一种高通量生物材料筛选双向梯度水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料筛选技术领域，涉及一种具有双向梯度可同时研究多因素对细胞行为影响的高通量生物材料筛选水凝胶，具体涉及该水凝胶的主要组成及制备方法。
背景技术
细胞诱导性材料具有复杂的组成结构、诱导机制和服役环境，是典型的多因素、多功能材料体系，传统的经验试错研发模式难以满足研发需求。
材料的高通量制备技术是近年来新材料研发领域重点关注的高效率、低成本筛选优化材料体系的先进技术。其在生物材料中的应用正处在起步阶段，在体系复杂、影响因素众多的生物材料研究中显示出独特优势。针对生物材料体系变量多、服役环境复杂以及材料生物相容性等特性，设计高通量生物材料筛选系统及表征手段、发展可进行多变量或多组分调控的细胞或组织诱导性材料的高通量制备方法、用较少的步骤和工作量制备较多的不同组分和结构的材料样品、覆盖较宽的材料参量空间，有利于建立和完善生物材料基因组、加速生物材料的研发进程。
梯度材料具有连续的梯度变化的特性和功能。我们只需要设置梯度材料的起点和终点，就可以在连续的梯度范围内检测材料的某些特性对细胞行为的影响。传统梯度材料只在某一方向上具有连续变化梯度，因而只能研究某一个变化因素对细胞行为的影响，研究能力和通量受限，不能满足生物材料高通量筛选技术的需求。
发明内容
本发明的目的是研制一种用于生物材料高通量筛选的双向梯度水凝胶。该水凝胶可用于同时研究两种材料或参数对细胞行为的影响及协同作用。
一种高通量生物材料筛选双向梯度水凝胶，该双向梯度水凝胶由生物相容性材料主体、以及两种在材料主体内沿不同方向呈梯度分布的功能材料构成。该水凝胶经两步反应制备形成，第一步采用梯度溶液法，将接枝双键的主体材料和接枝双键的功能材料制备成梯度溶液，进行紫外光引发交联形成具有单方向浓度梯度的水凝胶。第二步采用光梯度掩模板法制备，将上述单方向浓度梯度水凝胶浸没入含巯基的功能材料中，上覆光梯度掩模板使其梯度方向与上述单方向浓度梯度方向垂直，紫外光照射引发反应，洗去多余材料，制得所述的双向梯度水凝胶。
上述的梯度溶液包含以下组分(以质量分数计算)：接枝双键的主体材料5％～20％，接枝双键的功能材料0.5％～10％，光引发剂0.001％～0.1％；含巯基功能材料溶液中含巯基功能材料的质量分数为0.1％～50％。
上述的接枝双键的主体材料，为通过化学反应接枝双键的生物相容性材料或自身结构含有双键的生物相容性材料。采用的生物相容性材料包含多糖、多肽、蛋白质、聚氨基酸等生物高分子材料，如透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素等材料及其衍生物，也包含亲水性的合成高分子材料，如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯亚胺等均聚物和共聚物。
上述的接枝双键的功能材料指可以对细胞行为如黏附、迁移、增殖、凋亡、分泌、分化等行为产生影响的材料，如蛋白质、多肽、细胞因子、多糖、聚电解质等材料。
上述的溶液梯度法，指通过某些方法混合两种及以上的物质，使得到的溶液中至少一种物质的浓度沿某一方向呈梯度分布，然后通过加热，辐射，光照等手段使该溶液固化而使这一浓度梯度固定下来的方法。
上述的光梯度掩模板法，指具有光反应活性的体系，通过沿某一方向具有透光率梯度的掩模板(即光梯度掩膜板)，在光照下获得具有光强度梯度的光照环境，从而获得反应程度或反应强度梯度，得到梯度材料的方法。
本发明的有益效果在于：
通过本发明方法制备的水凝胶表面在正交方向上具有两种功能材料的浓度梯度，在其表面负载细胞可以同时观察两种功能材料浓度对细胞行为的影响，并且可以研究两种材料对细胞的共同作用影响，进一步的可高效筛选出适合特定细胞功能调控的材料学变量。
附图说明
图1为注射法构建梯度溶液的装置示意图；
图2为双向梯度水凝胶的纵向罗丹明B染色的明胶荧光强度梯度表征，包括激光共聚焦荧光显微镜照片及荧光强度随箭头方向的变化趋势；
图3为双向梯度水凝胶的横向荧光素染色多肽的荧光强度梯度表征，包括激光共聚焦荧光显微镜照片及荧光强度随箭头方向的变化趋势。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的阐述内容后，本领域技术人员可对本发明做修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书限定范围。
本发明的高通量生物材料筛选双向梯度水凝胶经两步反应制备得到。第一步采用梯度溶液法，将接枝双键的主体材料和接枝双键的功能材料制备成梯度溶液，进行紫外光引发交联形成具有单方向浓度梯度的水凝胶。第二步采用光梯度掩模板法制备，将上述单梯度水凝胶浸没入含巯基的功能材料中，上覆光梯度掩模板使其梯度方向与已有梯度方向垂直，紫外光照射引发反应，洗去多余材料，制得所述的双向梯度水凝胶。
