一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用
技术领域
本发明属于鳄鱼血加工技术领域，具体涉及一种鳄鱼血在制备抗肿瘤抗病毒药物中的应用。
背景技术
鳄鱼是最古老的爬行动物，在地球上已生存了2亿3千多万年,因而具有“活化石”之称。
中医古书记载，鳄鱼血具有清热解毒、消炎、消肿瘤等功效。近年来，国外学者对鳄鱼血的功效进行了研究，已有鳄鱼血具有抗菌、抗病毒等方面作用的报道，而且有助于提升实验动物在病理条件下的初级免疫应答能力。现代研究表明，鳄鱼血有两大显著的功能特点：鳄鱼全血、血红蛋白、血清、血浆和白细胞有抗细菌、真菌、病毒和抗癌活性。另一个显著功能特点是，鳄鱼血红蛋白的携氧量超过其它动物的100倍以上，这种特殊的血红蛋白进入人体和人体血红蛋白合成后可提高人体的血液携氧量，将足够的氧送到大脑及身体的各个部位，增强体液和细胞的活力及抗突变能力。
鳄鱼血之所以有如此多的功效，我们认为可能与血液中的多糖有很大的关系，因为大量研究表明，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等都有着密切的关系，具有抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用。因此鳄鱼血中的多糖具有很大的潜在性研究价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：
一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用。
进一步的，是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，最后将得到的鳄鱼血多糖提取物用于与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成用于肝癌治疗的药物。
进一步的，所述的药剂填充剂为医学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。
进一步的，所述的药物可制成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
进一步的，所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法包括如下步骤：
1)取无菌鳄鱼血，然后将其与抗凝剂共混摇匀，再对进行离心处理，最后收集取上清液得鳄鱼血血浆备用；
2)向步骤1)所得的鳄鱼血血浆中注入添加剂，磁力搅拌均匀后得混合血浆备用；
3)对步骤2)所得的混合血浆进行冷冻干燥制成粉末，取出即得成品鳄鱼血冻干粉。
进一步的，步骤1)中所述的抗凝剂的加入量是所取鳄鱼血总质量的2～2.5％；所述的离心处理时控制离心的转速为2000～2200rpm。
进一步的，所述的添加剂的注入量是鳄鱼血血浆总质量的8～12％；所述的添加剂的制备方法具体是：将葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同投入到盛有大米的锅内，始终控制锅内的温度为110～115℃，然后不断翻炒处理50～55min后取出去除大米得米炒料，随后将此米炒料粉碎过200目，投入到体积分数为60％的乙醇溶液中不断回流浸提处理2～3天，最后取出浸提液即得添加剂。
进一步的，所述的鳄鱼血多糖提取物的制备方法具体是：
(1)将鳄鱼血冻干粉与去离子水对应按照重量比1:30～35进行混合破碎，然后离心处理5～6次合并上清液，接着加入上清液4.5～5倍体积的无水乙醇静置处理8～10h，随后再离心弃除上清液，再用无水乙醇清洗2～3次后离心弃除上清液，随后用乙醚将其吹打成粉末状，得鳄鱼血多糖粗提物；
(2)将步骤(1)制得的鳄鱼血多糖粗提物与去离子水对应按照重量比1:5～8进行混合，然后再加入鳄鱼血多糖粗提物总质量1～1.5％的氯仿-正丁醇溶液，搅拌均匀后离心去除中间蛋白质层，然后析出下层多糖溶液，最后置于透析袋中，透析处理50～60h后取出浓缩，最后再经冷冻干燥处理得鳄鱼血多糖提取物。
进一步的，步骤(2)中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按5～6:1体积比混合而成。
