用于通过用酶衍生化富含纤维素的膳食纤维来制备皮克林乳液形成颗粒的方法以及制得的乳液
技术领域
本发明涉及用于形成官能化膳食纤维的方法。本发明还涉及包含官能化膳食纤维和变性酶的组合物。本发明还涉及皮克林颗粒。本发明还涉及官能化膳食纤维和变性酶的用途，或涉及本发明的皮克林颗粒以稳定乳液，并且涉及乳液或包含所述乳液的产品。
背景技术
作为膳食纤维的主要来源的植物细胞壁由初生层和次生层组成，所述初生层和次生层由形成复杂网络的不同大分子组成(McDougall等人，1996Processing andFunction.Journal of the Science of Food and Agriculture,70(2)，第133-150页)。来自高等植物的初生壁主要由多糖组成(至多90重量/重量％的dm)，其中大多数对人肠道中的酶分解具有抗性，因此被称为膳食纤维。剩余的组分是相对小比例的结构糖蛋白(2-10％)、酚酯(<2％)、矿物质(1-5％)和酶。
纤维素代表主要细胞壁多糖。一般来讲，纤维素为由重复的β-1,4-葡糖基单元的直链组成的水不溶性均聚物。各个纤维素链紧密捆绑在一起形成微纤维，并且通过氢键保持在一起。纤维素的无定形区域和结晶区域的比率可变化，其中后者对水解具有很强的抗性。
果胶是一组不同的多糖，并且具有最复杂的结构(Vincken、Voragen和Beldman,2003Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan.In:J.Whitaker，A.Voragen和D.Wong编辑，Handbook of food enzymology，第1版，New York:MarcelDekker，第930-941页)。属于该组的结构是：同型半乳糖醛酸聚糖、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖1和2、木糖半乳糖醛酸聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖1和2(Bonin、Garnier和Ralet，2014Applied Microbiology and Biotechnology，98(2)，第519-532页)。根据植物或植物部位，果胶的类型可不同。
发明内容
根据第一方面，本发明提供了一种用于形成官能化膳食纤维的方法，所述方法包括将酶与膳食纤维的水性悬浮液混合，其中所述膳食纤维处于小于800微米、适当地小于500微米的D90粒度分布，并且包含小于25重量％的可溶性纤维和至少40重量％的纤维素，其中所述酶能够降解所述膳食纤维；使所述酶变性以形成包含官能化膳食纤维和变性酶的水性悬浮液。
根据另一方面，本发明提供了一种用于形成官能化膳食纤维的方法，所述方法包括将酶与膳食纤维的水性悬浮液混合，其中所述膳食纤维在被所述酶降解后处于小于30微米的D50粒度分布，并且包含小于25重量％可溶性纤维和至少40重量％纤维素；使所述酶变性以形成具有吸附酶的官能化两亲性膳食纤维。
根据本发明的另一方面，提供了通过根据本发明的方法可获得或获得的官能化膳食纤维和变性酶。
在另一方面，本发明提供了包含官能化膳食纤维和变性酶的皮克林颗粒。
在本发明的一个方面，提供了根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒用于稳定油包水乳液或水包油乳液的用途。
本发明还提供了一种水包油乳液或油包水乳液，其包含根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒。
本发明还提供了一种食物产品或美容化妆产品或护肤产品或药物产品或个人卫生产品或毛发定型产品，所述产品包含根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒(例如由其稳定)。
附图说明
现将参考附图仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1示出了用Bradford和Lowry方法测量的纯化酶和商业酶混合物的蛋白质含量。
图2示出了来自用商业酶混合物处理过的豌豆壳纤维(PHF)的上清液的HILIC色谱图。从上到下：PHF-Pec+Cell、PHF-Cell、PHF-Pec和对照(1:100稀释，对照1:10)。IS：内标(昆布三糖)。
图1示出了来自用商业酶混合物处理过的PHF分散体的上清液的HPAEC色谱图。
图2示出了PHF-Pec+Cell上清液的还原糖收率随反应时间的变化。
图5示出了用商业酶混合物处理的PHF水分散体的体积粒度分布。
图6示出经处理的PHF和对照在温育16小时后的光学显微图。A：对照，B:PHF-Cell，C:PHF-Pec，D:PHF-Pec+Cell。
图7示出PHF-Pec+Cell的基于体积的平均直径(d4,3)和基于表面积的平均直径(d3,2)随反应时间的变化。
图8示出了温育16小时后，经处理的PHF分散体(10重量/重量％)和对照的表观粘度随剪切速率的变化。测量在20℃下进行。
图9示出了在5秒时间范围内，a)油滴和b)水滴与PHF表面的接触角测角法的图示。在该示例中，通过将20mg经喷射研磨的Exafine-PHF压在胶带上来制备固体表面。
图10示出润湿，其定义为1g粉末状经酶促处理的PHF和对照完全浸没于10mLmilli-Q水中所需的时间(s)。
图11示出了由0.4重量/体积％经酶促处理的PHF(pH 5)制备的50％油/水乳液。对照包含在相同条件下在不添加酶的情况下处理的PHF，a)在一天后，b)在4周后。
图12示出了在制备后24小时，用PHF-Cell和PHF-Pec+Cell的可溶性相(a)和不溶性相(b)稳定的乳液。乳液在视觉上保持不变达四周。
图13示出了由PHF-Cell和PHF-Pec+Cell pH 5制备的50％乳液的油滴在制备后24小时的光学显微照片。比例尺：100μm。
图14示出了由PHF-Pec+Cell和PHF-Cell稳定的50％油/水乳液的CLSM图像(PHF颗粒呈现黄色)。红色和绿色信号分别对应于油相和水相。乳液已在成像之前制备，并且老化至少24小时。
图15示出了来自用商业酶混合物处理的PHF的上清液和沉淀物的SDS凝胶。
图16示出了在4周后在pH 5下仅用(A)热处理的PHF-BSA和(B)热处理的BSA稳定的50％油/水乳液。
图17示出了以不同的油：水比率制备的油/水乳液的样品。
图18示出了以22,000 1/min高剪切的20％水/油乳液的光学显微照片。
比例尺：50μm。
图19示出了根据表12制备的液体奶精。从左到右：奶精A、B、C、D、E和F。a)刚好在制备后，和b)制备后30分钟。
图20示出了以1:6的比率与液体奶精混合的咖啡。从左到右：奶精A、B、C、D、E、F。a)刚好在制备后，和b)制备后30分钟。
图21示出了用经
图22示出了用0.4重量/体积％AF-Pec+Cell稳定的50体积/体积％油/水乳液和对照。
图23示出了用0.4重量/体积％AF稳定的50体积/体积％油/水乳液和对照。
图24示出了用经D740 L处理的0.4重量/体积％WF稳定的50体积/体积％油/水乳液和对照
图25示出了在酶失活之前用调节至不同pH的0.4重量/体积％PHF稳定的50体积/体积％油/水乳液。HT：热处理
图26示出了厨房规模试验所得的巧克力慕斯的图片(顶视图)。
图27示出了厨房规模试验所得的巧克力慕斯的图片(前视图)。
图28示出了SEQ ID No.1，一种可从里氏木霉(Trichoderma reesei)获得的纤维二糖水解酶的多肽序列。
图29示出了SEQ ID No.2，一种可从里氏木霉获得的纤维二糖水解酶的多肽序列。
图30示出了SEQ ID No.3，一种可从棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)获得的聚半乳糖醛酸酶的多肽序列。
具体实施方式
本发明的开创性发现是，用能够降解膳食纤维的酶处理纤维素含量高且可溶性纤维含量低的膳食纤维，得到包含官能化膳食纤维和变性酶的组合物，所述组合物可用于稳定乳液。
本发明人首次示出根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶充当皮克林颗粒。
基于这些发现，我们提供了用于形成官能化膳食纤维的方法，所述方法包括将酶与膳食纤维的水性悬浮液混合，其中所述膳食纤维处于小于800微米、适当地小于500微米的D90粒度分布，并且包含小于25重量％的可溶性纤维和至少40重量％的纤维素，其中所述酶能够降解所述膳食纤维；使所述酶变性以形成包含官能化膳食纤维和变性酶的水性悬浮液。
在一个实施方案中，官能化膳食纤维和变性酶在变性酶和官能化膳食纤维之间形成相互作用，这导致皮克林颗粒的形成。本发明的酶可对作为底物的纤维具有亲和力(并因此结合于其上)。膳食纤维的酶降解可适当地减小其粒度。用于本发明的酶能够降解膳食纤维。官能化膳食纤维(例如膳食纤维颗粒)与一种或多种变性酶的组合表现出表面活性并且充当皮克林颗粒。官能化膳食纤维颗粒和一种或多种变性酶可形成官能化酶复合膳食纤维。根据本发明的官能化酶复合膳食纤维可充当皮克林颗粒。一种或多种酶可保持附接到官能化膳食纤维表面，从而用作将颗粒锚定到油/水或水/油界面的蛋白质性结构组分。
不希望受理论的束缚，膳食纤维例如PHF的乳液稳定特性可通过使用一种或多种具有纤维降解活性的酶减小粒度并诱导可暴露于水的纤维/颗粒的任何部分(包括颗粒表面和颗粒的暴露于水的内部区域)的两亲性来改善。诱导两亲性可增加颗粒的平均润湿性。不希望受理论的束缚，酶处理的目的可以为通过破坏纤维网络使得疏水基团在颗粒表面处变得暴露来改性颗粒表面(例如颗粒的可暴露于水的部分)的两亲性和尺寸。这可通过使用降解纤维素的无序无定形部分的酶来暴露结晶纤维素结构，或通过暴露存在于果胶主链上的疏水基团(甲酯、乙酰酯和阿魏酸酯)来实现。此外，与膳食纤维相关联的结构蛋白质可有助于增强官能化膳食纤维的表面活性。
在一些实施方案中，膳食纤维可不被酶降解或水解。然而，酶应当为能够水解膳食纤维的酶。能够水解膳食纤维的酶是对作为底物的膳食纤维具有亲和力并因此结合到膳食纤维的酶。
在一个实施方案中，酶为水解膳食纤维的酶。
在一个实施方案中，膳食纤维可用所述一种或多种酶水解至多24小时的时间段。
在一个实施方案中，可将膳食纤维水解约10分钟至约24小时。在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约30分钟至20小时，适当地4小时至20小时，适当地14小时至20小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约6小时至约24小时。在一些实施方案中，可将膳食纤维水解4-10小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解少于约8小时，例如以便减少此后可能发生的次级水解。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解至少30分钟，例如至少1小时、或至少4小时、或至少6小时、或至少10小时、或至少15小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约16小时。
在一个实施方案中，酶水解可将多糖组分水解成低聚糖，但可避免低聚糖完全分解成单糖。在一些实施方案中，继续该过程直至大约35-50％的多糖或35-50％的纤维素降解成单糖，适当地直至大约40-48％的多糖或40-48％的纤维素降解成单糖。
水解条件将是所使用的特定酶的最佳条件。这些通常在购买酶时示出，或通过实验确定。适当地，水解可在所用的一种或多种酶的最佳pH下进行。适当地，水解可在介于5和8之间的pH下进行。适当地，水解可在所用的一种或多种酶的最佳温度下进行。适当地，水解可在介于45℃和65℃之间的温度下进行。适当地，水解可在连续搅拌下进行。
适当地，膳食纤维的酶处理减小了粒度。换句话讲，官能化膳食纤维的粒度小于处理前膳食纤维的粒度。在一些实施方案中，酶处理可将膳食纤维的平均体积直径减小约十倍。
膳食纤维(例如，在处理之前)适当地具有小于800μm的D90粒度分布。
膳食纤维(例如，在处理之前或在处理之后)适当地具有小于500μm的D90粒度分布。
在一个实施方案中，膳食纤维(例如，在处理之前或在处理之后)可具有小于30μm的D90粒度分布。
在一个实施方案中，膳食纤维(例如，在处理之前或在处理之后)可具有小于10μm的D90粒度分布。
在一个实施方案中，膳食纤维(例如，在处理之前或在处理之后)可具有小于3μm的D90粒度分布。
膳食纤维(例如，在处理之前的起始膳食纤维)可通过任何合适的方式研磨成合适的D90粒度分布，例如小于800μm、或小于500μm、或小于30μm、或小于10μm或小于3μm。一种合适的方式可以是喷射研磨。以举例的方式，膳食纤维可在IKA M20间歇式研磨机(Milian，Switzerland)中以2000xg的恒定速度研磨10秒。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之前进行。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之后进行，例如在干燥所述水性悬浮液之后进行。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之前和之后进行。
当发生膳食纤维的研磨时，膳食纤维优选地处于相对干燥的状态。
本发明还提供了一种用于形成官能化膳食纤维的方法，所述方法包括将酶与膳食纤维的水性悬浮液混合，其中所述膳食纤维在被酶降解后处于小于30微米的D50粒度分布，并且包含小于25重量％可溶性纤维和至少40重量％纤维素；使所述酶变性以形成具有吸附酶的官能化两亲性膳食纤维。
官能化膳食纤维(例如膳食纤维颗粒)与一种或多种变性酶的组合表现出表面活性并且充当皮克林颗粒。一种或多种酶可保持附接到官能化膳食纤维表面，从而用作将颗粒锚定到油/水或水/油界面的蛋白质性结构组分。
不希望受理论的束缚，膳食纤维例如PHF的乳液稳定特性可通过使用一种或多种具有纤维降解活性的酶减小粒度并诱导可暴露于水的纤维/颗粒的任何部分(包括颗粒表面和颗粒的暴露于水的内部区域)的两亲性来改善。诱导两亲性可增加颗粒的平均润湿性。不希望受理论的束缚，酶处理的目的可以为通过破坏纤维网络使得疏水基团在颗粒表面处变得暴露来改性颗粒表面(例如颗粒的可暴露于水的部分)的两亲性和尺寸。这可通过使用降解纤维素的无序无定形部分的酶来暴露结晶纤维素结构，或通过暴露存在于果胶主链上的疏水基团(甲酯、乙酰酯和阿魏酸酯)来实现。此外，与膳食纤维相关联的结构蛋白质可有助于增强官能化膳食纤维的表面活性。
膳食纤维被酶降解或水解。水解膳食纤维的酶是对作为底物的膳食纤维具有亲和力并因此结合到膳食纤维的酶。
在一个实施方案中，膳食纤维可用所述一种或多种酶水解至多24小时的时间段。
在一个实施方案中，可将膳食纤维水解约10分钟至约24小时。在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约30分钟至20小时，适当地4小时至20小时，适当地14小时至20小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约6小时至约24小时。在一些实施方案中，可将膳食纤维水解4-10小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解少于约8小时，例如以便减少此后可能发生的次级水解。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解至少30分钟，例如至少1小时、或至少4小时、或至少6小时、或至少10小时、或至少15小时。
在一些实施方案中，可将膳食纤维水解约16小时。
在一个实施方案中，酶水解可将多糖组分水解成低聚糖，但可避免低聚糖完全分解成单糖。在一些实施方案中，继续该过程直至大约35-50％的多糖或35-50％的纤维素降解成单糖，适当地直至大约40-48％的多糖或40-48％的纤维素降解成单糖。
水解条件将是所使用的特定酶的最佳条件。这些通常在购买酶时示出，或通过实验确定。适当地，水解可在所用的一种或多种酶的最佳pH下进行。适当地，水解可在介于5和8之间的pH下进行。适当地，水解可在所用的一种或多种酶的最佳温度下进行。适当地，水解可在介于45℃和65℃之间的温度下进行。适当地，水解可在连续搅拌下进行。
膳食纤维的酶处理减小了粒度。换句话讲，官能化膳食纤维的粒度小于处理前膳食纤维的粒度。在一些实施方案中，酶处理可将膳食纤维的平均体积直径减小约十倍。
在一个实施方案中，处理后的膳食纤维可具有小于10μm的D50粒度分布。
