一种聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶及制备
技术领域
本发明属于生物高分子材料技术领域，特别涉及一种聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
皮肤作为人体最大、暴露在最外部的器官极易遭受各种创伤。各种急、慢性创伤千百年来一直困扰着人们，因此也一直是医学领域的研究热点。其中烧伤或烫伤极易造成大面积不同程度的皮肤损伤，患者往往由于体液丢失、感染导致休克甚至死亡，是目前临床治疗的难点。
水凝胶是一种由亲水性高分子或聚合物借助氢键、共价键或范德华力等作用力交联形成的三维网络结构材料。水凝胶由于与人体软组织具有相似结构和特性，具有维持湿润的伤口愈合环境、吸收渗出液、透气、冷却伤口缓解疼痛等优点，在伤口敷料上有广泛的应用。选择合适的水凝胶敷料能够很好的代替受损的皮肤组织，起到屏蔽细菌或者外界的其他物质的感染的作用，提供给创面愈合一个良好的环境。由细菌和其他微生物感染的慢性伤口是导致并发症的主要因素之一，研发具有抗菌性的水凝胶敷料是提高伤口愈合效率的有效方法，近年来抗菌水凝胶得到了研究者的广泛关注。
一般来说抗菌水凝胶是以水凝胶作为载体，负载抗菌药物或银纳米颗粒。抗菌药物的滥用会引起耐药性的问题，而银离子的生物安全性一直存在问题。现有抗菌水凝胶大多数在设计时只考虑了生物相容性和基本的力学性能，存在许多其他问题例如：制备成本过高、制备流程繁琐和反应条件过高等问题，不能比较全面的处理伤口问题。
因此，将具有抗菌性能的单体通过化学交联或者物理交联形成具有本体均一性的本征抗菌水凝胶材料，可以更加稳定持久地发挥抗菌性能。同时迫切需要进一步研究具有多重功能，全面的处理伤口问题且生物相容性较好的抗菌水凝胶，实现一体化解决上述问题，尽早应用于临床治疗当中。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法。
本发明另一目的在于提供上述方法制备得到的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
本发明再一目的在于提供上述聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶在生物医用材料领域中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，先把肝素(HP)和多巴胺(DA)加入水中混合，调节碱性含氧环境使多巴胺预聚，得到PDA-HP复合物；再依次加入丙烯酰胺(AM)和2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐(AEDMHA)，在引发剂和交联剂作用下自由基聚合得到聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-AEDMHA-PAM)。
所述肝素、多巴胺、丙烯酰胺和2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐的质量比优选为(5-20):(1-3):(50-500):(5-30)，更优选为(10-15):(1-2):(100-300):(10-20)。
所述肝素在水中的浓度优选为10-20mg/mL。
所述预聚的时间可为0.2-2h，更优选为0.2-1h。
所述的碱性优选pH为9-12。可通过加入氢氧化钠溶液调节体系为碱性，更优选使用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液调节。
所述的含氧环境可通过室温下搅拌实现。
所述先把肝素和多巴胺加入水中混合优选先把肝素加入水中搅拌溶解后再加入多巴胺搅拌溶解。
所述的引发剂可为聚合反应常规使用的引发剂，如过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠等，更优选使用过硫酸铵作为引发剂。所述引发剂的用量优选与丙烯酰胺的质量比为0.01:1-0.02:1，更优选为0.016:1。
所述的交联剂可为聚合反应常规使用的交联剂，如N,N-亚甲基双丙烯酰胺、聚乙二醇双丙烯酸酯、过氧化二异丙苯，更优选使用N,N-亚甲基双丙烯酰胺作用交联剂。所述交联剂的用量优选与丙烯酰胺的质量比为0.01:1-0.03:1，更优选为0.012:1。
使用引发剂时，还可以加入引发助剂，如四甲基乙二胺等。所述引发助剂的用量优选为反应体系总体积的0.1-0.5％，更优选为0.2％。
所述引发剂和交联剂加入体系后优选搅拌均匀，更优选搅拌1-5min。
本发明加入引发剂和交联剂后，溶液体系发生自由基聚合反应，生成得到PDA-HP-AEDMHA-PAM水凝胶。
本发明方法可具体包括以下步骤：
(1)将肝素加入水中搅拌溶解，再将多巴胺加入到溶液中搅拌溶解，形成DA-HP复合物，用NaOH溶液调节体系pH为9-12，并在室温下搅拌0.2-1h，使DA预聚形成PDA-HP复合物；
(2)将丙烯酰胺加入到步骤(1)中PDA-HP复合物溶液中，然后加入2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐，再加入引发剂、交联剂、引发助剂，搅拌均匀，体系发生自由基聚合反应生成聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
本发明制备方法先将多巴胺与肝素搅拌形成多巴胺-肝素复合物，在碱性含氧环境下诱导多巴胺聚合形成聚多巴胺，预聚反应时间短，避免了多巴胺的过度氧化，使水凝胶中保持了足够多的自由酚羟基，使得水凝胶具有较强的组织粘附性以及良好的细胞亲和力。再将丙烯酰胺和2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐加入到聚多巴胺-肝素溶液中，然后在引发剂和交联剂的作用下发生自由基聚合形成聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