进一步的，步骤(2)中所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-10～-15℃。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后再对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，在鳄鱼血冻干粉的制备中，向鳄鱼血血浆中注入了添加剂，此添加剂成分是以葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同混合浸提而成，添加剂中含有大量的多糖、酮类等生物活性物质，此类物质与鳄鱼血多糖能够起到很强的协同作用效果，从而能显著提升整体的抗病毒、抗肿瘤与免疫调节作用，最终表现出了很强的控制肿瘤细胞生长的效果，在肝癌中的应用潜力巨大。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用，具体是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，最后将得到的鳄鱼血多糖提取物用于与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成用于肝癌治疗的药物。
所述的药剂填充剂为医学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。
所述的药物可制成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法包括如下步骤：
1)取无菌鳄鱼血，然后将其与抗凝剂共混摇匀，再对进行离心处理，最后收集取上清液得鳄鱼血血浆备用；
2)向步骤1)所得的鳄鱼血血浆中注入添加剂，磁力搅拌均匀后得混合血浆备用；
3)对步骤2)所得的混合血浆进行冷冻干燥制成粉末，取出即得成品鳄鱼血冻干粉。
步骤1)中所述的抗凝剂的加入量是所取鳄鱼血总质量的2％；所述的离心处理时控制离心的转速为2000rpm。
所述的添加剂的注入量是鳄鱼血血浆总质量的8％；所述的添加剂的制备方法具体是：将葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同投入到盛有大米的锅内，始终控制锅内的温度为110℃，然后不断翻炒处理50min后取出去除大米得米炒料，随后将此米炒料粉碎过200目，投入到体积分数为60％的乙醇溶液中不断回流浸提处理2天，最后取出浸提液即得添加剂。
所述的鳄鱼血多糖提取物的制备方法具体是：
(1)将鳄鱼血冻干粉与去离子水对应按照重量比1:30进行混合破碎，然后离心处理5次合并上清液，接着加入上清液4.5倍体积的无水乙醇静置处理8h，随后再离心弃除上清液，再用无水乙醇清洗2次后离心弃除上清液，随后用乙醚将其吹打成粉末状，得鳄鱼血多糖粗提物；
(2)将步骤(1)制得的鳄鱼血多糖粗提物与去离子水对应按照重量比1:5进行混合，然后再加入鳄鱼血多糖粗提物总质量1％的氯仿-正丁醇溶液，搅拌均匀后离心去除中间蛋白质层，然后析出下层多糖溶液，最后置于透析袋中，透析处理50h后取出浓缩，最后再经冷冻干燥处理得鳄鱼血多糖提取物。
步骤(2)中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按5:1体积比混合而成。
步骤(2)中所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-10℃。
实施例2
一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用，具体是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，最后将得到的鳄鱼血多糖提取物用于与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成用于肝癌治疗的药物。
所述的药剂填充剂为医学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。
所述的药物可制成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法包括如下步骤：
1)取无菌鳄鱼血，然后将其与抗凝剂共混摇匀，再对进行离心处理，最后收集取上清液得鳄鱼血血浆备用；
2)向步骤1)所得的鳄鱼血血浆中注入添加剂，磁力搅拌均匀后得混合血浆备用；
3)对步骤2)所得的混合血浆进行冷冻干燥制成粉末，取出即得成品鳄鱼血冻干粉。
步骤1)中所述的抗凝剂的加入量是所取鳄鱼血总质量的2％；所述的离心处理时控制离心的转速为2100rpm。
所述的添加剂的注入量是鳄鱼血血浆总质量的10％；所述的添加剂的制备方法具体是：将葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同投入到盛有大米的锅内，始终控制锅内的温度为112℃，然后不断翻炒处理50min后取出去除大米得米炒料，随后将此米炒料粉碎过200目，投入到体积分数为60％的乙醇溶液中不断回流浸提处理2天，最后取出浸提液即得添加剂。