在一个实施方案中，处理后的膳食纤维可具有小于3μm的D50粒度分布。
膳食纤维(例如，在处理之前的起始膳食纤维)可通过任何合适的方式研磨成合适的D50粒度分布，例如小于800μm、或小于500μm、或小于30μm、或小于10μm或小于3μm。一种合适的方式可以是喷射研磨。以举例的方式，膳食纤维可在IKA M20间歇式研磨机(Milian，Switzerland)中以2000xg的恒定速度研磨10秒。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之前进行。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之后进行，例如在干燥所述水性悬浮液之后进行。
在一个实施方案中，膳食纤维的研磨可在酶处理之前和之后进行。
当发生膳食纤维的研磨时，膳食纤维优选地处于相对干燥的状态。
不希望受理论的束缚，据信本发明的变性酶与尺寸减小的纤维形成两亲性复合物，从而向原本亲水的颗粒传递表面活性。
在一个实施方案中，适当地所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有小于约300μm的D90粒度分布。在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有小于约50μm的D90粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有小于约25μm的D90粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有约10μm或更小的D90粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有约3μm或更小的D90粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有小于约25μm的D50粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有约10μm或更小的D50粒度分布。
在一个实施方案中，所述官能化膳食纤维或皮克林颗粒具有约3μm或更小的D50粒度分布。
DP,3以长度(例如，微米)为单位测量，并且表示样品中颗粒占据的总体积的P％的粒径具有小于或等于针对该参数给出的长度的直径。因此，例如，如果D90,3＝1微米，则这意味着样品中90％的颗粒总体积由直径为1微米或更小的那些颗粒提供。
例如，体积平均粒度可通过以下方法测量，该方法使用Malvern光学仪器(Mastersizer 2000，Malvern，UK)通过激光衍射获得颗粒的平均体积直径。
在本发明的一些优选的实施方案中，本发明的和/或用于本发明的官能化膳食纤维颗粒也可具有双模态或单模态的体积粒度分布(Vol.PSD)。
在一些实施方案中，官能化膳食纤维或皮克林颗粒与油的尺寸比率(乳液中)可在1:10的范围内。换句话讲，在一些实施方案中，官能化膳食纤维(与变性酶组合)或皮克林颗粒应比它们稳定的油滴小至少一个数量级。
在一个实施方案中，根据本发明的方法包括干燥包含官能化膳食纤维和变性酶的所述水性悬浮液。
干燥可通过任何已知的适宜方式进行，包括喷雾干燥、真空干燥、滚筒干燥、冷冻干燥(或冻干)或超临界干燥。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒是冷冻干燥的。
根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒可以干燥状态使用。
根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒可以呈任何合适的形式。在一个实施方案中，本发明或根据本发明的皮克林颗粒可以呈颗粒或粉末的形式。
在一个优选的实施方案中，本发明或根据本发明的皮克林颗粒可以为粉末。
如本文所用，术语“皮克林颗粒”意指固体颗粒，其例如由于它们的润湿特性，吸附到乳液中介于油相和水相之间的界面上，以稳定乳液从而形成皮克林乳液。如本文所用，皮克林颗粒可意指在油/水界面处具有界面活性的颗粒。在本发明中，本发明的皮克林颗粒可稳定水包油乳液和油包水乳液两者。
一种或多种酶
适当地，用于本发明的酶可以为选自下列的一种或多种酶：内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切-果胶酸裂解酶、外切-果胶酸裂解酶和果胶裂解酶。
纤维素代表主要细胞壁多糖。一般来讲，纤维素为由重复的β-1,4-葡糖基单元的直链组成的水不溶性均聚物。各个纤维素链紧密捆绑在一起形成微纤维，并且通过氢键保持在一起。纤维素的无定形区域和结晶区域的比率可变化，其中后者对水解具有很强的抗性。
该非支化和均质的聚合物的解聚需要三种不同类型的酶：内切-1,4-β-葡聚糖酶(其将纤维素水解成低聚葡萄糖)；外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(其从纤维素和低聚葡萄糖释放纤维二糖)和β-葡萄糖苷酶(其将纤维二糖降解为葡萄糖)。纤维素不易接近细胞壁基质中的水解酶是其解构的关键障碍。为了使纤维素更易获得，可需要果胶降解酶和半纤维素降解酶的协同作用和/或合适的预处理。
果胶是一组不同的多糖，并且具有最复杂的结构(Vincken、Voragen和Beldman,2003Enzymes degrading rhamnogalacturonan and xylogalacturonan.In:J.Whitaker，A.Voragen和D.Wong编辑，Handbook of food enzymology，第1版，New York:MarcelDekker，第930-941页)。属于该组的结构是：同型半乳糖醛酸聚糖、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖1和2、木糖半乳糖醛酸聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖1和2(Bonin、Garnier和Ralet，2014Applied Microbiology and Biotechnology，98(2)，第519-532页)。根据植物或植物部位，果胶的类型可不同。
果胶被不同类型的果胶酶降解，所述果胶酶可根据它们的作用侧和降解类型进行区分。内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶和果胶/果胶酸裂解酶裂解平滑区域的主链。甲基酯酶和乙酰酯酶分别参与从半乳糖醛酸中移除甲醇和乙酰酯。
在一个实施方案中，适当地，用于本发明的酶可为包含多于一种酶或多于一种酶活性的酶组合物。
在一个实施方案中，优选地，用于本发明的酶包含选自下列的两种或更多种酶活性：内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切-果胶酸裂解酶、外切-果胶酸裂解酶和果胶裂解酶。
在本发明中，作用于纤维素的一种或多种酶(例如内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶中的一种或多种)可与一种或多种果胶降解酶(例如，内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切-果胶酸裂解酶、外切-果胶酸裂解酶和果胶裂解酶中的一种或多种)联合使用。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种酶是包含内切-1,4-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的酶混合物。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种酶是包含纤维二糖水解酶活性的酶混合物。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种酶是包含内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活性的酶混合物。
在一个实施方案中，用于本发明的一种或多种酶为包含选自下列的酶活性中的一种或多种的酶混合物：内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切-果胶酸裂解酶、外切-果胶酸裂解酶和果胶裂解酶。
在本发明的一个实施方案中，包含内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡萄糖苷酶中的两种或更多种的酶混合物可与一种或多种果胶降解酶(例如，内切-聚半乳糖醛酸酶、外切-聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切-果胶酸裂解酶、外切-果胶酸裂解酶和果胶裂解酶中的一种或多种)联合使用。
在本发明的一个实施方案中，包含内切-1,4-β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡萄糖苷酶中的两种或更多种的酶混合物可与聚半乳糖醛酸酶(例如内切-聚半乳糖醛酸酶或外切-聚半乳糖醛酸酶)联合使用。
在本发明的一个实施方案中，包含纤维二糖水解酶的酶混合物可与聚半乳糖醛酸酶(例如内切-聚半乳糖醛酸酶或外切-聚半乳糖醛酸酶)联合使用。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可为包含(或具有或由其组成)下列多肽序列的一种或多种酶：在本文中示为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的多肽序列或与其具有至少70％同一性的多肽序列。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可为包含(或具有或由其组成)下列多肽序列的一种或多种酶：在本文中示为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的多肽序列或与其具有至少80％同一性的多肽序列。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可为包含(或具有或由其组成)下列多肽序列的一种或多种酶：在本文中示为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的多肽序列或与其具有至少90％同一性的多肽序列。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可为包含(或具有或由其组成)下列多肽序列的一种或多种酶：在本文中示为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的多肽序列或与其具有至少95％同一性的多肽序列。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可以为具有纤维二糖水解酶活性的多肽，其包含(或具有或由其组成)本文示为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的多肽序列或含氨基酸中至少一个的保守置换的氨基酸序列；或与其具有至少70％同一性的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的变体、同源物或衍生物。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可以为具有聚半乳糖醛酸酶活性的多肽，其包含(或具有或由其组成)本文示为SEQ ID NO.3的多肽序列或含氨基酸中至少一个的保守置换的氨基酸序列；或与其具有至少70％同一性的SEQ ID NO.3的变体、同源物或衍生物。
在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种酶可由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID No.3的多肽序列或含氨基酸中至少一个的保守置换的氨基酸序列；或与其具有至少70％同一性的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID NO.3的变体、同源物或衍生物。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的所述一种或多种酶可以为下列的组合：在本文中示为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的多肽或含氨基酸中至少一个的保守置换的氨基酸序列；或与其具有至少70％同一性的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的变体、同源物或衍生物，以及具有聚半乳糖醛酸酶活性的多肽，其包含(或具有或由其组成)在本文中示为SEQ ID No.3的多肽序列或含氨基酸中至少一个的保守置换的氨基酸序列；或与其具有至少70％同一性的SEQ ID NO.3的变体、同源物或衍生物。
在一个实施方案中，该酶为内切-1,4-β-葡聚糖酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，内切-1,4-β-葡聚糖酶可被表征为具有E.C.3.2.1.4。该酶将纤维素、地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖中的(1→4)-β-D-葡糖苷键内切水解。该酶的其他名称可包括纤维素酶、β-1,4-葡聚糖酶；β-1,4-内切葡聚糖水解酶；纤维素酶A；纤维质AP；内切葡聚糖酶D；碱性纤维素酶；纤维素酶A 3；纤维素糊精酶；9.5纤维素酶；微晶纤维素酶；pancellase SS；1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。该酶的系统名称为4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。
在一个实施方案中，酶为β-葡萄糖苷酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，β-葡萄糖苷酶可被表征为具有E.C.分类3.2.1.21。在一些实施方案中，该酶水解末端非还原性β-D-葡糖基残基并释放β-D-葡萄糖。该酶的其他名称可包括龙胆二糖酶；纤维二糖酶；苦杏仁酶；弹丝酶；芳基-β-葡萄糖苷酶；β-D-葡萄糖苷酶；β-葡糖苷葡糖水解酶；熊果苷酶；扁桃酶；对硝基苯基β-葡萄糖苷酶；樱草苷酶；苦杏仁苷酶；亚麻苦苷酶；salicilinase；β-1,6-葡萄糖苷酶。该酶的系统名称为β-D-葡糖苷葡糖水解酶。在一个实施方案中，酶可以为使用碳水化合物活性酶数据库(www.CAZy.org)分类的GH3酶。
在一个实施方案中，该酶为纤维二糖水解酶。纤维二糖水解酶可以为纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶(非还原端)。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，纤维二糖水解酶可被表征为具有E.C.分类3.2.1.91。在一些实施方案中，该酶水解纤维素和纤维四糖中的(1→4)-β-D-葡糖苷键，从而从链的非还原端释放纤维二糖。该酶的其他名称可包括外切-纤维二糖水解酶；β-1,4-葡聚糖纤维二糖水解酶；β-1,4-葡聚糖纤维二糖基水解酶；1,4-β-葡聚糖纤维二糖苷酶；外切葡聚糖酶；微晶纤维素酶；CBH 1；C1纤维素酶；纤维二糖水解酶I；纤维二糖水解酶；外切-β-1,4-葡聚糖纤维二糖水解酶；1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶；纤维二糖苷酶。该酶的系统名称为4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(非还原端)。
