛光玉及其制造方法。

  第二、背景技术

  自然界中存在的天然宝石种类很多,例如,人们早已发现红宝石、蓝宝石、纯绿柱石、玉石等,它们的共同特征是质地坚硬、透明度高、色泽艳丽。因此,被人们用来制作各种各样的装饰品。但是由于天然宝石资源有限,不能满足人们日益增长的需要,对人工合成宝石及其制备方法进行了深入广泛地研究,提出了许多合成人工宝石的方法。

  CN85103282A公开了直接从熔体中拉制预定截面形状和尺寸的杆状红宝石的润湿导模法,晶体在还原气氛和非过热状态下生成。

  CN1010971A公开了一种高折射率人造变色晶体宝石。该宝石是在含氧八面体铌酸盐中掺入稀土元素制成。在不同的光源照射下,呈现出不同的颜色。

  CN1046725A公开了一种采用同心坩埚法制备单色同心一次复合纤维,然后通过调色工艺,拉制成各种色彩的二次复合纤维,再经加热、模制、切割、研磨、抛光成各种色彩的人造猫眼宝石的制造方法。

  CN1050912A公开了一种直接从熔体中生长高掺质二氧化钛的星光宝石的方法。该方法可生产星光红宝石、星光白宝石、星光蓝宝石、星光变色宝石、星光紫宝石等。

  CN2075453U公开了一种在由玻璃、有机玻璃或塑料制作的珠体底部或首饰基座上涂覆一层永久性夜光粉制备的夜光宝石首饰。这种宝石由于是在其一侧或首饰的底座涂上夜光粉,因而发光亮度低,余辉时间短。

  CN1393580A公开了一种人工合成发光宝石及其合成方法,该方法是以含硼碱土金属铝酸盐为基质,加入稀土元素激活剂,于高温下煅烧生成由主要物相A和伴生的次要物相B组成的结晶物相的烧结体,该烧结体起始亮度高,化学结构稳定,在光停止照射后,余辉时间长。

  还有目前已有用普通玻璃滚沾发光材料的方法而制成的各种发光制品,但该方法简单,只有玻璃质感没有玉质感,发光度也较差;有用纯发光材料合成的发光宝石,但只有石质感没有玉质感;也有企业曾设立本发明相同的项目,由于技术路线不同和所用材料配方不同,研究出的产品含有放射性物质和亮度差等问题,至今无法解决。

  第三、发明内容

  本发明所要解决的技术问题第一方面在于提供一种人工合成玉基料,该人工合成玉基料无放射性,符合环保要求。

  本发明所要解决的技术问题第二方面在于提供上述人工合成玉基料的方法。

  本发明所要解决的技术问题第三方面在于提供一种基于上述人工合成玉基料制备的佛光玉。

  本发明所要解决的技术问题第四方面在于提供一种上述佛光玉的制备方法。

  作为本发明第一方面的人工合成玉基料,由以下重量百分比的原料混合、烧结而成:

  二氧化硅 10-30wt%

  钾的含氧酸盐 10-30wt%

  硼酸或硼砂 10-30wt%

  钠的含氧酸盐 1-8wt%

  碳酸钡 5-15wt%

  碳酸锶 5-15wt%

  锂的含氧酸盐 5-10wt%

  氧化锌 0.3-5wt%

  氧化铝 3-7wt%

  碳酸钙 1-8wt%

  在本发明的优选方案中,钾的含氧酸盐可以优选为碳酸钾或硝酸钾,钠的含氧酸盐可以优选为碳酸钠或硝酸钠,锂的含氧酸盐可以优选为碳酸锂或硝酸锂。

  作为本发明第二方面的一种人工合成玉基料的制备方法,是将上述比例的各原料组分混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃-1400℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  作为本发明第三方面的基于上述基料制备的佛光玉,由60-80wt%基料与20-40wt%蓄光型发光材料混合、烧结而成。