所述的接枝双键的主体材料，可以是通过化学反应接枝双键的生物相容性材料或自身结构含有双键的生物相容性材料。采用的生物相容性材料包含多糖、多肽、蛋白质、聚氨基酸等生物高分子材料，如透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素等材料及其衍生物，也包含亲水性的合成高分子材料，如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇、聚乙烯亚胺等均聚物和共聚物。
所述的接枝双键的功能材料指可以对细胞行为如黏附、迁移、增殖、凋亡、分泌、分化等行为产生影响的材料，如蛋白质、多肽、细胞因子、多糖、聚电解质等材料。
实施例1
双键接枝的透明质酸的制备
通过甲基丙烯酸酐和透明质酸(HA)羟基间的酯交换反应得到双键接枝的透明质酸(HA-MA)。
具体实施过程如下：称量1g HA置于三颈烧瓶中，然后加入60mL水与30mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂搅拌使HA完全溶解。保持搅拌，将烧瓶置于冰水浴中同时向烧瓶中逐滴加入甲基丙烯酸酐。滴加甲基丙烯酸酐过程中调节溶液pH，使溶液pH值保持在8.5左右。将8mL甲基丙烯酸酐全部滴加完毕后，反应在冰水浴中继续进行24h并维持反应体系的pH在8.5左右。反应结束后，将溶液倒入800mL冰乙醇中沉降并离心收集沉淀物，再将收集到的沉淀物用超纯水溶解装入透析袋透析4天(透析袋截留分子量为3.5kDa)。透析后的溶液经冷冻干燥得到最终产物。
所得接枝双键的透明质酸(HA-MA)，平均分子量～100kDa，双键接枝率～92％。
双键接枝的明胶的制备
通过甲基丙烯酸酐和明胶上的氨基间的亲核加成-消除反应得到双键接枝的明胶(Gel-MA)。
具体实施过程如下：首先称量4g明胶(B型)置于三颈烧瓶中，然后加入40mL pH为8的0.2M磷酸缓冲溶液，加热至70℃使明胶完全溶解。完全溶解后，冷却至45℃，500rpm转速下，缓慢滴加400μL甲基丙烯酸酐。滴加完成后，待其反应一小时，再加入40mL0.2M磷酸缓冲溶液。接着，将溶液倒入800mL冰乙醇中沉降并离心收集沉淀物，再将收集到的沉淀物用超纯水溶解装入透析袋透析4天(透析袋截留分子量为3.5kDa)。透析后的溶液经冷冻干燥得到最终产物。
所得接枝双键的明胶(Gel-MA)，平均分子量40～50kDa，双键接枝率～68％。
双向梯度水凝胶的制备
第一步，分别配制10mg/mL的HA-MA溶液A、含有5mg/mL的Gel-MA和10mg/mL HA-MA的混合溶液B，并分别加入1/10体积的0.5％的光引发剂I2959。接着，将1mL B溶液加入到2mL注射器中，1mL HA-MA溶液加入到容器2中，按图1所示。注射泵1以一定速率持续将B溶液注入到HA-MA溶液中，混匀，同时用蠕动泵3将容器2中的溶液以注射泵2倍的速率转移到模具4(5*2*0.3cm3)中。由于Gel-MA的持续加入，随着时间的推移，HA-MA溶液中明胶的含量逐步增加，最终形成具有明胶浓度梯度的梯度溶液。最后，将含有光引发剂的梯度溶液放入紫外固化箱(INTELLI-RAY 400,Uvitron,30mW/cm2)中并用365nm紫外光照射5分钟引发透明质酸和明胶分子上的双键发生聚合从而交联形成明胶浓度梯度水凝胶。
第二步，配制1.6mg/mL含有0.05％光引发剂I2959的TGF-β亲和肽水溶液C。然后，将上述具有明胶组成梯度的水凝胶浸泡在溶液C中，盖上光梯度掩模板并使其梯度方向与明胶浓度梯度垂直，放入上述紫外固化箱中并用365nm紫外光照射60s使多肽端基上的巯基与透明质酸和明胶分子上的双键发生自由基加成从而将多肽接枝到水凝胶上形成可用于生物材料高通量筛选的双向梯度水凝胶。
为证明上述方法制得了双向梯度结构，采用罗丹明B异硫氰酸酯(RB)标记的上述Gel-MA、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的TGF-β亲和肽通过上述实施过程制备荧光标记的双向梯度水凝胶。所得水凝胶中，上述荧光标记的荧光强度与相应材料的浓度呈正相关。通过激光共聚焦荧光显微镜不同信号通道观察表征双向梯度水凝胶的不同方向上的浓度梯度。如图2，图3所示，证明该实例制得了具有双向梯度的水凝胶。
实施例2
同实施例1，区别在于第一步中混合溶液B由10mg/mL的HA-MA溶液和10mg/mL的Gel-MA组成。
实施例3
同实施例1，区别在于采用的主体材料为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，Mn＝4000g/mol，Sigma-Aldrich)。
实施例4
同实施例1，区别在于第二步使用的带巯基功能材料为带巯基的黏附肽，多肽序列为CC-RGD-EKEK。
实施例5
同实施例1，区别在于第二步中，紫外光照时间为30s。