本发明还提供上述方法制备得到的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶，其具有优异的力学性能、自粘附性和抗菌性能，且生物相容性好，可广泛应用于生物医用材料领域中。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明制备方法反应条件温和，制备所需时间短，操作简单且易于控制。
(2)本发明原料来源丰富，成本低。
(3)本发明通过自由基共聚的方式，构建集成多种功能组分的新型复合抗菌水凝胶——实现集力学性能、自粘附性和抗菌性能于一身的功能型水凝胶。
(4)本发明制备的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶具有良好的生物相容性，具有广泛的生物医用材料应用前景。
附图说明
图1为实施例1制得的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶冷冻干燥后的断面微观扫描电镜图。
图2为实施例4制得的聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-PAM)、聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-PAM)和聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺(PDA-HP-AEDMHA-PAM)水凝胶的压缩应力-应变图。
图3为实施例4制得的聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-PAM)、聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-PAM)和聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺(PDA-HP-AEDMHA-PAM)水凝胶的溶胀率图。
图4为实施例5制得的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-AEDMHA-PAM)对大肠杆菌(E.coil)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)抗菌效果图。其中，(a)为聚丙烯酰胺水凝胶(PAM)；(b)为聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-PAM)；(c)为聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-PAM)；(d)为聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-AEDMHA-PAM)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。实施例中各组分的用量以质量体积份计，g、mL。
实施例1
(1)称取13质量份肝素加入到1000体积份水中搅拌溶解，再将1质量份多巴胺加入到HP溶液中一起搅拌溶解，形成DA-HP复合物，用1mol/L的NaOH调节溶液体系pH＝11，并在室温下搅拌0.5h，在碱性含氧环境下DA预聚形成PDA-HP复合物。
(2)称取250质量份丙烯酰胺加入到步骤(1)中PDA-HP复合物溶液体系中，然后加入20质量份的2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐，再依次加入4质量份过硫酸铵、3质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入2体积份的四甲基乙二胺，搅拌3分钟后停止，溶液发生自由基聚合反应生成聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
对制得的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶冷冻干燥后进行断面扫描电镜观察，结果如图1所示。由图1可见，凝胶内部为多孔结构，该结构有利于为细胞的生长提供基质以及更方便地输送营养物质到细胞，让细胞更好的生长。
实施例2
(1)称取10质量份肝素加入到1000体积份水中搅拌溶解，再将3质量份多巴胺加入到HP溶液中一起搅拌溶解，形成DA-HP复合物，用1mol/L的NaOH调节溶液体系pH＝11，并在室温下搅拌0.2h，在碱性含氧环境下DA预聚形成PDA-HP复合物。
(2)称取100质量份丙烯酰胺加入到步骤(1)中PDA-HP复合物溶液体系中，然后加入10质量份的2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐，再依次加入2.5质量份过硫酸铵、2.5质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入2体积份的四甲基乙二胺，搅拌3分钟后停止，溶液发生自由基聚合反应生成聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
实施例3
(1)称取20质量份肝素加入到1000体积份水中搅拌溶解，再将2质量份多巴胺加入到HP溶液中一起搅拌溶解，形成DA-HP复合物，用1mol/L的NaOH调节溶液体系pH＝11，并在室温下搅拌1h，在碱性含氧环境下DA预聚形成PDA-HP复合物。
(2)称取500质量份丙烯酰胺加入到步骤(1)中PDA-HP复合物溶液体系中，然后加入30质量份的2-丙烯酰氧基-乙基-N,N-二甲基-6-溴化铵季铵盐，再依次加入5质量份过硫酸铵、7.5质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入5体积份的四甲基乙二胺，搅拌3分钟后停止，溶液发生自由基聚合反应生成聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶。
实施例4：聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶的力学性能及溶胀性能测试
(1)聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶的制备