  在本发明的一个优选方案中,蓄光型发光材料可以优选硫化物系列蓄光型发光材料、铝酸盐系列蓄光型发光材料、硅酸盐系列蓄光型发光材料中的一种。

  作为本发明第四方面的一种基于上述基料制备佛光玉的方法,其首先将60-80wt%基料与20-40%蓄光型发光材料混合,置入坩埚中放入至马弗炉,在700℃-1100℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到不同形状的模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在380℃-700℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  本发明解决的技术关键是制作具有玉质感特性的人工合成玉基料和以其与发光材料的有效熔合。本发明所述的人工合成玉基料具有玉质感特性,可以代替天然玉石。本发明所述的佛光玉排斥了具有放射性物质的原料,符合环保要求,经中国计量科学研究院测定为非放射性产品。该产品经过数分钟光照后,能在黑暗中释放光辉持续发光16小时以上。

  第四、具体实施方式

  为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。

  人工合成玉基料,由以下重量百分比的原料混合、烧结而成:

  二氧化硅 10-30wt%

  钾的含氧酸盐 10-30wt%

  硼酸或硼砂 10-30wt%

  钠的含氧酸盐 1-8wt%

  碳酸钡 5-15wt%

  碳酸锶 5-15wt%

  锂的含氧酸盐 5-10wt%

  氧化锌 0.3-5wt%

  氧化铝 3-7wt%

  碳酸钙 1-8wt%

  在本具体实施方式中,钾的含氧酸盐可以优选为碳酸钾或硝酸钾,钠的含氧酸盐可以优选为碳酸钠或硝酸钠,锂的含氧酸盐可以优选为碳酸锂或硝酸锂。至于如何配比关系这对于本领域技术人员来说是不难的,只要通过试验就可以筛选出合适的比例。

  该人工合成玉基料的制备方法,是将上述比例的各原料组分混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃-1400℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。焙烧过程是在密封条件下进行的,具体的焙烧温度选择可根据各组分的配制比例进行选择,这对于本领域技术人员来说是不难的。

  基于上述基料制备的佛光玉,由60-80wt%基料与20-40%蓄光型发光材料混合、烧结而成。蓄光型发光材料可以优选硫化物系列蓄光型发光材料、铝酸盐系列蓄光型发光材料、硅酸盐系列蓄光型发光材料中的一种。这些蓄光型发光材料在市面上可以直接购买获得,在此不做详细描述。

  基料与蓄光型发光材料相互比例的变化关系着熔制温度的变化,变化的依据与蓄光型发光材料掺入量有关。如考虑成本因素,蓄光型发光材料需少掺,同时基料的配比适当向温度高的方向调整。反之蓄光型发光材料掺入多时,基料的配比适当向温度低的方向调整。

  将60-80wt%基料与20-40%蓄光型发光材料混合,置入坩埚中放入至马弗炉,在700℃-1100℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到不同形状的模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在380℃-700℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  焙烧过程是在密封条件下进行的,具体的焙烧温度选择可根据各组分的配制比例进行选择,这对于本领域技术人员来说是不难的。浇注时黏度选择要适当,黏度过高,会使浇注比较困难,黏度过底,会造成产品有缺陷。具体黏度的选择对于本领域技术人员来说也是不难选择的,只需要通过试验就可以掌握好。

  退火过程主要是减弱应力,增强强度,退火温度的选择可以根据产品的形状不同而不同。

  下面通过具体实施例来进一步描述,但下面的具体实施例不构成对本发明的限制。

  实施例1

  以100g原料制备基料为例,取二氧化硅23g、碳酸钾20g、硼酸20g、碳酸钠6g、碳酸钡8g、碳酸锶5g、硝酸锂5g、氧化锌3g、氧化铝7g、碳酸钙3g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料60g、硫化物系列蓄光型发光材料40g,置入坩埚中放入至马弗炉,在700℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在380℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  实施例2

  以100g原料制备基料为例,取二氧化硅25g、硝酸钾18g、硼酸12g、碳酸钠6g、碳酸钡8g、碳酸锶5g、硝酸锂5g、氧化锌5g、氧化铝7g、碳酸钙9g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在1200℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料80g、铝酸盐系列蓄光型发光材料20g,置入坩埚中放入至马弗炉,在1000℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在500℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  实施例3