在一个实施方案中，所述酶为内切-聚半乳糖醛酸酶。在一个实施方案中，所述酶为内切-1,4-α-聚半乳糖醛酸酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，内切-1,4-α-聚半乳糖醛酸酶可被表征为具有E.C.分类3.2.1.15。在一些实施方案中，该酶水解果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中的(1→4)-α-D-半乳糖苷醛酸键。该酶的其他名称可包括聚半乳糖醛酸酶、果胶去聚合酶；果胶酶(pectinase)；内切聚半乳糖醛酸酶；果胶酶(pectolase)；果胶水解酶；果胶聚半乳糖醛酸酶；内切-聚半乳糖醛酸酶；聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶；内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶；聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。该酶的系统名称为(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖-聚糖水解酶。
在一个实施方案中，酶为外切-聚半乳糖醛酸酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，外切-聚半乳糖醛酸酶可被表征为具有E.C.分类3.2.1.67。在一些实施方案中，该酶水解以下反应：[(1→4)-α-D-半乳糖醛酸苷]n+H2O＝[(1→4)-α-D-半乳糖醛酸苷]n-1+D-半乳糖醛酸酯。该酶的其他名称可包括半乳聚糖1,4-α-半乳糖醛酸酶；聚(半乳糖醛酸酯)水解酶；外切-D-半乳糖醛酸酶；外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶；外切聚-D-半乳糖醛酸酶；聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。该酶的系统名称为聚[(1→4)-α-D-半乳糖醛酸苷]半乳糖醛酸水解酶。
在一个实施方案中，所述酶为果胶-甲基酯酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，果胶-甲基酯酶可被表征为具有E.C.分类3.1.1.11。在一些实施方案中，该酶水解以下反应：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸酯。该酶的其他名称可包括果胶脱甲氧基酶：果胶甲氧基酶；果胶甲酯酶。该酶的系统名称为果胶甲酯酶(pectinpectylhydrolase)。
在一个实施方案中，所述酶为内切-果胶酸裂解酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，内切-果胶酸裂解酶可被表征为具有E.C.分类4.2.2.2。在一些实施方案中，该酶水解以下反应：消除裂解(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖以得到在其非还原端具有4-脱氧-α-D-半乳糖基-4-烯醛酸糖基基团的低聚糖。该酶的其他名称可包括α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶；内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶；内切半乳糖醛酸反式消除酶；内切果胶甲基反式消除酶；果胶酸酯反式消除酶；果胶酸裂解酶；果胶酸反式消除酶；果胶裂解酶；果胶反式消除酶；PGA裂解酶；聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonatelyase)；聚半乳糖醛酸裂解酶(polygalacturonic acid lyase)；聚半乳糖醛酸反式消除酶(polygalacturonic acid trans-eliminase)；聚半乳糖醛酸反式消除酶(polygalacturonic transeliminase)；PPase-N。该酶的系统名称为(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在一个实施方案中，所述酶为外切-果胶酸裂解酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，外切-果胶酸裂解酶可被表征为具有E.C.分类4.2.2.9。在一些实施方案中，该酶水解以下反应：从果胶酸(即脱酯化果胶)的还原端消除裂解4-(4-脱氧-α-D-半乳糖基-4-烯醛酸糖基)-D-半乳糖醛酸酯。该酶的其他名称可包括外切-PATE；外切-PGL；外切果胶酸裂解酶；外切果胶酸反式消除酶；外切聚半乳糖醛酸裂解酶；外切聚半乳糖醛酸反式消除酶；PATE；果胶酸外切裂解酶；该酶的系统名称为(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原端二糖裂解酶。
在一个实施方案中，该酶为果胶裂解酶。根据国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的酶命名建议，果胶裂解酶可被表征为具有E.C.分类4.2.2.10。在一些实施方案中，该酶水解以下反应：消除裂解(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲酯，以得到在其非还原端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖基-4-烯醛酸糖基基团的低聚糖。该酶的其他名称可包括内切-果胶裂解酶；果胶甲基反式消除酶；果胶反式消除酶；果胶裂解酶；PL；PMGL；PNL；聚甲基半乳糖醛酸反式消化酶。该酶的系统名称为(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在一个实施方案中，可根据实施例部分的部分1.2.1中示出的酶测定法测量酶活性。
在一个实施方案中，该酶可选自：
在一个实施方案中，适当地，酶可以为
在一个实施方案中，所述酶可为包含多于一种酶活性的酶复合物。
本发明的方法提供了变性的一种或多种酶。不希望受理论的束缚，呈其活性和可溶形式的一种或多种酶与官能化膳食纤维的组合未表现出任何乳化特性。然而，当一种或多种酶灭活或变性时，其变成表面活性剂，并且在存在官能化膳食纤维的情况下使乳液稳定。不希望受理论的束缚，一种或多种变性酶可与官能化膳食纤维形成两亲性复合物，从而向原本亲水的纤维颗粒传递表面活性。数据表明一种或多种酶与官能化膳食纤维结合，因为酶不被可溶相萃取，并且可通过SDS PAGE在不溶相中测量。
一种或多种酶可通过任何合适的方式变性，例如通过加热，诸如将温度升高至60℃以上，例如100℃并持续10分钟；或通过pH的极端条件，例如碱处理，诸如通过将pH增加至9以上来变性。
在一个实施方案中，本发明的官能化膳食纤维和变性酶或本发明的皮克林颗粒以高于0.25mg变性酶：1g油的比率包含变性酶。
在一个实施方案中，可将酶选择成在产品应用的pH范围内具有最佳pH的酶。这可确保最终产品中抗絮凝的稳定性。
膳食纤维
本发明涉及用于形成官能化膳食纤维的方法。
本发明包括将酶与膳食纤维混合，所述膳食纤维处于小于800微米的D90粒度分布并且包含至少40重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少50重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少55重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少60重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约40-98重量％之间的纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约50-80重量％之间的纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约60-75重量％之间的纤维素。
本发明包括将酶与膳食纤维混合，所述膳食纤维处于小于30微米的D50粒度分布并且包含至少40重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少50重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少55重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有至少60重量％纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约40-98重量％之间的纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约50-80重量％之间的纤维素。
在一个实施方案中，膳食纤维可具有介于约60-75重量％之间的纤维素。
在一个实施方案中，根据本发明的膳食纤维可以为植物壳纤维。在另一个实施方案中，膳食纤维可来自蔬菜或水果的富含纤维的部位。
植物的壳或外壳是种子的外壳或包衣。外壳或壳包括种子、水果或蔬菜的保护性外覆层。豆类和一些类似果实的外壳可称为荚。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于25重量％可溶性纤维的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于20重量％可溶性纤维的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于15重量％可溶性纤维的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于10重量％可溶性纤维的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于25重量％可溶性纤维和至少40重量％纤维素的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于20重量％可溶性纤维和至少50重量％纤维素的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于15重量％可溶性纤维和至少55重量％纤维素的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维可以为包含小于10重量％可溶性纤维和至少60重量％纤维素的任何植物壳纤维。
在一个实施方案中，植物壳纤维选自豌豆壳纤维、豆壳(例如兵豆、菜豆)、竹纤维、可可纤维和咖啡纤维。植物壳纤维可以为豌豆壳纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维可根据味道以及其他特征来选择。以举例的方式，膳食纤维可以为具有中性味道的纤维或无味道的纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维可根据颜色以及其他特性来选择。以举例的方式，膳食纤维可以为颜色浅或颜色中性或无色的纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维可根据气味以及其他特性来选择。以举例的方式，膳食纤维可以为无气味的纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维不是小麦麸皮(或小麦纤维)。
在一个实施方案中，膳食纤维不是苹果渣或苹果纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维不是车前子。
在一个实施方案中，膳食纤维不是高可溶性果胶纤维，例如，膳食纤维可以为具有少于50％可溶性果胶的膳食纤维。
在一个实施方案中，膳食纤维不是低纤维素含量的纤维，例如不是具有小于60重量％纤维素的膳食纤维。
如本文所用，术语“官能化的”意指膳食纤维通过与酶混合而被改性(例如，通过本发明的方法)，以在与变性酶组合时具有乳液稳定特性。如本文所用，术语“官能化的”可意指能够提供例如水包油乳液稳定剂的功能。如本文所用，术语“官能化的”可意指膳食纤维被改性(例如，通过本发明的方法)以形成皮克林颗粒。不希望受理论的束缚，膳食纤维例如PHF可通过使用一种或多种具有纤维降解活性的酶减小粒度并在颗粒表面处诱导两亲性来改性。
豌豆(Pisum sativum L.)是复合碳水化合物的丰富来源，并且作为具有商业价值的富含纤维的副产品已经引起人们的兴趣(Weightman等人，1995年)。总膳食纤维的量以及纤维素多糖和非纤维素多糖的相对含量取决于它们在豌豆的子叶或壳中的定位(Guillon&Champ 2002)。在该研究中，我们选择使用来自黄豌豆(Exafine，Cosucra)的商业豌豆壳纤维制剂，因为其总膳食纤维含量通常较高并且由于淀粉和蛋白质污染物较少(参见表A)。
表A：可商购获得的豌豆壳纤维的组成，按dm的重量/重量％计(如由Guillon&Champ，2002所综述的)
a可消化的多糖、低聚糖和单糖
如本文所用，术语“纤维”意指包含抵抗消化酶作用的物质诸如纤维素、木质素和果胶的膳食材料。
可能期望详细了解纤维的化学结构，以便针对其降解选择最佳的酶制剂。豌豆壳的细胞壁由基于干重计大约69重量/重量％的纤维素、16.8重量/重量％的果胶和7.5重量/重量％的半纤维素组成(Reichert，1982)，这与若干研究中报道的中性糖组成一致(参见表B)。豌豆壳仅具有较差的木质化(<1.5重量/重量的dm)，因此认为其不具有大量的次生细胞壁(Weightman等人，1995Carbohydrate Polymers，26，第121-128页；Reichert 1981CerealChemistry,58(4)，第266-270页)。
表B：豌豆壳的组成(mg/g)(Weightman等人，1995CarbohydratePolymers,26，第121-128页)
and，未检出
bAUA，脱水糖醛酸
除了富含纤维素之外，豌豆壳还包含显著量的果胶和半纤维素。来自豌豆壳的果胶级分包含同型半乳糖醛酸聚糖区域和鼠李糖基半乳糖醛酸聚糖区域两者，其具有非常复杂和多样的侧链，主要由阿拉伯糖基、半乳糖基和木糖基残基组成。在豌豆壳中，鼠李糖基残基以(1→2)-连接形式、(1→2,4)-连接形式和末端形式出现(Renard等人，1997年)。据报道，具有与1型和2型(阿拉伯糖基)半乳聚糖缔合的1→5连接的阿拉伯聚糖是鼠李糖基半乳糖醛酸聚糖最常见的特征。阿拉伯聚糖也以其游离形式存在于豌豆壳中(Weightman等人；1995Carbohydrate Polymers，26，第121-128页；Renard等人，1997(参见下文)；Ralet等人，1993(参见下文))。糖醛酸主要由半乳糖醛酸组成，半乳糖醛酸/葡糖醛酸比率为97:3(Weightman等人，1994Carbohydrate Polymers，24(2)，第139-148页)。据报道，来自豌豆壳的同型半乳糖醛酸聚糖级分具有相对较低的甲基化程度(约12-50)，并且是高度乙酰化的，这将它们与通常存在于果实初生细胞壁中的高度甲基化的果胶区分开来(Weightman等人；1995Carbohydrate Polymers，26，第121-128页；Le Goff等人，2001CarbohydratePolymers，45(4)，第325-334页；Weightman等人，1994Carbohydrate Polymers，24(2)，第139-148页)。若干研究还报导了豌豆壳中显著量的木糖半乳糖醛酸聚糖(18mg/g)，其中木糖基单元作为单个单元或短侧链存在于半乳糖醛酸主链上(Le Goff等人，2001Carbohydrate Polymers，45(4)，第325-334页；Weightman等人，1995CarbohydratePolymers，26，第121-128页；Ralet等人，1993Biochemical Engineering Journal，16(2)，第191-201页；Renard等人，1997International Journal of BiologicalMacromolecules，21(1-2)，第155-162页)。甲基化分析鉴定了(1,4)-和(1,3,4)-连接的半乳糖醛酸残基和末端木糖基残基，从而表明半乳糖醛酸聚糖主链在O-3上被木糖置换。此外，鉴定了(1→2)-连接的木糖的一些低聚侧链。据报道木糖与半乳糖醛酸的摩尔比为0.76(Le Goff等人，2001Carbohydrate Polymers，45(4)，第325-334页)。木糖半乳糖醛酸聚糖可被认为是果胶须状区的亚级分(Schols等人，1995Carbohydrate Research，279，第265-279页)。
