一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法、抗菌静电纺丝纤维及其应用

一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法、抗菌静电纺丝纤维及其应用

　　技术领域

　　本发明具体涉及一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法、抗菌静电纺丝纤维及其应用。

　　背景技术

　　细菌存在于生活的方方面面，其中致病菌对人类造成的危害无所不在。随着抗生素的滥用，耐药细菌出现并伴随耐药性增加，使得利用抗生素治疗细菌感染变得越来越困难。此外细菌大量滋生可以产生生物膜，其是一种高度动态的固定细菌群落，被自产的保护性细胞外聚合物(EPS)包围，而正是EPS的存在保护病原菌免受外来抗菌药物的侵袭，使细菌更难以被杀死。同时，与个体浮游细菌相比，生物膜内的细菌对抗生素的敏感性降低，而这些细菌往往更易于产生抗药性。临床应用中面对创伤伤口感染，通常在伤口覆盖医用敷料，隔绝外界细菌或其他物质的进一步侵袭，而及时有效的杀死伤口表面的细菌并抑制细菌生物膜的形成才是抑制伤口感染，促进伤口愈合的关键所在。因此如何获得具有有效抑制或者杀死耐药细菌的医用敷料成为目前全球医疗领域面临的一大难题。

　　发明内容

　　本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法、抗菌静电纺丝纤维及其应用。

　　本发明的第一个目的在于提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法，包括如下步骤：

　　(a)以丙烯腈和4-乙烯基吡啶作为单体，进行共聚反应，得到共聚物；

　　(b)将所述共聚物与进行接枝化反应，得到聚离子液体；

　　(c)将所述聚离子液体，溶解在DMF中，得到聚合物的静电纺丝溶液，通过静电纺丝机将所述静电纺丝液电纺丝制备得到基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维。

　　具体地，步骤(b)中，所述共聚物与的投料摩尔比为1:1-6。

　　具体地，所述中，X为选自甲基、甲氧基和羧酸甲酯基中的一种。

　　具体地，所述中，所述n为独立地选自1-3的整数。

　　具体地，步骤(a)中，所述共聚反应的具体步骤为，在氮气氛围下，以丙烯腈和4-乙烯基吡啶作为单体，AIBN为引发剂，在50-70℃下搅拌5-7h后，将聚合反应的溶液沉淀到甲醇中，并用甲醇洗涤，离心后干燥后得到所述共聚物。

　　优选地，所述丙烯腈和4-乙烯基吡啶的投料摩尔比为1:3.5-4.5，所述AIBN的投料摩尔数与所述丙烯腈和所述4-乙烯基吡啶的总投料摩尔数的比例为1:90-110。

　　具体地，步骤(b)中，所述接枝化反应的具体步骤为，将所述共聚物溶解在DMF中，再加入搅拌70-74h，再将接枝后的聚合物溶液在丙酮中沉淀，并用丙酮洗涤，离心后干燥得到所述聚离子液体。

　　具体地，步骤(c)中，所述聚离子液体与所述DMF的投料质量比为1:18-22。

　　本发明的第二个目的在于提供一种抗菌静电纺丝纤维，采用如上所述基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法制备得到。

　　本发明的第三个目的在于提供一种如上所述抗菌静电纺丝纤维在医疗领域的应用。

　　离子液体聚合物作为近年来抗菌材料领域的研究热点，因其抗菌机制与传统抗生素不同，其通过静电引力与细菌的表面作用，结合疏水的基团插入到细胞膜中扰乱细胞膜，最终导致细菌裂解死亡，可以有效避免细菌耐药性的出现，同时对耐药菌也可以有效的杀死或抑制。而静电纺丝是一种简单而廉价的聚合物加工技术，用于生产非织造的纳米结构纤维材料。静电纺丝纤维具有高的比表面积、可调控的孔径和延伸性，在生物医用材料领域具有得天独厚的优势，尤其其多孔特性使其可以有效的吸收组织渗液同时保证伤口创面的透气性，可用于制备性能优良的生物医用敷料。

　　由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明将聚离子液体与静电纺丝的方法结合，制备得到的基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料，该医用敷料能够抗菌、抑制生物膜，敷在伤口表面可以隔绝外界异物及细菌侵入伤口，同时对伤口处的细菌及细菌生物膜有良好的杀灭及抑制作用，透气性好可吸收组织渗液；适用于不同大小、形状及所在部位的创面；无过敏和耐药性、安全性高；制备和使用方便。

　　附图说明

　　附图1(a)为实施例1中抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料的抗金黄色葡萄球菌的测试效果图；(b)为实施例1中抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料的抗铜绿假单胞菌的测试效果图；(c)为实施例1中抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料的抗大肠杆菌的测试效果图；