  以100g原料制备基料为例,取二氧化硅30g、碳酸钾10g、硼砂15g、硝酸钠4g、碳酸钡8g、碳酸锶5g、硝酸锂15g、氧化锌0.5g、氧化铝7g、碳酸钙5.5g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在1200℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料70g、硅酸盐系列蓄光型发光材料30g,置入坩埚中放入至马弗炉,在1100℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在700℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  实施例4

  以100g原料制备基料为例,取二氧化硅10g、碳酸钾30g、硼砂20g、硝酸钠2g、碳酸钡5g、碳酸锶5g、碳酸锂15g、氧化锌1g、氧化铝4g、碳酸钙8g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在1200℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料65g、硅酸盐系列蓄光型发光材料35g,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在450℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  实施例5

  以100g原料制备基料为例,取二氧化硅10g、碳酸钾10g、硼砂30g、硝酸钠2g、碳酸钡14g、碳酸锶14g、碳酸锂10g、氧化锌3g、氧化铝4g、碳酸钙3g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在1200℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料65g、硅酸盐系列蓄光型发光材料35g,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在450℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  实施例6

  以制备100g基料为例,取二氧化硅20g、碳酸钾28g、硼砂22g、硝酸钠2g、碳酸钡5g、碳酸锶5g、碳酸锂10g、氧化锌1g、氧化铝4g、碳酸钙3g混合后,置入坩埚中放入至马弗炉,在1200℃温度下焙烧至熔透,熔透后自然冷却出炉,将出炉料破碎研磨过200-400目筛即可。

  取上述基料65g、硅酸盐系列蓄光型发光材料35g,置入坩埚中放入至马弗炉,在800℃温度下焙烧至熔透后出炉,浇入到夜明珠模具中,然后将模具重新放入马弗炉中,在450℃条件下恒温两小时以上,缓慢降温至室温,打开模具取出不同形状的佛光玉产品。

  以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

  人工合成玉2

  人工合成玉米耐淹基因sSub1A及其应用

  第一、技术领域

  本发明涉及基因工程技术领域,具体地说,是一种人工合成的玉米耐淹基因sSub1A及其应用。

  第二、背景技术

  玉米(zea mays L.)是世界上分布最广泛的粮食作物之一,也是一种重要的经济作物。在我国,其分布范围和种植面积都很大,是我国旱谷地区人民的主要粮食之一。但是每年由于洪涝灾害造成玉米产量损失巨大,目前玉米常规育种缺乏耐淹种质资源,育种进程相对缓慢,通过现代生物技术将抗涝基因导入玉米中培育具有抗涝的玉米新品种是减灾的重要措施。

  淹水胁迫造成缺氧环境,玉米在缺氧环境下诱导ADH基因表达变化,改变了染色体的结构,激活转录因子转录。厌氧导致翻译正常状况下蛋白质的多聚核糖体发生分离,翻译厌氧蛋白的mRNA的多聚核糖体降低,厌氧表达的Adh1转录产物与核糖体结合有效性比有氧时高。在DNA水平上,氧诱导基因的特征是在启动子区存在厌氧反应元件(ARE),在玉米ADH1、ADH2、醛缩酶和拟南芥的ADHl、LDH、PDC 的启动子区域发现了ARE元件破坏玉米或拟南芥中的这些基序(motif)导致ADH1基因在厌氧时不表达或表达量减少。ARE由GC-基序和GT—基序组成,二者对于低氧基因的诱导都很重要。Hocren等发现AtMYB2基因可以诱导Adh1基因,并证实了厌氧反应的许多基因都依赖于AtMYB2基因。唐万虎等通过对玉米Mo17和Hz32淹水胁迫发现,淹水处理4h时玉米Mo17中Adh2基因表达量最大,在淹水胁迫8h后基因Adh2表达量开始降低,而在Hz32中基因Adh2表达量稳定上升,在8h后达到最大,推测玉米的抗涝性和基因Adh2有关。

  2006年,菲律宾国际水稻研究所Mackill领导的研究小组发现含有控制水稻耐淹品性Sub1A的变异品种FR13具有超强的抗淹能力,这种品系的植株经过10-14d的没顶淹涝,待淹没状态消失后仍能恢复生长,Septiningsih等借助分子标记辅助选择,已经成功将Sub1A位点被嵌入印度一个高产籼稻品种Swarna中并成功表达。