木聚糖是存在于豌豆壳中的最丰富的半纤维素(Weightman等人；1994Carbohydrate Polymers，24(2)，第139-148页；Tosh&Yada 2010Food ResearchInternational，43(2)，第450-460页)。存在于豌豆壳中的木聚糖主要是具有(1→4)-β-D-木聚糖主链的酸性木聚糖(其在O-2处具有很少的支化点)，以及阿拉伯木聚糖(Banerji&Rao 1963Structural Studies On An Arabinoxylan From Pea Skin(Pisum Sativum):Part I.Methylation Studies.Canadian Journal of Chemistry，41(11)，第2844-2848页；Renard等人，1997International Journal of Biological Macromolecules，21(1-2)，第155-162页；Weightman等人，1994Carbohydrate Polymers，24(2)，第139-148页；Ralet等人，1993Biochemical Engineering Journal，16(2)，第191-201页)。从豌豆壳提取的半纤维素级分中的阿拉伯糖与木糖的比率为0.36(Ralet等人；1993，出处同上)。少量木葡聚糖的存在也由Weightman等人示出(1994Carbohydrate Polymers，24(2)，第139-148页)，但这些结构更经常存在于豌豆的子叶中(Hayashi&MacLachlan 1984Plant Physiology，75(3)，第596-604页)。
乳液
乳液是两种不混溶的流体(在大多数情况下为水(w)和油(o))的混合物，其中油相以油滴的形式分散在水相中(油/水乳液)，或者其中水滴分散在油相中(水/油乳液)。乳液是热力学不稳定的体系(Floury、Desrumaux和Lardières,2000Innovative Food Science&Emerging Technologies，1(2)，第127-134页)。吸附在油/水界面处的两亲性蛋白质或低分子量乳化剂(LMWE)最常用于通过降低表面张力来延迟乳液的热力学驱动相分离。
包括PHF在内的天然存在的纤维材料主要是亲水性的，并且因此不具有在油-水界面处吸附的趋势。当用作水解胶体时，纤维通常以高浓度添加到油/水乳液中，其中它们使水连续相增稠/胶凝的能力物理地捕集油滴，从而减慢油滴的膏化和聚结。
皮克林颗粒需要对于两相都具有足够的尺寸和可润湿性，以便在界面处吸附。表征材料的可润湿性的最常见技术是测量液体界面与固体形成的接触角。该测量的原理基于杨氏方程ylvcosθY＝ysv-ysl，其中ylv、ysv和ysl分别表示液体-蒸气、固体-蒸气和固体-液体界面张力，并且θY是接触角(Bracco和Holst，2013Surface Science Techniques，第51版，Heidelberg:Springer)。粒度并且尤其是其接触角将确定颗粒在界面处的位置，其限定此类颗粒从界面解吸所需的能量。由于具有足够的接触角(30°<θY<150°)，10nm以上的所有颗粒的解吸能可以为几千kT，因此颗粒被认为不可逆地附接(Hunter等人，2008Advances inColloid and Interface Science，137(2)，第57-81页)，从而为乳液提供长期稳定性。
不希望受理论的束缚，膳食纤维(植物壳纤维)结构组分，如结晶纤维素和果胶主链上的疏水性甲基酯、乙酰基酯、和阿魏酸酯可通过根据本发明的酶处理而暴露于颗粒表面，并因此赋予原本非常亲水的表面一定程度的两亲性。
根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒可用于稳定和乳化。乳液可以为水包油(油/水)乳液或油包水(水/油)乳液或油连续分散体或复乳液(例如水/油/水)。
本发明提供了一种水包油乳液或油包水乳液，其包含根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒。
在一个实施方案中，根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒可与另一种乳化剂例如酪蛋白酸钠联合使用。
在一个实施方案中，根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒包含显著量的蛋白质，例如大于0.5mg/1g油，诸如介于0.6mg/1g油和0.9mg/1g油之间。
用途
本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒可用于稳定乳液，例如油包水乳液或水包油乳液。
乳液可以为用于任何产品中的乳液，诸如用于食物产品或美容化妆产品或药物产品中的乳液。
本发明还提供了食物产品或美容化妆产品或护肤产品或药物产品或个人卫生产品或毛发定型产品，所述产品包含根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒。
根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒使乳液稳定。
如本文所用，所谓“稳定”意指根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒例如通过液滴的聚结延迟乳液分离成水相和油相。在一个实施方案中，可考虑乳液抵抗塌缩的稳定性。
食物产品或美容化妆产品或护肤产品或药物产品或个人卫生产品或毛发定型产品可包含根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或根据本发明的皮克林颗粒，并且由其稳定。
食物产品
本发明的皮克林颗粒或根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶可用于食物乳液，例如通常不混溶的两种或更多种液体的混合物。
此处，术语“食物”广义地使用，并且涵盖人类的食物以及动物的食物(即饲料)。在一个优选的方面，食物用于人类食用。
乳液可以为水包油乳液或油包水乳液或油连续分散体或复乳液(例如水/油/水)。其中可使用本发明的食物乳液的示例包括油醋汁、匀化牛奶、调味汁(例如蛋黄酱或荷兰辣酱油)、汤、浓缩咖啡中的咖啡脂层(泡沫)、乳制品乳液和基于植物的乳液诸如大豆饮料。
护肤产品
本发明的皮克林颗粒或根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶可用于护肤产品中。
所述护肤产品可为包含乳液的任何产品。
护肤产品可以为例如清洁霜膏、防护霜膏、治疗霜膏或护理霜膏；防紫外线防晒霜；护肤洗剂，诸如清洁洗剂或消毒洗剂；或保湿剂。
本发明的护肤产品可以为包含其他成分的组合物，所述其他成分包括乳木果油、可可油、椰子油、向日葵油和坚果仁油(诸如杏仁油)。
当本发明的组合物为乳液时，相对于所述组合物总重量，脂肪相的比例可在5重量％至80重量％，并且优选地10重量％至50重量％的范围内。
药物产品、毛发定型产品、个人卫生和美容化妆产品
在药物产品、毛发定型产品、个人卫生和美容化妆产品中，经常使用乳液。这些乳液可被称为霜膏、软膏剂、搽剂(香膏)、糊剂、膜或液体，这主要取决于它们的油水比率、其他添加剂、及其预期的给药途径。
乳液可以为局部剂型，并且可经皮、经眼、经直肠或经阴道用于皮肤表面上。
高度液体乳液也可口服使用，或在一些情况下可注射。
以乳液形式存在的流行药物包括例如鳕鱼肝油、复方多粘菌素(Polysporin)、皮质醇霜膏或克霉唑。
核苷酸序列
如本文所用，术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，以及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组起源的或合成起源的或重组起源的，其可以是双链的或单链的(无论代表有义链还是反义链)。
与本发明有关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选地，其意指编码本发明的DNA，更优选地cDNA序列。
核苷酸序列的制备
编码本发明的酶的核苷酸序列可从产生所述蛋白质的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。用于核苷酸序列的鉴定和/或分离和/或纯化的多种方法是本领域熟知的。以举例的方式，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了合适的序列，就可以使用PCR扩增技术来制备更多的序列。
以另外举例的方式，可使用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该酶的氨基酸序列是已知的，则可合成标记的寡核苷酸探针并将其用于从由该生物体制备的基因组文库中鉴定编码酶的克隆。作为另外一种选择，含有与另一已知酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针可用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
作为另一种选择，编码该酶的核苷酸序列可通过确立的标准方法合成制备，例如由Beucage S.L.等人，(1981)Tetrahedron Letters 22，第1859-1869页所述的亚磷酰胺方法，或由Matthes等人，(1984)EMBO J.3，第801-805页所述的方法。在亚磷酰胺方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，将其纯化、退火、连接并在适当的载体中克隆。
氨基酸序列
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
氨基酸序列可从合适的来源制备/分离，或者其可合成制备，或者其可通过使用重组DNA技术制备。
序列同一性或序列同源性
本发明还涵盖与具有本文所定义的特定性质的多肽的一种或多种氨基酸序列或编码此类多肽的任何核苷酸序列具有一定程度的序列同一性的序列的用途。
氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留功能活性的多肽。
在一些实施方案中，氨基酸序列或核苷酸序列可与主题序列具有至少75％、85％或90％的同一性，优选地至少95％或98％的同一性。通常，具有百分比同一性的序列将包含与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等。
在一个实施方案中，可认为具有百分比同一性的序列包括与主题序列相比具有一个或多个添加、缺失和/或置换的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明涉及其氨基酸序列在本文中被表示的蛋白质(或涉及编码其氨基酸序列在本文中被表示的蛋白质的核酸序列(或基因))，或通过该(亲本)蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸(诸如2、3、4、5、6、7、8、9个氨基酸，或更多个氨基酸，诸如10个或多于10个氨基酸)的置换、缺失或添加而衍生自亲本蛋白并具有亲本蛋白的活性的蛋白质。
适当地，关于氨基酸序列或核苷酸序列的同一性程度是在至少20个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少30个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少40个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少50个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少60个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少100个连续氨基酸/核苷酸上，优选地在至少200个连续氨基酸/核苷酸上测定的。
适当地，关于氨基酸序列或核苷酸序列的同一性程度是在氨基酸序列或核苷酸序列的整个长度上测定的。
同一性比较可通过肉眼进行，或更通常地，借助于易得序列比较程序进行。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的同源性％。
同一性％可在连续的序列上计算，即将一条序列与另一条序列进行比对，并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这称为“无空位”比对。通常，此类无空位比对仅在相对短数目的残基范围内进行。
尽管这是十分简单和一贯的方法，但其未能考虑例如在原本相同的序列对中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基不再对齐，从而在进行全局比对时可能导致同源性％有大的降低。因此，大多数序列比较方法被设计为产生最佳比对，所述最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会过度罚掉整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
然而，这些更复杂的方法向比对结果中出现的每个空位赋予“空位罚分”，使得对于同样数目的相同氨基酸，具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间具有较高的相关性)将获得比具有许多空位的序列比对结果更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap cost)”，其对空位的存在收取相对较高的成本，对空位中每一个后续残基收取较少的罚分。这是最通常使用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有较少空位的最佳比对结果。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。
因此，最大同一性％的计算首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。用于进行此类比对的合适计算机程序是Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可进行序列比较的软件的示例包括但不限于，例如BLAST软件包(参见Ausubel等人，1999Short Protocols inMolecular Biology，第4版-第18章)、BLAST 2(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA(Altschul等人，1990J.Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于离线和在线搜索(参见Ausubel等人，1999，第7-58页至第7-60页)，例如用于GenomeQuest搜索工具中(www.genomequest.com)。
尽管最终的同一性％也可以同一性来量度，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的(all-or-nothing)成对比较。相反，通常使用标度化相似性评分矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离向每一成对比较赋予分值。通常使用的此类矩阵的示例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公共默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(关于进一步的细节参见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。
作为另外一种选择，同源性百分比可使用Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征计算，该特征基于类似于CLUSTAL(Higgins DG&Sharp PM(1988),Gene 73(1),237-244)的算法。
一旦该软件产生了最佳比对，就可计算同源性％，优选地序列同一性％。作为序列比较的一部分，该软件通常进行这些计算并产生数值结果。
如果在测定序列同一性时使用空位罚分(Gap Penalties)，则优选地将以下参数用于成对比对：
在一个实施方案中，CLUSTAL可与如上定义的空位罚分和空位延伸组一起使用。