　　附图2(a)分别为实施例1、2、3中抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料的大肠杆菌的测试效果图(活死细菌染色)；(b)分别为实施例1、2、3中抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料的抗铜绿假单胞菌的测试效果图(活死细菌染色)；

　　附图3为对照组及实施例1抗菌静电纺丝纤维对成纤维细胞的细胞毒性结果；

　　附图4(a-c)分别为对照组及实施例1制备得到的抗菌静电纺丝纤维大肠杆菌、金黄色葡萄球和绿脓杆菌形成生物膜的结晶紫染色实验结果对比图。

　　具体实施方式

　　下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。

　　本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法，包括如下步骤：

　　(a)以丙烯腈和4-乙烯基吡啶作为单体，进行共聚反应(具体步骤为，在氮气氛围下，以丙烯腈和4-乙烯基吡啶作为单体，AIBN为引发剂，在50-70℃下搅拌5-7h后，将聚合反应的溶液沉淀到甲醇中，并用甲醇洗涤，离心后干燥)，得到共聚物；丙烯腈和4-乙烯基吡啶的投料摩尔比为1:3.5-4.5，AIBN的投料摩尔数与丙烯腈和4-乙烯基吡啶的总投料摩尔数的比例为1:90-110。

　　(b)将共聚物与进行接枝化反应(具体步骤为，将共聚物溶解在DMF中，再加入搅拌70-74h，再将接枝后的聚合物溶液在丙酮中沉淀，并用丙酮洗涤，离心后干燥得到聚离子液体)，得到聚离子液体；共聚物与的投料摩尔比为1:1-6；中，X为选自甲基、甲氧基和羧酸甲酯基中的一种，n为独立地选自1-3的整数。

　　(c)将聚离子液体，溶解在DMF中(聚离子液体与DMF的投料质量比为1:18-22)，得到聚合物溶液的静电纺丝液，将静电纺丝液接上静电纺丝机，从而制备得到基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维。

　　本发明提供一种抗菌静电纺丝纤维，采用如上基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法制备得到。

　　本发明还提供一种并将上述抗菌静电纺丝纤维在医疗领域的应用，具体地是将抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料。抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料需要进行抗菌测试、细胞毒性测试、抑制生物膜的生长(结晶紫染色)测试和溶血测试。

　　具体的测试方法如下：

　　1、抗菌测试：测试抗菌静电纺丝纤维分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌和的抗菌性。

　　取面积为1.5×1.5cm2的抗菌静电纺丝纤维作为医用敷料样品为实验组、PET膜作为对照组，在实验组和对照组表面分别滴加OD＝0.1的菌液(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)培养4小时后涂板，再培养24小时后计数。

　　2、细胞毒性测试：利用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法对抗菌静电纺丝纤维的抗菌敷料对人类皮肤成纤维细胞的毒性进行测试。

　　将人类皮肤成纤维细胞(1×104CFU/mL)用10％胎牛血清培养基在24孔板中培养48h，分别取1.5×1.5cm2抗菌静电纺丝纤维作为医用敷料样品和PET膜加入到人类皮肤成纤维细胞溶液中37℃下培养72h后分别取0.1mL MTT溶液(5g/L PBS溶液)滴加至孔板中再培养，4h后将孔板中上清液移除，并加入0.75mL DMSO来溶解甲瓒晶体用酶标仪测试其OD490nm值来表征甲瓒的释放量，平行实验3次，测试人类皮肤成纤维细胞的相对生长速率。

　　3、抑制生物膜的生长(结晶紫染色)测试：

　　分别取面积为1.5×1.5cm2的抗菌静电纺丝纤维作为医用敷料样品为实验组、PET膜作为对照组，在实验组和对照组表面分别滴加OD＝0.1的铜绿假单胞菌(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)，在37℃的培养箱下培养24小时。将培养基吸掉，并且用PBS洗涤3次，用95％乙醇作用15分钟，风干乙醇后，加入质量分数为0.1％的结晶紫溶液作用15分钟，用无菌水洗涤3次，最后使用33％醋酸溶解和生物膜作用的结晶紫，用酶标仪测试其OD490nm值来表征生物膜的量。

　　4、溶血测试：

　　将新鲜人血(3mL)以1500rpm离心15分钟并用PBS洗涤直至上清液透明。用PBS将红细胞沉淀物稀释至2vol％。将灭菌的抗菌静电纺丝纤维的医用敷料样品和PET膜(面积：1.5×1.5cm2)浸入稀释的血液(每管5mL)溶液中，并分别在37℃下孵育3小时。在将处理过的稀释血液样品以1500rpm离心15分钟后，将100μL的上清液转移到96孔板中。通过用酶标仪记录OD576nm来评估血红蛋白释放的量。PBS中的红细胞和2％Triton分别用作阴性和阳性对照。