  由于Sub1基因来源于水稻,将其直接应用到转基因玉米中具有表达量低、表达产物不稳定、耐淹效果差等缺陷,因此,对水稻Sub1基因进行改造,提供能在玉米中稳定高效表达、显著提高玉米耐涝性的基因序列是十分必要的,但是目前还未见相关报道。

  第三、发明内容

  本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列。

  本发明的再一的目的是,提供一种上述基因序列的用途。

  本发明的另一的目的是,提供一种重组载体。

  本发明的第四个目的是,提供一种遗传工程化的宿主细胞。

  本发明的第五个目的是,提供一种制备转基因植物的方法。

  为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:一种人工合成的提高玉米耐涝性的基因序列,所述的基因序列选自下列中的一种:a)由SEQ ID NO.8所示的序列构成的核苷酸序列;或b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

  为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:如上所述的基因序列在提高植物耐涝性中的应用。

  为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:一种重组载体,所述的重组载体含有如上所述的基因序列。

  为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:一种遗传工程化的宿主细胞,所述的宿主细胞:含有如上所述的重组载体;或其基因组中整合有外源的如上所述的基因序列。

  为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:一种制备转基因植物的方法,所述的方法是把如上所述的重组载体导入植物细胞、组织或器官,并筛选出整合有如上所述的基因序列的植物细胞、组织或器官。所述的植物为作物。所述的植物为禾本科植物。所述的禾本科植物选自玉米、水稻、小麦、大麦或高粱。

  本发明优点在于:本发明通过研究水稻和玉米密码子使用情况,发现两者在密码子的使用上存在很大差异,利用密码子偏好性,重新设计改造水稻Sub1基因,并人工合成了能在玉米中稳定、高效表达的sSub1基因,将该基因导入玉米中,显著提高了玉米的耐涝性,培育获得新型耐涝玉米,为提高玉米产量提供强有力的保障。

  第四、附图说明

  附图1是pMD18-T SimpleVector图谱。

  附图2是CPB载体图谱。

  附图3是sSub1和Sub1的序列比对图。

  附图4是转基因玉米淹水处理后的生长情况图。

  附图5是转基因植株叶片过氧化氢酶活性测定结果。

  附图6是转基因植株叶片相对电导率测定结果。

  附图7是转基因植株叶片CTK(细胞分裂素)含量测定结果。

  第五、具体实施方式

  下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

  一、材料

  pMD18-T SimpleVector(图谱见图1)、CPB载体(图谱见图2)购于宝生物工程(大连)有限公司;DH5α大肠杆菌感受态细胞、EH105感受态农杆菌细胞购于宝生物工程(大连)有限公司;植物基因组DNA提取试剂盒为康为世纪新型植物基因组DNA提取试剂盒;Reverse Transcription System反转录试剂盒购于promega公司;除草剂basta购于生工生物工程(上海)有限公司。

  YEP液体培养基配方为:牛肉浸膏 10 g,酵母提取液10 g,NaCl 5 g,pH 7.0,对应的固定培养基添加1.5%的琼脂;MS、1/4MS培养基购于上海鼎杰生物科技有限公司。

  二、方法和结果

  1、采用Trizol法提取水稻FR13A总RNA

  具体步骤如下:

  (1)取0.1g幼嫩的FR13A水稻叶片进行研磨,研钵须预冷;

  (2)研磨充分后,转移到1.5mL离心管中,向样品中加入2mL RNAiso Plus并完全覆盖样品(在加入RNAiso Plus时要保证组织没有融化,否则RNA易被RNase降解);

  (3)冰上静置25-30分钟;

  (4)待样品完全融化,用研杵继续研磨至裂解液呈透明状,将匀浆液转移至2个1.5mL离心管中,冰上静置5min后,在4℃环境温度下,以转速13500rpm离心7min,将上清液转移至新的1.5mL离心管中;

  (5)每1mL液体中加入200μL的氯仿,盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15s,直至溶液充分乳化,无分层相现象;

  (6)冰上静置5min,4℃,13500rpm离心15min,准备新的1.5mL离心管;

  (7)从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,上层是透明的水层,RNA溶解在此层中;