在本发明的上下文中，术语“查询序列”意指同源序列或外来序列，其与主题序列比对以便查看其是否落入本发明的范围内。因此，此类查询序列可例如为现有技术序列或第三方序列。
在一个优选的实施方案中，通过全局比对程序对序列进行比对，并通过识别由程序所识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算序列同一性。
在一个实施方案中，查询序列和主题序列之间的序列同一性程度通过如下步骤测定：1)通过任何合适的比对程序，使用默认计分矩阵和默认空位罚分，对两条序列进行比对，2)鉴定精确匹配的数目，其中精确匹配是比对程序已在比对时在给定位置上在两个比对序列中鉴定出相同的氨基酸或核苷酸的情况，以及3)将精确匹配的数目除以主题序列的长度。
在又一个优选的实施方案中，全局比对程序选自CLUSTAL和BLAST(优选地BLAST)，并且序列同一性通过识别由程序所识别的精确匹配数除以主题序列的长度来计算。
序列还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即所述缺失、插入或置换产生沉默变化并且得到功能上等同的物质。还可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲特性的相似性做出有意的氨基酸置换，只要保留物质的次级结合活性即可。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且包含具有相似亲水性值的不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
保守置换可例如根据下表进行。第二列同一格中的氨基酸，优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：
本发明还涵盖可发生的同源置换(置换和替代在本文中均用于意指现有氨基酸残基与另选残基的互换)，即对等置换，诸如碱性置换为碱性、酸性置换为酸性、极性置换为极性等。非同源置换也可以发生，即从一类残基置换为另一类残基，或者作为另外一种选择涉及包括非天然氨基酸诸如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
替代也可通过合成氨基酸(例如非天然氨基酸)进行，包括：α*和α-二取代的*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物诸如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基-甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物诸如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)#、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe(4-苄基)*。符号*已用于上述讨论的目的(涉及同源或非同源置换)，以指示衍生物的疏水性质，而#已用于指示衍生物的亲水性质，#*指示两亲特性。
变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团，除了氨基酸间隔基诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，还包括烷基基团诸如甲基基团、乙基基团或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在呈类肽形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑义，“类肽形式”用于指其中α-碳取代基在残基的氮原子上而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备呈类肽形式的肽的方法是本领域已知的，例如Simon RJ等人，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC,TrendsBiotechnol.(1995),13(4),132-134。
用于本发明的核苷酸序列可在其中包括合成的或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的多种不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解，本文所述的核苷酸序列可通过本领域可用的任何方法进行修饰。可进行此类修饰以便增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
酶的表达
可将用于本发明的核苷酸序列掺入重组可复制载体中。载体可用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制核苷酸序列并以蛋白质/酶形式表达核苷酸序列。
可使用控制序列，例如调控序列来控制表达。
取决于所用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列产生的蛋白质可被分泌或可包含在细胞内。编码序列可被设计成具有信号序列，所述信号序列指导物质编码序列通过特定原核或真核细胞膜分泌。
表达载体
术语“表达载体”意指能够在体内或体外表达的构建体。
优选地，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入基因组中。
本发明的核苷酸序列可存在于载体中，其中所述核苷酸序列有效连接到调控序列，所述调控序列能够通过合适的宿主生物体提供核苷酸序列的表达。
可如下所述将用于本发明的载体转化到合适的宿主细胞中，以提供本发明的多肽的表达。
载体(例如质粒、粘粒或噬菌体载体)的选择通常将取决于其待引入的宿主细胞。
用于本发明的载体可包含一个或多个选择性标记基因，诸如赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。作为另外一种选择，可通过共转化(如WO91/17243中所述)来完成选择。
载体可在体外用于例如RNA的产生或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供通过如下方式制备本发明的核苷酸序列的方法：将本发明的核苷酸序列引入可复制载体中，将该载体引入相容的宿主细胞中，并使该宿主细胞在引起该载体复制的条件下生长。
载体还可包含使载体能够在所考虑的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的示例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
调控序列
在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列有效连接至调控序列，所述调控序列能够诸如通过选择的宿主细胞提供对核苷酸序列的表达。以举例的方式，本发明涵盖包含有效连接至此类调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即该载体是表达载体。
术语“有效连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系的并置。“有效连接”至编码序列的调控序列的连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现。
术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其他表达调控信号。
术语“启动子”以本领域的通常意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。
编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可通过选择异源调控区，例如启动子、分泌前导序列和终止子区域来实现。
优选地，根据本发明使用的核苷酸序列有效连接至至少一个启动子。
其他启动子甚至可用于指导本发明的多肽的表达。
用于指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的合适启动子的示例是本领域所熟知的。
启动子还可包括确保或增加在合适宿主中的表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，诸如Pribnow框或TATA框。
构建体
术语“构建体”(其与术语诸如“缀合物”、“盒”和“杂合物”同义)包括直接或间接连接至启动子的根据本发明使用的核苷酸序列。
所述构建体甚至可包含或表达标记，其允许选择所述遗传构建体。
对于一些应用，优选地，本发明的构建体至少包含有效连接至启动子的用于本发明的核苷酸序列。
宿主细胞
与本发明有关的术语“宿主细胞”包括包含如上所述的核苷酸序列或表达载体并且用于重组产生具有如本文所定义的特定性质的蛋白质的任何细胞。
因此，本发明的另一个实施方案提供了用表达本发明蛋白质的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。细胞将被选择成与所述载体相容，并且可以为例如原核(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。
宿主细胞/生物体的转化
如前所述，宿主生物可以为原核生物或真核生物。合适的原核宿主的示例包括大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
关于原核宿主的转化的教导内容在本领域中有详细记载，例如参见Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)。如果使用原核宿主，则可能需要在转化前对核苷酸序列进行适当修饰-诸如通过移除内含子。
丝状真菌细胞可使用本领域已知的各种方法进行转化，诸如涉及原生质体形成和原生质体的转化，然后以已知的方式再生细胞壁的方法。EP 0 238 023中描述了曲霉菌(Aspergillus)作为宿主微生物的用途。
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的一般技术的综述可见于Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42:205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章中。关于植物转化的另外的教导内容可见于EP-A-0449375。
培养和生产
用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可在有利于产生所编码的多肽并有利于从细胞和/或培养基回收多肽的条件下培养。
用于培养细胞的培养基可以为适用于使所考虑的宿主细胞生长并获得多肽的表达的任何常规培养基。
由重组细胞产生的蛋白质可展示在细胞的表面上。
蛋白质可从宿主细胞分泌，并且可使用众所周知的程序方便地从培养基中回收。
分泌
通常，期望蛋白质从表达宿主分泌到培养基中，从所述培养基中可更容易地回收蛋白质。根据本发明，可基于期望的表达宿主选择分泌前导序列。杂合信号序列也可在本发明的上下文中使用。
异源分泌前导序列的典型示例是来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因的那些(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸型式两者，例如来自曲霉属(Aspergillus))、a-因子基因(酵母，例如酿酒酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉逊酵母属(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属(Bacillus))。
以举例的方式，异源蛋白质在大肠杆菌中的分泌综述于Methods Enzymol(1990)182:132-43中。
优点
本发明的优点将根据本文的教导内容显而易见。
本发明的一个优点是官能化膳食纤维和变性酶的制备以及其作为皮克林颗粒的用途，例如用于稳定乳液和/或替代乳液制备中表面活性剂的使用。
本发明的一个优点是用少量(0.4重量/体积％)的本发明官能化膳食纤维和变性酶稳定的乳液有效避免大的膏化油滴聚结达四周或更长时间。
本发明的另一个优点在于用少量(0.4重量/体积％)的本发明官能化膳食纤维和变性酶稳定的乳液有效避免大的膏化油滴在宽范围的pH(例如，pH 3.0-8.0)内聚结。
已发现，与单独的蛋白质或表面活性剂相比，根据本发明的皮克林颗粒具有对乳液的优异稳定性。
本发明的一个附加优点在于根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或皮克林颗粒可替代常规的乳液稳定剂，从而提供清洁标签、不含乳制品、基于纤维的乳液稳定剂。
根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或皮克林颗粒可稳定相对较大的液滴，例如至多500μm。
与常规的乳液稳定剂相比，根据本发明的官能化膳食纤维和变性酶或皮克林颗粒可提供改善的质地和/或风味和/或颜色和/或气味特性。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第20版，John Wiley and Sons,New York(1994)，和Hale和Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向技术人员提供了用于本公开的许多术语的通用词典。
本公开不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括限定该范围的数字。
本文提供的标题不是本公开的各个方面或实施方案的限制，所述方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而获得。因此，本文所定义的术语通过参考整篇说明书来更全面地定义。
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可使用用于氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码如遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)所定义的。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。
术语的其他定义可在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的具体实施方案，因为这些当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案，并非旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，精确至下限单位的十分之一。规定范围中的任何规定值或中间值与该规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围内，并且其中任一限值被包括、两个限值都不被包括或两个限值都被包括在较小范围内的每个范围也被涵盖在本公开内，受限于规定范围内的任何具体排除的限值。在所述范围包括限值中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
必须指出的是，如本文和所附权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“酶”包括本领域技术人员已知的多种此类候选试剂及其等同物，等等。
本文所讨论的出版物仅是对于其在本专利申请的提交日期之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应理解为承认此类出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
现在将参考下图和实施例仅以举例的方式来描述本发明。
实施例