　　实施例1本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，包括如下步骤：

　　(a)在氮气氛围下，以0.53g丙烯腈和4.2g 4-乙烯基吡啶作为单体(丙烯腈和4-乙烯基吡啶的投料摩尔比为1:4)，82mg AIBN为引发剂(AIBN的投料摩尔数与丙烯腈和4-乙烯基吡啶的总投料摩尔数的比例为1:100)，在60℃下搅拌6h后进行共聚反应，将聚合反应的溶液沉淀到甲醇中，并用甲醇洗涤三次，离心后在80℃下干燥12h，得到共聚物。

　　(b)将2mol共聚物(此处的共聚物通过核磁氢谱计算出共聚物中丙烯腈单体与4-乙烯基吡啶的共聚比例)溶解在DMF中，与12mol(X为甲基，n＝3)进行接枝化反应(此时共聚物与的投料摩尔比为1:6)，搅拌72h，再将接枝后的聚合物溶液在丙酮中沉淀，并用丙酮洗涤三次，离心后干燥，得到聚离子液体，结构式如下：(将得到的聚离子液体进行氢谱测试，可知接枝率为70％，即吡啶基与吡啶盐的摩尔比为3:7)

　　(c)将聚离子液体，溶解在DMF中(聚离子液体与DMF的投料质量比为1:20)，得到聚合物溶液的静电纺丝液，将静电纺丝液接上静电纺丝机，从而制备得到基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维。

　　将上述制备得到的抗菌静电纺丝纤维用作医用敷料，并且进行抗菌测试、细胞毒性测试、抑制生物膜的生长(结晶紫染色)测试、溶血测试。

　　实施例2本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，(X为甲氧基，n＝2)，得到聚离子液体的结构式如下：接枝率为72％。

　　实施例3本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，(X为羧酸甲酯基，n＝1)，得到聚离子液体的结构式如下：接枝率为76％。

　　实施例4本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为2mol，接枝率为30％。

　　实施例5本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为6mol，接枝率为50％

　　实施例6本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例2中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为2mol，接枝率为35％。

　　实施例7本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例2中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为6mol，接枝率为52％。

　　实施例8本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例3中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为2mol，接枝率为40％。

　　实施例9本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例3中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为6mol，接枝率为54％。

　　对比例1本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为0.5mol，接枝率为11％。

　　对比例2本发明提供一种基于聚离子液体的抗菌静电纺丝纤维的制备方法及其应用，它与实施例1中的基本一致，不同的是：步骤(b)中，的添加摩尔数为14mol，接枝率为85％。

　　表1：实施例1-9以及对比例1-2中制备的医学敷料的性能参数表

　　

　　

　　如图1所示，对照组细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)生长正常且大量增值，而样品组的细菌只有很少量甚至无生长，说明实施例1制备得到的抗菌静电纺丝纤维对三种细菌均具有优异的抗菌性。如图2所示，将实施实例1,2,3的抗菌纺丝纤维分别与大肠杆菌和绿脓杆菌培养后，采用活/死细菌染色后的荧光图片，说明实施实例1、2、3的抗菌纺丝纤维均可有效杀死细菌。如图3所示，成纤维细胞的相对细胞生长率>85％，说明实施例1制备得到的抗菌静电纺丝纤维对成纤维细胞不具有明显的细胞毒性。如图4所示，对照组的结晶紫染色浓度明显高于实验组，说明实施例1制备得到的抗菌静电纺丝纤维对生物膜的生长具有明显的抑制作用。如表1所示，实施例1的溶血率低于5％，说明实施例1制备得到的抗菌静电纺丝纤维没有明显的溶血效应。

　　随着加入的(X为甲基，n＝3/X为甲氧基，n＝2/X为羧酸甲酯基，n＝1)与吡啶基共聚物的比例从1:1上升至1:3，1:6，聚合物的接枝率逐渐上升，即随着反应物浓度增加，目标产物产量上升。而对于不同的接枝基团(烷基，醚基，酯基)，其聚合物的抗菌性不尽相同，表现为烷基>醚基>酯基。对与三种取代基而言，疏水作用力在抗菌作用中起了很重要的作用。对于疏水性的烷基，其可以有效的插入到细菌细胞膜中扰动细菌细胞膜；而对于侧链是酯基的聚合物，由于羰基的吸电子作用限制了其与细胞膜的疏水作用，导致其抗菌性最差。

　　此外，由于疏水作用力的不同，导致含有不同接枝基团的聚合物与血细胞的作用力不同，引起不同的溶血作用，表现为烷基>醚基>酯基。

　　上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。