所述的鳄鱼血多糖提取物的制备方法具体是：
(1)将鳄鱼血冻干粉与去离子水对应按照重量比1:30进行混合破碎，然后离心处理5次合并上清液，接着加入上清液4.8倍体积的无水乙醇静置处理9h，随后再离心弃除上清液，再用无水乙醇清洗2次后离心弃除上清液，随后用乙醚将其吹打成粉末状，得鳄鱼血多糖粗提物；
(2)将步骤(1)制得的鳄鱼血多糖粗提物与去离子水对应按照重量比1:5进行混合，然后再加入鳄鱼血多糖粗提物总质量1.3％的氯仿-正丁醇溶液，搅拌均匀后离心去除中间蛋白质层，然后析出下层多糖溶液，最后置于透析袋中，透析处理55h后取出浓缩，最后再经冷冻干燥处理得鳄鱼血多糖提取物。
步骤(2)中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按5.5:1体积比混合而成。
步骤(2)中所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-13℃。
实施例3
一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用，具体是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，最后将得到的鳄鱼血多糖提取物用于与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成用于肝癌治疗的药物。
所述的药剂填充剂为医学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。
所述的药物可制成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法包括如下步骤：
1)取无菌鳄鱼血，然后将其与抗凝剂共混摇匀，再对进行离心处理，最后收集取上清液得鳄鱼血血浆备用；
2)向步骤1)所得的鳄鱼血血浆中注入添加剂，磁力搅拌均匀后得混合血浆备用；
3)对步骤2)所得的混合血浆进行冷冻干燥制成粉末，取出即得成品鳄鱼血冻干粉。
步骤1)中所述的抗凝剂的加入量是所取鳄鱼血总质量的2.2％；所述的离心处理时控制离心的转速为2150rpm。
所述的添加剂的注入量是鳄鱼血血浆总质量的10％；所述的添加剂的制备方法具体是：将葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同投入到盛有大米的锅内，始终控制锅内的温度为112℃，然后不断翻炒处理53min后取出去除大米得米炒料，随后将此米炒料粉碎过200目，投入到体积分数为60％的乙醇溶液中不断回流浸提处理2天，最后取出浸提液即得添加剂。
所述的鳄鱼血多糖提取物的制备方法具体是：
(1)将鳄鱼血冻干粉与去离子水对应按照重量比1:33进行混合破碎，然后离心处理5次合并上清液，接着加入上清液4.8倍体积的无水乙醇静置处理9h，随后再离心弃除上清液，再用无水乙醇清洗2次后离心弃除上清液，随后用乙醚将其吹打成粉末状，得鳄鱼血多糖粗提物；
(2)将步骤(1)制得的鳄鱼血多糖粗提物与去离子水对应按照重量比1:7进行混合，然后再加入鳄鱼血多糖粗提物总质量1.3％的氯仿-正丁醇溶液，搅拌均匀后离心去除中间蛋白质层，然后析出下层多糖溶液，最后置于透析袋中，透析处理55h后取出浓缩，最后再经冷冻干燥处理得鳄鱼血多糖提取物。
步骤(2)中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按5.6:1体积比混合而成。
步骤(2)中所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-13℃。
实施例4
一种鳄鱼血多糖在肝癌治疗中的应用，具体是将鳄鱼血制成冻干粉后，然后对鳄鱼血冻干粉进行鳄鱼血多糖的提取，最后将得到的鳄鱼血多糖提取物用于与普通常规的药剂填充剂配合，经常规方法制成用于肝癌治疗的药物。
所述的药剂填充剂为医学上可接受的酸、碱、盐、水合物或酯及其他辅料。
所述的药物可制成片剂、胶囊、口服液体制剂、乳液和注射液中的至少一种。
所述的鳄鱼血冻干粉的制备方法包括如下步骤：
1)取无菌鳄鱼血，然后将其与抗凝剂共混摇匀，再对进行离心处理，最后收集取上清液得鳄鱼血血浆备用；
2)向步骤1)所得的鳄鱼血血浆中注入添加剂，磁力搅拌均匀后得混合血浆备用；
3)对步骤2)所得的混合血浆进行冷冻干燥制成粉末，取出即得成品鳄鱼血冻干粉。
步骤1)中所述的抗凝剂的加入量是所取鳄鱼血总质量的2.5％；所述的离心处理时控制离心的转速为2200rpm。