消费者的健康意识不断提高，导致对基于天然成分的产品的需求不断增加。在本研究中，膳食纤维，具体地讲来自植物的壳(或外壳)(例如豌豆壳)的富含纤维(例如纤维素)的级分，被评价为功能性食品成分。此类用途将是使该原料保值并开发更健康的产品的一种有前景的方式。例如，豌豆壳富含膳食纤维(约90重量/重量％的dm)并且主要由纤维素(69重量/重量％的dm)、半纤维素(7.5重量/重量％的dm)和果胶(16.8重量/重量％的dm)组成(Reichert，1981Cereal Chemistry 58(4)，第266-270页，其以引用的方式并入本文)。流行病学证据示出，摄入纤维具有重要的健康意义(Hu，2003American J.of ClinicalNutrition(78)，第544-551页，其以引用方式并入本文)。此外，豌豆壳纤维(PHF)例如具有中性味道，是浅色的，因此可作为“不可见的”纤维源掺入不同的食物产品中(Guillon和Champ，2002The British J.of Nutrition 88，增刊3，第S293-S306页，其以引用方式并入本文)。本文教导了利用所选的酶水解膳食纤维例如PHF对其功能的影响，并且发现这些改性纤维的新应用。研究了两种体系，即油连续分散体和水包油(油/水)乳液。
实施例1
方法
1.1.材料
底物
粉末状
表1-Exafine PHF的近似组成。信息由Cosucra提供。
酶
基于植物壳(例如豌豆壳)中最丰富的聚合物类别，选择纤维素分解酶和果胶分解酶(表2和表3)用于酶促处理。
纯化的酶
表2-对本研究中使用的纯化酶的描述。信息由Megazyme提供。
aCAZy＝碳水化合物活性酶数据库(www.CAZy.org)
b用相应酶处理的PHF的编码。
商业酶混合物
表3-用于该研究的商业酶混合物的描述。信息由Novozymes提供。
a用相应酶处理的PHF的编码
1.2.植物壳纤维(例如豌豆壳纤维)的酶修饰
1.2.1.酶活性的测定
木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶活性测定
使用用于还原糖的二硝基水杨酸(DNS)方法测定木聚糖酶(内切-β-1,4木聚糖酶)纤维素酶(内切-β-1,4-葡聚糖酶)和果胶酶(内切-1,4-α-聚半乳糖醛酸苷酶)活性。在pH5.0下，在100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中制备小麦阿拉伯木聚糖(中等粘度，Megazyme，Ireland)或羧甲基纤维素(CMC，Megazyme，Ireland)或聚半乳糖醛酸(Megazyme，Ireland)的1％(重量/体积)底物溶液，将12,5μL酶稀释液(1:10-1:10000)加入1.5mL微量离心管中的112,5μL相应底物溶液中。反应在50℃下进行10分钟。在冰上终止反应，并加入125μl的DNS试剂。对照样品涉及在添加酶之前添加DNS试剂。空白样品涉及添加水而不是酶。制作木糖和葡萄糖的相应标准曲线(0.1mg/mL至2mg/mL标准物的水溶液)。使用Unicam UV-可见光光谱仪(Helios Gamma，Helios Delta，UK)在540nm下测定吸光度。
在该研究中，一个活性单位(1U)定义为在所定义的条件下每分钟释放1μmol产物(葡萄糖、木糖)的酶制剂的质量(mg)或mL。所有测定均一式两份进行制备和分析。
β-葡萄糖苷酶活性测定
使用在100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中制备的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-β-D-glcP，Sigma，Switzerland)溶液在pH5.0下测定β-葡糖苷酶活性。将0.25mL适当的酶稀释液(1:10-1:10000)加入1.25mL pNP-b-D-glcP中。通过添加0.25mL Na2CO3(2重量/体积％，Merck)在冰上终止反应(50℃，10min)。使用Unicam UV-可见光光谱仪(HeliosGamma，Helios Delta，UK)在410nm下测定吸光度。对照样品涉及在添加酶活性之前添加Na2CO3。空白样品涉及添加水而不是酶。制作对硝基苯酚(0.05mM-0.3mM)的标准曲线。在本研究中，将1U的β-葡萄糖苷酶定义为在测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯酚的酶量。
蛋白酶活性测定
使用Protazyme AK片剂，用Megazyme内切-蛋白酶试剂盒测量商业酶制剂和植物外壳纤维(例如PHF)中的蛋白酶活性。将protazyme AK片剂加入20mL玻璃管中的5mL 100mM乙酸盐缓冲液(pH 5mL)中，并使片剂在50℃下水合1小时。将酶和PHF在乙酸盐缓冲液中稀释(1:1-1:10000)并在室温下搅拌15分钟。将1mL酶悬浮液加入搅拌的管中，并且使反应持续10分钟和1小时、8小时、24小时。通过添加10mL 2重量/体积％磷酸三钠缓冲液(pH 12)终止反应，同时在涡旋混合器上剧烈搅拌。将管在室温下放置5分钟。如果形成沉淀，则将上清液以1000xg离心10分钟。相对于反应空白在590nm处测量滤液的吸光度。阳性对照包含Alcalase(20,000倍稀释)。一个蛋白酶单位定义为在给定条件下每分钟从可溶性酪蛋白产生一微摩尔酪氨酸当量的酶/PHF的量。标准曲线由Megazyme提供(毫单位/测定(即1mL))＝2029×Abs590-4.5；R2＝0.99)。
1.2.2.用纯化的酶和商业酶混合物对植物壳纤维(例如豌豆壳纤维)进行酶处理
温育
制备PHF在pH 5.0的100mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中的10％总固体(TS)分散体，并在室温下搅拌1小时以允许完全水合。缓冲液包含0.04重量/体积％NaN3(SigmaAldrich，Switzerland)作为抗微生物剂。酶促反应在50℃下以430rpm持续搅拌下进行过夜(16小时)。所用的酶剂量在表6中在结果部分中示出。将样品煮沸10分钟以结束酶促反应。就标准对照而言，PHF在不添加酶的情况下经受相同的处理。在具有和不具有PHF的情况下，其他对照包含蛋白质浓度相等的灭活酶或牛血清白蛋白(BSA)而不是活性酶。BSA分散体的pH调节利用1M HCl和1M NaOH进行。酶处理后获得的PHF分散体直接用于进一步分析或在进一步使用前冷冻干燥。
冷冻干燥和研磨
对于需要处于干燥状态的经处理PHF的实验，将PHF分散体冷冻干燥。将处理后获得的分散体在Sorvall SLA-3000固定角转子(Thermofisher Scientific,Switzerland)中于20℃下以10,000xg离心10分钟。收集所获得的沉淀物并冷冻干燥(-40℃，10-1毫巴并持续72h)。冷冻干燥后，将干物质转移到IKA M20间歇式研磨机(Milian，Switzerland)并以2000xg的恒定速度研磨10秒。
1.3.豌豆壳纤维的物理化学特性
1.3.1.水分含量
使用Mettler Toledo METLAB水分分析仪(Mettler-Toledo，Switzerland)测量经冷冻干燥处理的PHF和对照的水分含量。选择“Puree en flocon”方法，其中将1.7-2.5g的PHF加热至115℃。
1.3.2.密度
使用AccuPyc 1330比重瓶(Instrumat AG，Switzerland)，通过气体比重瓶法测量经冷冻干燥处理的PHF和对照的密度。使已知量的气体(在已知压力和温度下)通过经校准的参考体积进入包含大约2g样品的校准样品室中。通过基于理想气体定律测量校准体积(10cm3)中氦气的压力变化来确定密度。
1.3.3.粒度分布
使用Malvern Mastersizer 2000仪器(Malvern，UK)，利用包含中链甘油三酯(MCT)油的小体积分散体单元，通过激光衍射测量经冷冻干燥处理的PHF和对照的粒度分布。使用MCT方法，其使用Fraunhofer衍射技术来确定粒度分布(Lee Black、McQuay和Bonin，1996Progress in Energy and Combustion Science，22(3)，第267-306页-其以引用方式并入本文)。
使用相同的仪器，但是利用包含水的Hydro 2000SM湿样品分散体单元，测量经处理的PHF分散体和对照的粒度分布。
所用的折射率、吸收指数和密度分别为1.544、0.1和1.5，其对应于纯纤维素的值(由Malvern提供)。分析一式三份地进行，其中激光模糊度介于8％和12％之间。所获得的尺寸分布以根据粒径变化的体积百分比提供。平均粒度表示为基于表面积(d3,2)和基于体积(d4,3)的平均粒径。
1.3.4.形态
共焦激光扫描显微镜法(CLSM)
用经酶促处理的PHF和对照稳定的50％油/水乳液的微观结构使用CLSM成像。对于该分析，用milli-Q水代替柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液制备乳液，因为荧光素示出对缓冲液的反应性。样品的水相用0.01重量％荧光素钠(Merck，Germany)染色。将油相染色，用0.25mg/100mL EtOH的尼罗红原液(Sigma，United states)稀释100倍。将样品置于1mm深的塑料室内，该塑料室由载玻片闭合以防止压缩和干燥伪影。使用升级有Airyscan检测器(Zeiss，Germany)的LSM 710共焦显微镜在室温下进行成像。使用Zen 2.1软件进行采集和图像处理。
荧光素的采集参数：
激发波长：488nm；发射：BP＝420-480nm和BP＝495-550nm
尼罗红的采集参数：
激发波长：561nm，发射：BP＝570-620nm和LP＝645nm
扫描电子显微镜法(SEM)
用SEM分析冷冻干燥后的经处理PHF和商业参考PHF纤维。将粉末胶合到配备有双面导电胶带的金属标本短插芯上。摇动短插芯以允许粉末的良好铺展。使用Leica SCD500溅镀涂布机用10nm的金层涂覆样品，并且随后使用Quanta F200扫描电子显微镜(FEI，TheNetherlands)以6kV在低真空模式下成像。
将湿样品安装到配备有双面导电胶带的金属标本短插芯上。将短插芯放置在保持在4℃的Pelletier台上。使用在10kV下运行的Quanta F200扫描电子显微镜中的气体次级电子检测器记录图像。将显微镜压力设定为4.60托，这对应于75％的相对湿度，以便使水合状态下的样品可视化。
光学显微镜法
使用光学显微镜对50％油/水乳液和10重量/重量％PHF分散体和对照的微结构进行成像。将一滴样品置于玻璃板上，并利用配备有数字相机和成像软件(cellSens)的Olympus SZX16光学显微镜(Olympus，Germany)，使用暗场照明和适当的放大倍数进行成像。
1.3.5.表面电荷
使用Zetasizer纳米系列仪器(Malvern，UK)测定酶促处理的PHF和对照在水中的电泳迁移率(1重量/体积％)，随后将其转化成ζ电位。用于ζ电位测量的溶液中颗粒的最佳尺寸范围为5nm至10μm，因此PHF(尺寸>10μm)不适用于该分析，因为它们在测量期间沉淀在比色杯中。可通过将颗粒过滤至至少1-10μm的尺寸范围来潜在地改善该方法。
1.3.6.润湿特性
使用KSV CAM200测角计(Biolin Scientific，Finland)研究干燥PHF的可润湿性。用安装到测角计装置的注射器将一滴水或油(3-5μl)沉积在平坦的纤维表面上。在高对比度下记录接触角随时间推移的变化，并且用图像分析程序计算接触角，所述图像分析程序根据液滴形状来近似做一个圆，并且从该圆与基线相交的该曲线的斜率获得接触角(Mitchell等人，2017Chemical Engineering Science，167，第29-41页-其以引用方式并入本文)。
使用三种不同的技术来产生豌豆壳纤维的平坦表面：
制片：在由直径为24mm的不锈钢制成的片剂模具中，将2g粉末在20t压力下在两个冲头之间压制。
旋涂：制备10-20％TS纤维溶液并搅拌一小时。将一小滴沉积在旋涂机中心的玻璃板上，并且通过离心力以不同的速度旋转，从而使得可产生薄层。
将纤维粉末固定在胶带上：利用刮刀将20mg纤维铺展胶带上，所述胶带固定到微观玻璃板上。
1.4.水包油乳液稳定特性
1.4.1.乳液的制备
除非另有说明，否则如下制备50重量/重量％油/水乳液：首先将10mL100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5)(具有0.04重量/重量％NaN3作为抗微生物剂)加入Pyrex管中并与1mL经处理分散体或对照分散体混合。将10mL高油酸葵花油(Nestrade，Switzerland)添加到水相，并且手动摇动乳液10秒。除非另外指明，否则将样品在室温下保持4周的时间。
为了评估可溶相的乳液稳定效应，将2mL PHF分散体在2mL Eppendorf比色杯中以16,000x g离心十分钟。将1mL上清液而不是PHF分散体添加到50％油/水乳液的水相中。为了评估不溶性相的乳液稳定效应，将离心后获得的沉淀物用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去任何剩余的可溶性组分，并且然后利用经洗涤的PHF将PHF分散体重构至相同的浓度，方式是用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液填充Eppendorf比色杯，直至再次到2mL标记，假定洗涤期间PHF损失的量可忽略不计。将柠檬酸盐-磷酸盐-缓冲液中的1mL经洗涤沉淀物加入如上所述的50％油/水乳液的水相中。
1.4.2.乳液的稳定性
除非另外指明，否则在视觉上评估乳液抗塌缩的稳定性至少4周。使用不同的显微镜技术(1.3.4.)来阐明经酶促处理的(官能化的)PHF的稳定机制。
1.4.3.厨房原型
以液体奶精原型测试官能化(经酶促处理)PHF的乳液稳定特性。制备250mL PHF在PANNA水中的10重量/体积％分散体，并且在室温下搅拌1小时以允许完全水合。向分散体中添加240μL Cell/g PHF和120μL Pec/g PHF。将分散体在50℃下在连续搅拌下温育过夜(16小时)，但不调节pH(反应前在21℃下测量的pH：5.98)。
奶精原型的制剂和结果示于实施例2中。
首先，通过在室温下将混合物在覆盖有石蜡的200mL塑料烧杯中搅拌两小时，将所有水溶性成分溶于PANNA水中。此后，将水相添加到包含预先称重的高油酸葵花油的500mL塑料烧杯中。用IKA Ultra-turax(IKA，Germany)以16,000 1/min匀化混合物2分钟。
在80℃下将可溶咖啡(2.5g NescaféGold coffee/150g水)溶于PANNA水中。将5g液体奶精添加到30mL咖啡中，并在品尝前保持在70℃的烘箱中最多一小时。在品尝之前，用塑料刮刀轻轻搅拌样品，并放在红光下以掩盖颜色。提供对照(与参考相同)以便测试感官评价的可重复性。
1.5.分析方法
1.5.1.酶蛋白质含量的测定
根据Sigma方案(Sigma Aldrich，Switzerland)，利用Bradford和Lowry测定来测定纯化酶和商业酶混合物的蛋白质含量。
Bradford
向Nunc MicroWell 96孔微板(Thermo Scientific，Switzerland)中的100μl样品中添加100μl的Bradford试剂(Sigma Aldrich，Switzerland)。在milli-Q中制备适当的样品稀释液，以获得在校准曲线的线性部分内的浓度。使溶液在室温下反应5分钟，此后使用Varioskan Flash(Thermo Scientific，Switzerland)在595nm的波长下测定标准物和样品的吸光度。制作牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Switzerland)的校准曲线，其中浓度范围为0至25μg/mL。
Lowry
向Nunc MicroWell 96孔微板(Thermo Scientific，Switzerland)中的100μl样品中添加100μl的Lowry试剂溶液。使溶液在室温下反应20分钟，此后向每个孔中添加50μl的Folin&Ciocalteu苯酚试剂，并使其在室温下显色30分钟。使用Thermo ScientificVarioskan Flash(Thermo Scientific，Switzerland)测定样品在600nm波长下的吸光度。制作牛血清白蛋白(BSA)的校准曲线，其中浓度范围为0至400μg/mL。
1.5.2.SDS-PAGE