  (8)中间层为半固体状,此层中包含DNA;粉红色的有机溶剂下层,蛋白质、多糖等物质溶解在此层中;

  (9)把上层溶液小心转移至新的离心管中,大约每个离心管中能去出500μL谨慎操作,切勿吸到中间层;

  (10)加入等体积(500μL)异丙醇上下颠倒离心管,充分混匀;

  (11)冰上静置10min后,在4℃下以13500rpm转速离心10min;

  (12)可在离心后的离心管底观察到少量白色沉淀,小心去上清液;

  (13)向含有沉淀的离心管中缓慢加入1mL,-20℃预冷的75%乙醇,轻轻上下颠倒,清洗沉淀;

  (14)再次在4℃下以13500rpm离心5min,用移液枪去除上清液;

  (15)打开离心管管盖,冰上放置干燥;用30μL的RNA free ddH2O溶解沉淀;

  (16)RNA电泳检测:取2μL的RNA提取液,1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,5V/cm电泳。待两条指示剂分开1cm后将凝胶放在凝胶成像系统下观察,如果距离点样孔较劲的28S rRNA的主带的宽度和亮度是另一条18S rRNA的二倍,则表明RNA未被降解。

  2、反转录获得cDNA

  用反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录,得到cDNA。

  反转录反应体系如下:

  MgCl2, 25mM4μLReverse Transcription 10×Buffer2μLdNTP Mixture, 10mM2μLRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor0.5μLAMV Reverse Transcriptase (High Conc.)0.5μLOligo(dT)15 Primer 1μLTotal RNA2μLNuclease-Free Water8μL

  反转录反应程序:42℃,15min;95℃,5min;4℃,5min。

  3、PCR扩增Sub1A基因

  3.1 引物设计:引物设计软件为Primer Premier 5.0,引物序列如下:

  Sub1-F(SEQ ID NO.1):GCTCTAGAATGTGTGGAGGAGAAGTGATCCCCGC;

  Sub1-R(SEQ ID NO.2):CGGGATCCTCAGGCTTCCCCTGCATATGATATG,

  目的片段长度为840bp。

  3.2 PCR反应体系如下:

  10×PCR buffer5μL10mM dNTPs4μL引物Sub1-F1μL引物Sub1-R1μLTaqDNA 聚合酶0.5μLcDNA2μLddH2O35.5μL

  PCR程序如下:94 ℃预变性,5min;94 ℃变性,30 s;56℃退火,1min;72 ℃延伸,1min;72 ℃延伸,10min;其中,94 ℃变性30 s至72 ℃延伸1min共35个循环。

  3.3 检测与回收

  将PCR扩增获得的序列利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收片段。将回收的片段连入T/A克隆载体pMD18-T SimpleVector载体中,获得pT-Sub1A载体,将该载体导入DH5α感受态细胞中,筛选的阳性克隆子送去上海宝生物科技有限公司测序,测序引物为M13通用引物。Sub1A全长大小846 bp,其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

  4、根据玉米密码子优化耐淹基因Sub1

  根据玉米蛋白编码序列同义密码子的相对使用度,将基因Sub1A原始密码子优化为玉米偏好的密码子,优化时选择中高使用频率的密码子,且不改变其氨基酸序列,碱基组成统计结果:对于改造后的sSub1基因,A改造了22%,T改造39%,G改造13%, C改造17%,与Sub1的比对如图3所示,二者同源性为81.5%。改造后的sSub1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示,该序列由生工生物工程(上海)有限公司人工合成。并将该序列连入pMD18-T SimpleVector载体中,构建得到pT-sSub1A载体。

  5、植物过表达载体的构建

  将目的基因Sub1A和sSub1A分别装在CaMV35S启动子的下游,使之在CaMV35启动子和OCS终止子的调控下进行转录,具体步骤如下:

  分别用Xba I、BamH I对CPB载体和pT-Sub1A、pT-sSub1A克隆载体进行双酶切,并且回收目的片段,将目的片段连入CPB载体。

  其中,酶切体系如下:

  XbaI1μLBamHI1μL10×K buffer1.5μLDNA26.5μL反应温度和时间37℃、6h

  连接体系如下:

  片段DNA6μL载体DNA2μL10× Ligase buffer1μLT4 ligase1μL反应温度和时间4℃、过夜

  将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中感受态细胞中;提取质粒并进行检测,将阳性的克隆分别命名为CPB- Sub1A和CPB- sSub1A。

  6、转基因植株的获得

  6.1 农杆菌感受态的制备

  选用的农杆菌菌种为EH105。用接种环沾取少量EH105菌液,划线于含50mg/mL利福平的YEP固体培养基,28℃暗培养两天,活化菌种;挑取活化后的单菌落种于5ml含50mg/mL 利福平的YEP液体培养基中,28℃ 160-250rpm/min 摇床上震荡培养12-24小时,取2ml菌液转入50ml YEP培养基中扩大培养5h左右;取40mL农杆菌(OD600=0.4-0.5)转入40mL离心管中,冰上放置30min后,在4℃离心机中5000rpm/min转5min。弃去上清,重复上一步骤,因此,每管最终收集80ml菌液;弃上清,加10mL 100mmol/L预冷的CaCl2溶液,重新悬浮菌体,冰浴20min;4℃ 5000rpm/min离心5min,弃上清;加2mL含15%甘油的100mmol/L的CaCl2溶液,重新悬浮菌体后,冰浴10min;将菌液分装于1.5mL eppendorf管中,每管分装200μL,用液氮速冻菌液,-70℃保存。

  6.2 冻融法将构建的载体导入农杆菌感受态细胞中

  取2μg(约5μl)构建的CPB-Sub1A和CPB-sSub1A质粒,加入200μl EH105农杆菌感受态细胞中,冰浴5min;液氮冷冻1min后迅速置37℃水浴锅中温浴5min;加入300μl YEP液体培养基28℃ 250rpm预表达4-5h;用移液枪将菌液移至YEP固体培养基(含有50μg/L卡那霉素)中,均匀涂布于整个平板。28℃暗培养2天;取单菌落于5ml含有利福平的YEP液体培养基中培养1-2天,质粒提取试剂盒提取质粒,再转入大肠杆菌中提取质粒验证。

  6.3 农杆菌介导对玉米(郑58自交系)的转化(玉米原位转化技术):

  原位转化液的配制:1/4MS培养基中加2%蔗糖,0.05% silwet-77(表面活性剂),2mg/L 6-BA,1ng/L 2,4-D以及10mg/L乙酰丁香酮。每100ml MS中加4ml农杆菌菌液,于28℃ 250转培养24小时。

  将玉米须剪去,用5ml的注射器将菌液从玉米的下部1/3处直接注入玉米棒中,注入的量以玉米须处有菌液渗出为宜。经过两个月的生长,收获玉米粒,即为T0代种子。

  将种子晒干,播种,幼苗长到3-4叶期时用配制的0.01%除草剂basta筛选,将存活下来的幼苗移入大田生长,收获种子,即为T1代。再将T1代种下,3-4叶期除草剂筛选。

  7、转基因植株的分子检测

  7.1 转基因玉米叶片基因组DNA的提取

  取除草剂basta筛选后存活植株的叶片,用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。具体步骤为:

  取0.1g玉米叶片于液氮中研磨充分,粉末转移至1.5mL Eppendorf管中;加入400μl Buffer LP1和6μL RNase A(10mg/ml),涡旋振荡1min,室温放置10min,使其充分裂解;加入130μL Buffer LP2,涡旋振荡1min混匀;12000rpm离心5min,上清转移至新的1.5mL离心管中;加入1.5倍体积的Buffer LP3(使用前先加入无水乙醇),充分混匀;将上述液体全部加入收集管中的吸附柱中,一次加不完可以分多次加入,12000rpm离心1min,弃去收集管中废液,将吸附柱重新放回;向吸附柱中加入500μl 的Buffer GW(使用前须加无水乙醇),12000rpm离心1min,弃去收集管中废液后,再用Buffer GW洗一次;12000rpm离心2min,去除吸附柱中多余的乙醇,打开吸附柱的盖置于室温10min,以彻底晾干乙醇;将吸附柱放入一新的离心管中,在吸附柱膜正中加入100μL灭菌水,室温放置5min,12000rpm离心1min,离心管中的溶液即为基因组,于-20℃保存待用。