所述的添加剂的注入量是鳄鱼血血浆总质量的12％；所述的添加剂的制备方法具体是：将葵花籽、连翘、虫草、石榴籽共同投入到盛有大米的锅内，始终控制锅内的温度为115℃，然后不断翻炒处理55min后取出去除大米得米炒料，随后将此米炒料粉碎过200目，投入到体积分数为60％的乙醇溶液中不断回流浸提处理3天，最后取出浸提液即得添加剂。
所述的鳄鱼血多糖提取物的制备方法具体是：
(1)将鳄鱼血冻干粉与去离子水对应按照重量比1:35进行混合破碎，然后离心处理6次合并上清液，接着加入上清液5倍体积的无水乙醇静置处理10h，随后再离心弃除上清液，再用无水乙醇清洗3次后离心弃除上清液，随后用乙醚将其吹打成粉末状，得鳄鱼血多糖粗提物；
(2)将步骤(1)制得的鳄鱼血多糖粗提物与去离子水对应按照重量比1:8进行混合，然后再加入鳄鱼血多糖粗提物总质量1.5％的氯仿-正丁醇溶液，搅拌均匀后离心去除中间蛋白质层，然后析出下层多糖溶液，最后置于透析袋中，透析处理60h后取出浓缩，最后再经冷冻干燥处理得鳄鱼血多糖提取物。
步骤(2)中所述的氯仿-正丁醇溶液为氯仿与正丁醇按6:1体积比混合而成。
步骤(2)中所述的冷冻干燥处理时控制冷冻的温度为-15℃。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例3相比，区别仅在于中鳄鱼血冻干粉的制备中，省去了添加剂的添加使用，除此外的方法步骤均相同。
为了对比本发明效果，对上述实施例1～4及对比实施例1的应用方法进行抗肝癌细胞增殖实验，具体是：
A、实验方法为四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法：检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性四甲基偶氮唑盐(MTT)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲贲(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚硕(DMSO)能溶解细胞中的甲攒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲璞结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
B、细胞复苏及培养：将冻存的人肝癌细胞(BEL-7402、SMMC-7721、HepG2；均购自南京凯基生物科技发展有限公司)从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中使细胞融化。生物安全柜中将细胞悬液吸到装有适量培养基的离心管中，800rpm/min离心5分钟：弃上清液，用1mL培养基悬浮细胞，吸到装有适量培养基的细胞培养皿中，将细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养。待细胞达到80％-90％接触汇合时进行传代，0.2％胰酶消化成单细胞悬液，800rpm/min离心5分钟；弃上清，加1-2mL培养基悬浮细胞，将细胞传到2-3个装有适量培养基的培养皿中，继续培养。
C、四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定药物对细胞生长的抑制作用：将处于对数生长期的贴壁细胞经胰蛋白酶消化后，分散成单个细胞，并使其悬浮在相应细胞培养基中。将细胞接种于96孔培养板上，每孔100uL细胞悬液，3000ce11s/孔。将上述96孔培养板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中过夜培养24小时，使细胞贴壁。待24小时后细胞完全贴壁后，弃去培养液，试验组分别加入含有上述实施例1～4及对比实施例1的鳄鱼血多糖提取物的细胞培养液，并设置不加药物只加相应药物溶剂的对照孔(鳄鱼血多糖溶剂为双蒸水)，同时设置只加培养基不含细胞的调零孔。每组设6个平行孔，然后将96孔板置于37℃，二氧化碳(5％)培养箱中培养48小时。
48小时后，每孔加入25ul四甲基偶氮唑盐(浓度为5mg/ml)，继续孵育4h。然后将培养液轻轻吸出，每孔加入150ul二甲基亚砜作溶剂溶解，溶解后用酶标仪测定570nm处的吸光度。
D、数据分析：计算细胞的存活率和抑制率，并计算药物对细胞的半数抑制浓度IC50。存活率％＝(实验组OD值-调零孔OD值)/(阴性模型组OD值-调零孔OD值)×100％；抑制率％＝(1-存活率)×100％。用Graphpad%20Prism5软件进行IC50值的计算；测定结果见下表1。
表1各组对肝癌细胞的抑制作用(IC50值)
由上表1中可以看出，本发明鳄鱼血多糖提取物在很低的浓度时即可对人肝癌细胞有明显的抑制增殖的作用；也即本发明应用能很好的适用于肝癌的治疗中，极具推广应用价值和市场竞争力。