温育后，对PHF分散体的可溶相和不溶相进行SDS电泳。如下制备用于SDS分析的样品。将PHF分散体在2mL Eppendorf比色杯中以16,000xg离心10分钟，此后将上清液与沉淀物分离(上清液1)。将沉淀物在同一Eppendorf比色杯中在pH 8.5的Tris-SDS-尿素缓冲液中溶解至少10分钟，此后将混合物离心，并将上清液与沉淀物分离(上清液2)。上清液1和上清液2用于分别分析可溶性相和不溶性相中存在的蛋白质。对照由PHF分散体制备，所述PHF分散体与灭活酶一起温育并且不与酶一起温育。
向65μL样品中添加25μL NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen，Switzerland)和10μL NuPAGE样品还原剂(Invitrogen，Switzerland)，然后将其在恒温混匀仪(ThermoScientific，Switzerland，Switzerland)中在70℃下加热10分钟。
凝胶用NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液冲洗三次，并置于X-CELL II Mini Cell(LifeTechnologies，Switzerland)中。然后将样品加载到NuPAGE Novex 12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，Switzerland)上的孔中，并将分子量标记(Sigma Aldrich，Switzerland)加载到孔1和12中。将NuPAGE LDS样品缓冲液加载到空孔中。电泳槽的两个室均填充有NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(Invitrogen，Switzerland)，并且将500μl NuPAGE抗氧化剂(Invitrogen，Switzerland)添加到上部室中的缓冲液中。电泳在X-CELL II Mini Cell中在200V下进行50分钟。然后将凝胶在塑料容器中在100mL固定溶液(50％甲醇、10％乙酸和40％milli-Q水)中于室温下在轻轻振荡下温育10分钟。10分钟之后，倒空容器并填充染色溶液(55％mL milli-Q水、20mL甲醇、来自胶态蓝色染色试剂盒(Invitrogen，Switzerland)的20mL染色剂A)。将凝胶温育另外10分钟，此后添加来自胶态蓝色染色试剂盒(Invitrogen，Switzerland)的5mL染色剂B。将凝胶染色3-4小时。移除染色溶液，并且加入200mL milli-Q水并轻轻摇动至少7小时以允许脱色。使用白色背景屏幕，用Image ScannerIII(GE Healthcare，Life Sciences，Switzerland)扫描凝胶。
1.5.3.还原糖分析
用DNS方法测量反应上清液和对照中的还原糖。
DNS试剂通过将200mL的8重量/体积％NaOH(Merck，Switzerland)与500mL milli-Q水混合，然后添加10g 3,5-二硝基水杨酸(DNS)来制备。在连续搅拌下缓慢添加402.7gC4H4KNaO6x4H2O。
将125μl的DNS溶液添加到125μl的样品中，并将混合物煮沸5分钟。添加1mLmilli-Q水，并使用Unicam UV-可见光光谱仪(Helios Gamma，Helios Delta，UK)读取540nm下的吸光度。使用葡萄糖、木糖和D-半乳糖醛酸以在0和2mg/mL之间变化的浓度制作标准曲线。
1.5.4.使用亲水作用色谱(HILIC)对低聚糖进行定性分析
使用HILIC分析用商业酶混合物处理的PHF的反应上清液。
制备麦芽三糖标准品(2μmol/mL、0.5μmol/ml和0.1μmol/mL)和昆布三糖内标工作溶液(0.4μmol/mL)。通过将524.2mg邻氨基苯甲酰胺(Sigma-Aldrich，Switzerland)和691.2mg氰基硼氢化钠(Sigma-Aldrich，Switzerland)加入3.6ml无水乙酸(Merck，Switzerland)和8.4ml二甲基亚砜(Sigma-Aldrich，Switzerland)的溶液中来制备2AB标记试剂。然后将2AB标记试剂在涡旋上混合，并置于超声波浴中10分钟以完全溶解。洗脱液A(水-乙腈25:75溶液)通过将250ml Milli-Q水和750ml乙腈(Merck，Switzerland)混合来制备。洗脱液B(50mM甲酸铵)通过将1.89ml甲酸100％(Merck，Switzerland)加入800mlMilli-Q水中，然后用氢氧化铵25％(Merck，Switzerland)将pH调节至4.4来制备。
将所关注的样品在Milli-Q水中稀释20至100倍。向50μL的稀释样品和麦芽三糖标准品中添加50μL的昆布三糖内标工作溶液(0.4μmol/mL)。将20μL的每种混合物转移到2mL微管中，并且向其中添加200μL的2AB标记试剂。在用涡旋混合器混合之后，将管在65℃水浴中温育2h。在该标记反应之后，将管在4℃下保持10分钟。然后用0.6mL洗脱液A稀释每种混合物，涡旋，并且然后定量转移到2ml色谱小瓶(Agilent，Switzerland)中，并用预切缝盖(Agilent，Switzerland)螺旋封闭。
分析在Thermo Scientific Vanquish UHPLC系统(Thermo Scientific，Switzerland)上进行。使用2μL的进样体积，在配有ACQUITY UPLC BEH Amide VanGuard前置柱(
1.5.5.使用高效阴离子交换色谱(HPAEC)定量分析单糖和低聚糖
使用HPAEC分析用商业酶混合物处理的PHF的反应上清液。
单糖和低聚糖
使用配备有温度设定在30℃的CarboPac PA1柱(Dionex Corporation，2010)和金电极三电位脉冲安培检测(PAD)的Dionex ICS-3000DC设备分析单糖和低聚糖。洗脱液A(100mM NaOH水溶液)和洗脱液B(600mM乙酸钠的100mM NaOH水溶液)用作流动相，其中乙酸钠梯度如下：0-5min，0mM；5-50min，0-48mM；50-55min，48-600mM；55-65min，600mM；65-68min，600-0mM；68-75min，0mM，流速为1.0mL/min。E1(400ms)、E2(200ms)和E3(400ms)的施加PAD电位分别为50mV、750mV和-150mV，并且输出范围为1μC。每个样品的进样体积为20μL，由Dionex AS自动进样器进样(温度设为10℃)。将样品稀释100倍并过滤(0.2μm)。以三种不同的浓度(25μg/mL、75μg/mL和150μg/mL，线性确认)制备具有纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的标准品。使用ChromeleonTM 7.1版本色谱法软件来采集和处理色谱数据。
单糖分析
通过在100ml容量瓶中，将100mg葡萄糖(Sigma-Aldrich，Switzerland)、甘露糖(Merck，Switzerland)、阿拉伯糖(Sigma-Aldrich，Switzerland)、木糖(Sigma-Aldrich，Switzerland)、半乳糖(Sigma-Aldrich，Switzerland)溶于100ml Milli-Q水中制备碳水化合物标准原液，从而对于每种单糖获得浓度为1000μg/mL的溶液。由该原液制备500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、25μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和0.5μg/L的一系列标准品。将1.5mL标准品和100倍稀释的样品填充到2mL色谱小瓶(Agilent，Switzerland)中并用预切缝盖(Agilent，Switzerland)螺纹封闭。
该分析在Thermo Scientific Dionex ICS-5000+无试剂HPIC系统(Dionex，Switzerland)上进行。使用25μL的进样体积，在CarboPac PA1柱(4×250mm，Dionex，Switzerland)上分离单糖。洗脱液A为300mM氢氧化钠(J.T.Baker Chemicals，Switzerland)，并且洗脱液B为Milli-Q水，流动相流速为1mL/min，其中梯度曲线由洗脱液A与以下比例(体积/体积)的洗脱液B组成：0-60min，100％B；60-75min，0％B；75-90min，100％B。以0.6mL/min的流速添加300mM氢氧化钠的柱后洗脱液以增加信号强度并降低信噪比。配备有金工作电极的Dionex ICS-5000+ED40电化学检测器(Dionex，Switzerland)与使用Carbo Quad波形的脉冲参数的脉冲安培检测一起使用。绘制色谱图，并且使用Chromeleon 7.2色谱数据系统软件(Dionex，Switzerland)分析峰面积。
结果
2.1.经纯化的酶和商业纤维降解酶混合物的表征
利用Lowry和Bradford标准测定法测得的纯化酶和商业酶混合物的蛋白质含量在图1中示出。无论选择何种测定，与纯化酶(0.2-1.0mg/mL酶溶液)相比，商业酶制剂具有显著更高的蛋白质含量(19.1-182mg/mL酶溶液)。通过Lowry测得的蛋白质含量始终高于用Bradford测得的蛋白质含量。这些差异可用对酶溶液中存在的某些肽或其他化合物的测定灵敏度的差异来解释(Berges、Fisher和Harrison，1993)。虽然Lowry被公认为更准确的蛋白质定量方法(Redmile-Gordon等人，2013Soil Biology and Biochemistry，67，第166-173页)，但它对纯化的β-葡萄糖苷酶(E-BGLUC)表现出高反应性。因此，Bradford方法用于根据蛋白质含量对酶进行归一化。
内切-葡聚糖酶、内切-木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶活性
纯化酶和商业酶混合物的活性示于表4中。商业酶制剂具有比纯化酶(182-3844U/mL)高得多的活性(9748-10467U/mL)。然而，与商业酶混合物相比，纯化酶的比活性示出显著更高的活性。重要的是提到这些值仅在给定的测定条件下才有效。
表4：纯化酶和商业酶混合物的酶活性(纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶)。
b基于Bradford数据(图1)
商业酶混合物和PHF中的蛋白水解活性示于表5中。该测量的目的是确认或否定蛋白水解活性的存在，所述蛋白水解活性可针对反应溶液中存在的豌豆蛋白质或酶起作用。Pectinex Ultra SP-L具有蛋白水解活性，然而Cellulcast 1.5L不存在该活性。ExafinePHF也具有显著的蛋白水解活性。这可通过存在内源性酶来解释，这些内源性酶通常形成初生细胞壁的一部分(O’Neill&York,2003The composition and structure of plantprimary cell wall.In Annual Plant Reviews 8:The plant cell wall,Rose,JKC编辑，Oxford:Blackwall，其以引用方式并入本文)并且在工业加工期间未灭活。必须强调的是，该单位是用由Megazyme提供的标准校准曲线计算的(参见1.5.1.)，并且不代表总单位，因为测定条件适于常用反应条件(pH5，温度50℃)，所述反应条件不同于Megazyme用于校准的条件。
表5商业酶混合物和PHF中的内切-蛋白酶活性。
用纯化的酶和商业酶混合物的酶处理对PHF水解度的影响
表6：用于用纯化酶和商业酶混合物对PHF进行酶处理(10％TS，16小时，50℃，pH 5)的酶剂量，包括每个反应的还原糖收率。
a每个样品的还原糖的标准偏差均低于6％。
在用纯化的酶处理之后的还原糖分析指示仅释放微量或不释放新的还原端(1.6-2.9g/L，表6)。这被预料到，因为纯化的酶的单一作用并不意在基本上水解顽固纤维。然而，低值还可指示，固有的异质多糖网络过于复杂和致密而不能被纯化酶降解(Huisman、Schols和Voragen，1999Carbohydrin Polymers，38(4)，第299-307页)。对照中的还原糖当量浓度可通过在温育期间进入溶液的来自子叶的可溶性低聚糖或淀粉污染物来解释。
接下来，用商业纤维素分解酶和果胶分解酶制剂以高剂量进行酶处理以确保更有效的水解。可以预知，与纯化的酶相比，该处理显著增加了水解度，如由释放的还原端数目增加所示(46.3-75.4g/L，表6)。增加的纤维水解可归因于所用的较高酶浓度和商业酶制剂中存在的多种酶的协同效应。
使用HILIC的上清液分析
为了更好地理解PHF的化学组成如何受酶处理的影响，使用HILIC和HPAEC进一步分析水解产物。该信息将允许PHF功能特性的改变与提取的碳水化合物相关，从而与酶活性相关。
酶促处理的PHF和对照的模式在图2中示出。结果反映通过所有组分的早期(2-15分钟)洗脱测量的上清液中低分子量物质的意料不到的存在。尽管利用HILIC在不同的稀释度下进行了长期和随后短期的运行，但在PHF中未鉴定出低聚糖或鉴定出少量低聚糖(第17分钟)。除了对照之外，所有光谱均由具有不同高度的相同峰构成，不同的是用Pec处理的样品在第2分钟和第5分钟处有两个不同峰。可以得出结论，低分子量片段是由于主要由细胞活性驱动的酶促作用而产生的。
使用HPAEC的上清液分析
在不同稀释度(1:1-1:100)下利用HPAEC进行水解产物的组成分析以便鉴定纤维寡糖、纤维二糖和纤维单糖。由于共洗脱化合物和较差的峰分辨率，纤维-低聚糖分析不允许准确积分。最后，用相同系统对经酶促处理的PHF进行单糖分析允许在1:100稀释度处分离峰，从而示出早期洗脱的分子是葡萄糖(26.5-31.4g/100PHF dm)、阿拉伯糖(0.2-3.3g/100PHF dm)和木糖(7.6-8.0g/100PHF dm)。第45分钟处的峰未被鉴定，但可对应于纤维二糖。这些分子符合PHF的一般组成。假设葡萄糖主要来源于PHF中的纤维素级分(69重量/重量％dm)，计算出大约40-48％的纤维素在PHF-Cell和PHF-Pec+Cell中降解成单糖。
结果示出，长温育时间连同商业酶混合物中外切活性的存在一起促进了存在于PHF中的纤维分解成单糖。Pec和Cell酶混合物中的外切活性的存在先前由Combo等人(2012)Food and Bioproducts Processing 90(3)第588-596页(其以引用方式并入)和Rosales-Calderon、Trajano和Duff(2014)Peer J.2pe402(其以引用方式并入)报道。
当监测PHF-Pec+Cell的还原糖根据反应时间的变化(图4)时，可观察到一级和二级水解过程。在最初4-6小时后释放还原糖达到平台期。在该步骤中，来自纤维颗粒表面的可溶性中间体可能释放到可溶性相中(一级水解)(Sievers等人，2009Industrial&Engineering Chemistry Research 48(3)第1277-1286页-其以引用的方式并入本文)。8小时后，这些长链和短链中间体随后被具有外切活性的酶切成单糖。该步骤比一级水解快得多，如由还原糖的斜率从8小时至16小时急剧增加所示。
2.2.经酶促处理的豌豆壳纤维的功能特性
2.2.1.作为水包油皮克林乳液稳定剂的经酶促处理的豌豆壳纤维
用商业酶混合物进行酶促处理对PHF的粒度和形态的影响
所有经酶促处理的样品和对照的体积粒度分布(PSD)均示于图5中。
下表对应于图5。对照对应于经喷射研磨的豌豆壳纤维，其中未施加酶处理。
酶促作用对喷射研磨的PHF物理结构的影响之一是粒度减小，从而得到1μm至300μm尺寸范围内的颗粒。当用Pectinex SP-L和Celluclast 1.5L同时处理PHF时，获得最小粒度。通过应用该处理，平均体积直径减小了十倍。
还使用光学显微镜评估酶促处理对PHF物理结构的影响。结果的定性分析指示由于改变酶促处理的类型而导致的颗粒形态和尺寸多分散性的变化。与经处理的PHF相比，未处理的经修饰的PHF颗粒示出更高的多分散性和增加的表面粗糙度，这由于图像分辨率低而不能从图像中清楚地观察到。与使用纤维素分解酶的处理(图6B、D)相比，仅用果胶分解酶处理PHF(图6C)产生棒状颗粒。
重要的是要强调，图5中的PSD表示为体积尺寸分布。由于具有多分散尺寸分布的样品中的大部分体积被较大颗粒占据，因此较小颗粒对体积分布的相对贡献减小，因此这些小颗粒不能通过马尔文测量很好地表示。PHF-Cell中一些大颗粒的存在(图6，B)可解释为什么利用Malvern Mastersizer 2000的PSD测量未示出PHF-Cell的粒度的显著变化(图5)，然而光学显微图示出较小颗粒的显著生成(图6，B)。