  7.2 PCR检测

  为验证外源载体是否重组至玉米基因组DNA中,我们选择载体中特有的基因片段设计引物,所选用的为CPB载体中的Bar基因和CaMV 35S启动子序列中的一段双重验证。扩增Bar基因的引物序列如下:

  Bar-F(SEQ ID NO.3):GCCTCGAGATGAGCCCAGAACGACG;

  Bar-R(SEQ ID NO.4):GCCTCGAGTCAGATCTCGGTGACGG,

  目的片段长度为500bp,PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s。

  扩增CaMV 35S启动子的引物序列如下:

  35S-F(SEQ ID NO.5):ATGGGATCCGCTTCATGGAGTCAAAGATTCAAA;

  35S-R(SEQ ID NO.6):CATGTCTAGAGTCAAGAGTCCCCCGTGTTC,

  目的片段长度为487bp,PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s。

  7.3 淹水处理和相关生理指标测定

  7.3.1 淹水处理

  分别取1株转入Sub1A和sSub1A基因的阳性植株放入水桶中,水淹没处理5天,并用野生型郑58作对照。在此期间内,时刻观察植株的生长情况,处理5天后,将水倒掉,植株恢复生长7天。恢复生长7天后结果如图4所示,野生型郑58叶片枯黄,停滞生长,而转基因植株能很快的恢复生长,多数叶片保持绿色。

  7.3.2 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

  酶液提取:取0.5g玉米叶片2.5g放入研钵中,加少量石英砂和1mL 4℃下预冷的50mmoL/L pH 7.0的PBS缓冲液,研磨至匀浆,再加入4mL PBS缓冲液冲洗合并移入25mL容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗并定容至刻度。混匀,5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000r/min离心15min,提取上清液,放入5℃冰箱中保存,备用。

  酶活性测定:取10mL试管4支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,1支为校零对照管。按表1加入试剂:25℃预热后,用S0管作为校零对照,其他管各加入0.3mL 0.1moL/L的H2O2,每加完一管立即计时,并迅速倒入石英比色杯中,用756MC紫外可见分光光度计在240nm下测定吸光度,每隔1min读1次,共测4min。空白管为煮死酶(100℃沸水浴,5min后冷却至室温)。

  表1 CAT活性测定试剂加样表

  试管号粗酶液(mL)pH7.0 磷酸缓冲液(mL)蒸馏水(mL)S00.21.51.3S10.21.51.0S20.21.51.0S30.21.51.0

  结果计算:待3支管全部测定完后,以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)按下式计算酶活性:

  式中:△A240=AS0-(AS1+AS2)/2;AS1、AS2——样品管吸光值;VT——粗酶提取液总体积(ml);V1——测定用粗酶液体积(ml);FW——样品鲜重(g);0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位(u);t——加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

  转基因植株叶片过氧化氢酶(CAT)活性测定结果如图5所示。

  7.3.3 相对电导率的测定

  具体测定步骤如下:

  (1)取大小叶片的植物叶片(少含茎节),用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分;

  (2)将叶片剪成适宜长度的长条(避开主脉),快速称取3份,每份0.1g;

  (3)将样品置于装有10mL的去离子水的试管中,盖上玻璃塞室温下浸泡12h;

  (4)用电导仪测定浸提液的电导(R1);

  (5)沸水浴加热30min,冷却至室温后摇匀,再测定浸提液电导(R2);

  (6)相对电导率=R1/R2×100。

  转基因植株叶片相对电导率测定结果如图5所示。

  7.3.4 细胞分裂素(CTK)的测定

  采用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)。

  (1)试剂配制:

  磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g NaCl,0.2g KH2PO4,2.96g Na2HPO4 ·12H2O,用量筒加1000 ml蒸馏水,pH为7.5;

  样品稀释液:500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20,0.5g明胶(稍加热溶解);

  底物缓冲液:称取5.10g C6H8O7·H2O(柠檬酸),18.43g Na2HPO4·12H2O,用量筒加1 000ml蒸馏水,再加1 mL Tween-20,pH为5.0;