称取0.01质量份的多巴胺加入到10体积份水中搅拌溶解，用1mol/L的NaOH调节溶液体系pH＝11，并在室温下搅拌30分钟，在碱性含氧环境下多巴胺预聚形成聚多巴胺。称取2.5质量份丙烯酰胺加入到上述溶液中，以终止DA的预聚，再依次加入0.04质量份过硫酸铵、0.027质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入0.02体积份的四甲基乙二胺，搅拌3分钟后停止，溶液发生自由基聚合反应生成聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-PAM)。
(2)聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶的制备
称取0.13质量份肝素加入到10体积份水中搅拌溶解，再将0.01质量份多巴胺加入到HP溶液中一起搅拌溶解，形成DA-HP复合物，用1mol/L的NaOH调节溶液体系pH＝11，并在室温下搅拌30分钟，在碱性含氧环境下DA预聚形成PDA-HP复合物。称取2.5质量份丙烯酰胺加入到上述溶液中，以终止DA的预聚，再依次加入0.04质量份过硫酸铵、0.027质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入0.02体积份的四甲基乙二胺，搅拌3分钟后停止，溶液发生自由基聚合反应生成聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-PAM)。
(3)对实施例1制备得到的水凝胶及上述步骤(1)和步骤(2)的水凝胶进行力学性能测试及溶胀性能测试：
力学性能测试：将上述三种水凝胶各取三个相同大小的样品，用电子万能试验机(型号为ELF3220)对三种水凝胶样品进行拉伸性能的测试，压缩速率为2mm/min，水凝胶压缩量为60％。取数据做应力-应变图，结果如图2所示。从图2可看出，本发明制备的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶弹性模量和压缩模量均强于其他两组水凝胶，其中压缩模量可高达56Kpa，为PDA-PAM水凝胶的14倍，PDA-HP-PAM水凝胶的4倍。由此可见，本发明的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶具有优异的力学性能，可满足伤口敷料的力学性能要求。
溶胀性能测试：将上述三种水凝胶各取三个相同大小的样品并将其冻干。称量样品原始重量并记录，将样品放入PBS缓冲液中进行溶胀率实验，然后置于37℃摇床振荡，隔一定的时间取出，用滤纸吸干水凝胶表面的水分并立即称重。分别在0min、15min、30min、45min、60min、90min、120min、150min、180min对样品进行称重，利用公式SR＝(Ws-Wd)/Wd×100％计算水凝胶溶胀率并作溶胀率-时间变化图。其中SR：溶胀率，Wd：初始冷冻干燥的水凝胶质量，Ws：溶胀后的水凝胶质量。结果见图3。从图3可以看出，本发明制备的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶为443.77％，为PDA-PAM水凝胶的1.29倍，PDA-HP-PAM水凝胶的1.07倍。由此可见，本发明的聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶具有优异的吸水溶胀性能，可吸收伤口渗透液，满足伤口敷料的要求。
实施例5：聚多巴胺-肝素/季铵盐/聚丙烯酰胺水凝胶的抗菌性能测试
(1)聚丙烯酰胺水凝胶的制备
称取2.5质量份丙烯酰胺加入到10体积份水中搅拌溶解，再依次加入0.04质量份过硫酸铵、0.027质量份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、最后加入0.02体积份的四甲基乙二胺，溶液发生自由基聚合反应生成聚丙烯酰胺水凝胶(PAM)。
(2)聚多巴胺/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-PAM)、聚多巴胺-肝素/聚丙烯酰胺水凝胶(PDA-HP-PAM)的制备同实施4的步骤(1)和步骤(2)。
(3)将实施例1制备得到的水凝胶与上述步骤(1)和步骤(2)的水凝胶进行抗菌性能测试(抑菌圈法)：
以PAM、PDA-PAM和PDA-HP-PAM水凝胶水凝胶为阴性对照组，PDA-HP-AEDMHA-PAM水凝胶为实验组。每个阴性对照组和实验组均设三个平行样。测试采用的两种细菌分别为为革兰氏阴性菌-大肠杆菌(E.coil)与革兰氏阳性菌-金黄色葡萄球菌(S.aureus)。具体实验步骤如下：
(A)按比例配制LB琼脂和LB肉汤；
(B)设置灭菌锅温度为121℃、灭菌时间为20分钟对LB肉汤和LB琼脂进行湿热灭菌；四种水凝胶样品在紫外照射下灭菌三小时；
(C)复苏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，经过两次传代以保持菌的活力，分别配制菌悬液，并把浓度稀释至106cfu/mL；
(D)在配制灭菌好的琼脂板上分别加入200μL的菌悬液(106cfu/mL)，涂布器涂布均匀，再依次将四种水凝胶样品等距离间隔放置在铺有菌悬液的琼脂板上，做好标记，置于37℃细菌培养箱培养18小时；
(E)18小时后取出并用游标卡尺测量抑菌圈大小，记录拍照。
测试结果如图4所示。游标卡尺量得各水凝胶对大肠杆菌抑菌圈大小依次为：PDA-HP-AEDMHA-PAM(19.3mm)＞PDA-HP-PAM(18.44mm)＞PDA-PAM(14.52mm)＞PAM(12.9mm)，均大于标准直径7.00mm；游标卡尺量得各水凝胶对金黄色葡萄球菌抑菌圈大小依次为：PDA-HP-AEDMHA-PAM(21.48mm)＞PDA-HP-PAM(19.02mm)＞PDA-PAM(15.6mm)＞PAM(13.2mm)，均大于标准直径7.00mm。由此可见，本发明的PDA-HP-AEDMHA-PAM水凝胶具有显著优异的抗菌性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