  洗涤液:1000mL PBS加1mL Tween-20;

  终止液:2mol/L H2SO4;

  提取液:80%甲醇,内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚,为抗氧化剂,先用甲醇溶解BHT,再配成80%的浓度)。

  (2)样品中激素的提取

  称取0.5-1.0g新鲜植物材料(若取样后材料不能马上测定,用液氮速冻半小时后,保存在-20℃的冰箱中),加2ml样品提取液,在冰浴下研磨成匀浆,转入10ml试管,再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净,一并转入试管中,摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4h,3500转/min离心8min,取上清液。沉淀中加1ml提取液,搅匀,置4 ℃下再提取1h,离心,合并上清液并记录体积,残渣弃去。上清液过C-18固相萃取柱。过柱具体步骤是:80%甲醇(1ml)平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%乙醚(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循环。将过柱后的样品转入5ml塑料离心管中,真空浓缩干燥或用氮气吹干,除去提取液中的甲醇,用样品稀释液定容(一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容,测定不同激素时还要稀释适当的倍数再加样)。

  (3)样品测定

  竞争:即加标准物、待测样和抗体。加标样及待测样:取适量所给标样稀释配成:IAA,ABA,ZR标准曲线的最大浓度为100ng/mL,GA的最大浓度为50ng/mL,JA-ME 的最大浓度为200ng/ml。然后再依次2倍稀释8个浓度(包括0 ng/mL )。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行,每个浓度加2孔,每孔50μL,其余孔加待测样,每个样品重复两孔,每孔50μL。加抗体:在5mL样品稀释液中加入一定量的抗体(最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1:2000,就要加2.5μL的抗体),混匀后每孔加50μL,然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件37℃左右0.5h。

  洗板:将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共洗涤四次。

  加二抗:将适当的酶标二抗,加入10mL样品稀释液中(比如稀释倍数1:1000就加10μL),混匀后,在酶标板每孔加100μL,然后将其放入湿盒内,置37℃下,温育0.5h。

  洗板:方法同竞争之后的洗板。

  加底物显色:称取10-20mg邻苯二胺(OPD)溶于10mL底物缓冲液中(小心勿用手接触OPD),完全溶解后加4ml 30% H2O2。混匀,在每孔中加100μL,然后放入湿盒内,当显色适当后(肉眼能看出标准曲线有颜色梯度,且100ng/mL孔颜色还较浅),每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应。

  在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。

  (4)结果计算

  曲线的横坐标用激素标样各浓度(ng/mL)的自然对数表示,纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下:

  其中B0是0 ng/ml孔的显色值,B是其它浓度的显色值。

  待测样品可根据其显色值的logit值从图上查出其所含激素浓度(ng/mL)的自然对数,再经过反对数即可知其激素的浓度(ng/mL)。

  测定样品中浓度后,再计算出样品中CTK激素的含量(ng/g×FW)。FW为样品鲜重(g)。

  转基因植株叶片细胞分类素(CTK)含量测定结果如图7所示。

  以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

  人工合成玉3

  本发明涉及人工合成玉。

  现有天然玉资源有限,开采受条件制约。在生产、加工过程中,操作难度大,效率低下,产品拓展领域不高,浪费严重。

  本发明的目的在于:提供合成玉。可以是固态,也可以是液态。生产方便,操作简单,效率高,产品拓展领域广阔,环保节能。

  本发明可通过以下措施来实现:

  玉石粉70%-90%;不饱合聚脂树脂、氟树脂、环氧丙烯酸树脂、分散剂、消泡剂、固化剂、交联剂、抗老化剂:10%-30%组合而成。

  本发明的人工合成玉与现有天然玉相比具有以下优点:

  有效利利用玉资源,可以选用玉的废渣粉末、边角料合成,保护环境,节约能源,提高玉的利用率。

  固态的合成玉,可制成板材,卫生洁具、工艺品、日常用品,生产效率高,成型速度快、效果逼真。

  液态的合成玉,可制成室内外合成玉装饰涂料,具有透明和微透明不同的天然玉效果,层次分明、坚固耐用、耐腐蚀、抗老化、不褪色,施工方便,成品无毒、无味、无污染的优点。

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