在图7的曲线图中，示出了PHF-Pec+Cell的平均粒度根据反应时间的变化。8小时后粒度的减小逐渐平稳。因此，对于未来的方法优化而言，反应时间可减少至大约8小时而不影响最终粒度。这也将限制次级水解在大约6-8小时发生，如在讨论中较早报道的(图4)，从而减少了不期望的单糖生成。
酶促处理对PHF水悬浮液的剪切流的影响
在温育后，以10重量/重量％对经酶促处理的PHF水分散体进行粘度测量。PHF-Pec+Cell表现出最低粘度(图8)值，这对应于具有最低粒度的体系(图5)。因此，表观粘度似乎由颗粒分散相而不是含单糖的水连续相支配。
对于PHF-Cell，未测量到表观粘度值的变化，这与未示出显著差异的粒度分布结果一致。最后，与对照相比，测得的PHF-Pec的粒度减小不足以显著改变流动响应。
酶促处理对PHF的润湿特性的影响
评估PHF的润湿特性是本研究的核心部分，因为改变原本亲水颗粒的表面疏水性对于获得用于乳液稳定的官能化颗粒是至关重要的。润湿特性与三相接触角θ相关，所述三相接触角决定颗粒在两个流体相之间的分配。
结果示于图9中。
PHF的孔隙率阻碍了油滴或水滴与PHF所成的接触角的准确测定，从而导致流体在前3-5秒内快速吸收，液滴体积随时间推移而减小，颗粒在与水接触时溶胀，并且颗粒被液滴吸收。
采用另一种方法，所述方法将润湿性表示为1g样品完全浸入固定体积(10mL)的mili-Q水中所需的时间量(s)。为此，PHF分散体必须冷冻干燥并且粉末化。该方法示出样品之间的显著差异和良好的可重复性(参见图10)。
PHF-Pec+Cell示出最佳的可润湿性，完全浸渍仅需3秒，之后是PHF-Pec和PHF-Cell。对照PHF需要几乎120秒才能从表面消失，因此被认为是最不亲水的。然而，改善的可润湿性也可以是粒度减小的结果(图5)，使得更多的官能团暴露于颗粒表面而可用于与水分子结合(Einhorn-Stoll、Hatakeyama和Hatakeyama，2012Food Hydrocolloids 27(2)，第494-502页，其以引用的方式并入本文)。
经酶促处理的PHF的乳液稳定特性
以可加速去稳定的方式制备初始乳液，因此允许样品之间的更快比较。简而言之，首先将1mL经处理的PHF分散在水相中，之后添加高油酸葵花油。除非另外指明，否则将混合物手动摇动10秒并且在四周的时间段内将由经处理的纤维制备的乳液的稳定性与它们的未处理对应物的稳定性进行比较。图21中示出了1天和4周后所得的乳液的图片。
由手动摇动提供的低能量输入有助于形成较大的油滴，并且因此有助于增加膏化速率，从而导致形成厚膏化层。在30-180秒后，用PHF-Pec制备的乳液和对照的膏化层分离成油相和水相，然而由PHF-Pec+Cell和PHF-Cell制备的乳液的膏化层中的液滴(尺寸范围在10-500μm之间)保持稳定至少4周。当在pH 3.0、5.0和8.0下制备乳液时，观察到相同的结果。
乳液的稳定性通常基于其抵抗随储存时间推移的物理化学变化的能力来评估(McClements，2005Food Emulsions:Principles，Practice，and Techniques.Boca Raton:CRC Press，其以引用方式并入本文)。当表现出不具有相分离的均匀外观时，乳液被认为是稳定的。制备我们的乳液的方式有利于快速膏化，因此我们对稳定性的定义基于膏化油滴是否将随时间推移保持稳定，而与液滴尺寸或乳脂层高度无关。该比较分析将仅允许两个响应选项，其中“稳定”是指膏化油滴抗聚结至少4周的情况，并且“不稳定”是指不存在液滴的情况。
将可溶性级分和不溶性级分对乳液稳定特性的影响解耦
进行另外的实验以将来自溶液中的颗粒和其他潜在表面活性化合物的效果解耦。将PHF分散体(PHF-Cell和PHF-Pec+Cell)离心，并且将上清液和沉淀物分别用于制备乳液。如图12所示，由不溶性相(b)制备的乳液保持稳定至少4周。由可溶相(a)制备的乳液快速相分离(大约10分钟)，但与对照相比更慢。这些结果指示乳液稳定性由不溶性颗粒相驱动。这与先前报道的化学分析结果(图3)一致，从而示出酶促处理主要产生不具有表面活性的单糖。确定了哪个相驱动稳定性后，仍然使用两个相的混合物继续进行实验。
用经酶促处理的PHF稳定的乳液的微观结构
利用光学显微镜使乳液成像以观察稳定液滴的微观结构。图13中的显微图示出了液滴的纹理化粗糙表面，这是用颗粒稳定的液体表面的典型特征。对照和PHF-Pec的液滴没有成像，因为它们在乳液制备后快速去稳定。
相同乳液的CLSM图像(图14)示出，小颗粒(<30μm)偏向存在于乳液的界面处而不是本体中，因此对油/水界面具有高亲和力。所获得的乳液符合皮克林乳液的定义，其中乳液通过在油/水界面处吸附固体颗粒来稳定(Murray等人，2011Food Hydrocolloids 25(4)，第627-638页，该文献以引用方式并入本文)。油滴和PHF颗粒两者均示出颗粒形状和尺寸的分散性，但是总体粒度与油尺寸的比率在1:10的范围内，这与皮克林颗粒应比其稳定的油滴小至少一个数量级的普遍持有的观念一致(Berton-Carabin和
PHF-Pec+Cell的皮克林效应似乎比PHF-Cell更明显。其原因在于，与仅用Cell处理相比，用Pec+Cell进行酶促处理产生更小尺寸的颗粒(图5)，从而导致更多数量的颗粒覆盖油界面。Gould、Vieira和Wolf，(2013)(同上)的发现还示出，仅来自可可粉的小尺寸颗粒级分(<2μm)可吸附在油滴的表面(d3,2约为10μm)。
尽管在用PHF-Cell稳定的乳液中在油/水界面处存在较少的皮克林颗粒，但是获得相同的稳定性水平，从而指示其他表面活性化合物可参与向液滴提供附加的稳定性。据报道，仅需要颗粒对油滴表面的20％覆盖率就能有效地防止聚结达数月(Bink等人，2005Naturally Occurring Spore Particles at Planar Fluid Interfaces and inEmulsions.Langmuir 21(18)，第8161-8167页)。然而，在PHF-Cell的情况下(图14)，一些液滴完全不含颗粒。
在首次尝试测量界面处蛋白质的存在时，将乳液用固绿(Fast Green，一种在与蛋白质接触时发荧光的着色剂)染色，但未获得信号。然而，由于如此低的浓度下的检测限，信号的缺乏没有足够的证据表明界面处不存在蛋白质。
可溶相和不溶相中蛋白质的存在
表7-用经酶促处理的PHF制备的油/水乳液和对照的组成。对照由PHF制备，其在相同条件下处理但不添加酶。
a基于Bradford数据
b基于凯氏定氮法(Kjeldahl)数据，获自RDLS-RD170010-00
尽管用CLSM未鉴定出蛋白质并且油滴的稳定性与pH无关，但不能排除蛋白质的贡献，因为其以显著量存在(对于PHF-Pec+Cell和PHF-Cell而言，每1g油0.8mg和0.7mg，表7)。此外，仅具有最高蛋白质含量的乳液是稳定的(表7)。
利用SDS-PAGE进一步分析PHF分散体(PHF-Cell和PHF-Pec+Cell)的可溶相(上清液)和不溶相(沉淀物)以确定蛋白质是保留在可溶性级分还是不溶性级分中(图15)。SDS凝胶示出在可溶相中不存在或仅存在痕量的蛋白质(泳带1-5)。沉淀物的SDS分析示出，几乎所有可用的蛋白质均与不溶相保留在一起(图15的泳带8-12)。在温育16小时之前添加至对照的灭活酶示为泳带8和11中的低分子量材料，这可能是由于存在于PHF中的内源性酶的降解。先前通过测定蛋白酶活性确认了PHF中内源性酶的蛋白水解活性(表7)。折叠形式的活性酶显然对蛋白水解活性具有抗性。
由该实验得出结论，结果表明蛋白质与不溶相保留在一起，从而与PHF颗粒保留在一起，但是不清楚两种组分是缔合的还是以单一组分形式存在。
表8来自图15的泳带的描述。
阐明酶在油/水乳液稳定化中的作用
乳液中的酶含量与稳定性之间的明显相关性促使我们研究酶的乳液稳定特性。酶是蛋白质，并且由于其天然两亲性，可有助于乳化效果。通过在具有或不具有PHF的情况下制备包含活性酶和灭活酶的对照PHF分散体来验证该假说。对于以下实验，我们继续仅使用PHF-Pec+Cell，因为该处理产生更多在本研究中特别关注的皮克林颗粒。
表9由活性酶和灭活酶(Pec+Cell)制备的乳液的实验条件概述。
a在此，从由供应商提供的酶的蛋白质含量评估每mL水相的蛋白质浓度(对于Cell和Pec分别为14重量/重量％和7.5重量/重量％)。
有趣的是，在它们的活性和可溶形式中，酶不示出任何乳化特性，但是当它们经受用于灭活的热处理(100℃10分钟)时，它们变成表面活性剂，并且在存在和不存在PHF的情况下均使乳液稳定至少4周。该实验的结果产生了该研究的第二个主要假设，即变性酶驱动乳液稳定特性。
在这方面，还推测酶与PHF颗粒的直接相互作用是否可能是PHF颗粒在油/水界面处功能增强的原因。酶是生化反应的催化剂，并且必须与其底物物理接触以引发水解。酶与底物的附接通常通过碳水化合物结合域介导，所述碳水化合物结合域由若干芳族氨基酸序列组成(Levy、Shani和Shoseyov，2002Biomolecular Engineering，19(1)，第17-30页，其以引用方式并入本文；Shoseyov、Shani和Levy，2006Microbiology and Molecular BiologyReviews，70(2)，第283-295页，其以引用的方式并入本文)。CBM与底物的缔合通过与碳水化合物的氢键结合、疏水相互作用以及弱静电相互作用来建立，这在很大程度上取决于蛋白质折叠(Boraston等人，2004Biochemical Journal，382(3)，第769-781页，其以引用方式并入本文)。在变性时，酶展开并丧失其三级(并且通常二级)结构。该现象导致疏水基团在蛋白质表面处的暴露(Danie、Dines和Petach，1996Biochemical Journal，317(1)，第1-11页，其以引用的方式并入本文)。尽管PHF-酶相互作用的性质仍然不清楚，但热处理可能已经潜在地在颗粒表面处赋予酶的构象变化，从而提供颗粒表面两亲性。这可解释PHF颗粒对油/水界面的较高亲和力。
“不含蛋白质”的PHF颗粒的乳化特性
为了验证液滴稳定性是否主要来源于灭活酶，有必要确认修饰的PHF颗粒自身不表现出任何效果。证实这一点的主要困难在于提供没有剩余酶残余物的经酶处理的颗粒。
表10：用热处理的BSA制备的乳液的实验条件的概述。
通过在温育温度(50℃)下用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲将其洗涤，移除温育后的活性可溶性酶，这代表避免处理后酶灭活并获得具有相似特性的颗粒的良好方法。此外，我们示出呈其活性形式的酶不具有乳化特性(表9)。乳液在任一种情况下不稳定(表10)。这证实了小PHF颗粒在油/水界面处的吸附取决于灭活酶的存在。
用于使颗粒官能化的另选的蛋白质源
表11：在具有和不具有PHF的情况下，由经热处理BSA制备的乳液的实验条件的概述。
蛋白质，即使不具有催化活性的那些，也具有吸附在同一体系中存在的表面上的一般趋势(Murray等人，2011(上文))。在不同的pH下制备包含与酶同等蛋白质浓度的牛血清白蛋白(BSA)的对照，以试图评估灭活Cell和Pec在将PHF颗粒官能化成表面活性乳液稳定剂方面是否提供优于其他蛋白质的任何优点。
含有BSA的对照在等同于经酶促处理样品的蛋白质浓度下是不稳定的(表11)。仅对于比经酶促处理的样品高10倍的BSA浓度(5.14mg/mL)观察到稳定性。此外，由BSA制备的样品对温度和pH的变化敏感，这体现为在pH5下在热处理之后的可见沉淀(图16A)。在pH5下BSA稳定的乳液中的沉淀与这些蛋白质在接近其等电点时的静电排斥(IEP，对于BSA而言pH5)降低以及因热处理所引起的疏水相互作用增加相关(Evans，Ratcliffe，Williams，2013Current Opinion in Colloid and Interface Science，18(4)，第272-282页(以引用方式并入本文)；McClements,2004Current Opinion in Colloid&Interface Science,9(5)，第305-313页(以引用方式并入本文)，Medda、Monduzzi和Salis，2015ChemicalCommuications.,51(30)，第6663-6666页-以引用方式并入本文)。单独的经热处理的BSA即便变为不溶性的，也能够稳定液滴(图16B)，但是对于用pH 5的PHF和BSA的混合物稳定的乳液而言，沉淀最终导致一周后乳液不稳定(图16A)。
对于经酶促处理的PHF观察到的皮克林机制可通过酶的催化作用减小粒度来预处理，这产生足够小(<30μm)以吸附在界面处的颗粒。当PHF与BSA一起温育时，不产生表面活性皮克林颗粒，这主要是由于与酶相比，缺乏颗粒减小，并且还可能是由于BSA对PHF的亲和力较低。该研究的结果指示酶对底物的亲和力的潜在用途是作为用于产生食品级功能性蛋白质-碳水化合物复合物的新策略。
结论
3.1结论
经酶促处理的PHF作为油/水皮克林乳液稳定剂
市售果胶酶和纤维素酶在1169-3682.2U/g PHF下的作用是显著的粒度减小(从87.2μm至<30μm)并产生表面活性位点，使得颗粒能够吸附在油/水界面处，从而充当油/水皮克林乳液稳定剂。由低浓度的经处理的PHF(0.4重量/体积％)和酶(0.01重量/体积％)制备的油/水乳液(50体积/体积％油)发生膏化，而膏化油滴(10-500μm)在宽泛的pH(3.0-8.0)范围内是抗聚结稳定的并持续至少四周。
不希望受理论的束缚，这些修饰的PHF的功能特性主要来自于改变所添加酶的天然形式以及它们与PHF小颗粒的相互作用，而不是来自PHF-颗粒表面处疏水性聚合物部分的暴露，如该研究最初假设的那样。关于经酶促处理的PHF的稳定特性进行了两个有趣的观察：
1.存在于分散体中的纤维活性酶在变性时变成优异的乳化剂，这可归因于疏水基团由于蛋白质去折叠在表面处暴露。
2.这些酶与降解后的小PHF之间的相互作用导致形成食品相容的皮克林稳定剂。
一般来讲，示出PHF颗粒自身不表现出表面活性，但是与变性酶组合的官能化PHF颗粒确实表现出表面活性，并且充当皮克林颗粒。官能化PHF颗粒可形成充当皮克林颗粒的PHF-酶-复合物。酶可保持附接到PHF表面，从而用作将颗粒锚定至油/水界面的蛋白质性结构组分。
在给定条件下，表面活性颗粒通过蛋白质-颗粒相互作用的制造路线不能推广到其他蛋白质如BSA。
实施例2-低纤维素植物纤维
测试了不同的植物纤维，即豌豆壳纤维(PHF)、富含果胶的苹果纤维、非纤维素小麦纤维。
测试相同的酶(Pectinex和Cellculast)、不同的酶(蛋白酶[
温育条件：10％TS，pH5，50℃，16小时，酶剂量：51.4mg蛋白质/g纤维。温度和pH对应于所有酶的最佳条件。酶失活：煮沸10分钟。
“乳液稳定性”：将1mL经酶处理的纤维(10重量/重量％，在pH5的缓冲液中，除非另有说明)加入50％油/水乳液的10mL水相(pH5)中。手动摇动乳液10秒。关于大的膏化油滴在9周内的对聚结的抗性进行稳定性评估。
结果
参照：具有用Pectinex和Celluclast(Pec+Cell)处理的0.4重量/体积％豌豆壳纤维(PHF)的50体积/体积％油/水乳液
用非纤维降解酶处理的PHF：
具有仅用非纤维降解酶(
用Pectinex和Celluclast处理的苹果纤维：
具有用Pectinex和Celluclast(AF-Pec+Cell)处理的0.4重量/体积％苹果纤维的乳液是不稳定的(图22A和图23A)。然而，所有对照[仅灭活酶(图23B)、具有灭活酶的苹果纤维(AF)(图23C)或仅AF(图3D)]均是稳定的，从而表明AF中存在的某些化合物干扰活性酶并在温育期间改变其功能。
据信，仅具有AF的样品的稳定效应源自AF中的可溶性果胶级分。经处理样品不存在稳定效应的事实归因于果胶被果胶酶降解的事实。
进一步的分析示出，稳定剂位于水合AF的不溶相中(图22C)，并且其也是包含功能性受到损害的化合物的不溶相(图22E)。在酶促反应之前对AF进行热处理(煮沸，15分钟)以使AF中潜在的天然蛋白酶灭活并未改变结果。
AF分散体的可溶相不稳定乳液(图22B)，但当用Pec+Cell处理时，观察到一些稳定的液滴(图22D)，这可归因于存在变性的表面活性Pec+Cell。
用Depol 740L处理的小麦纤维：
具有用阿魏酸酯酶，即Depol 740L(D740 L)(由Biocatalysts UK出售的具有阿魏酸酯酶和木聚糖酶副活性的β-葡聚糖酶)处理的0.4重量/体积％小麦纤维(WF)的乳液是不稳定的(图24B)，而具有灭活的D740 L的对照是稳定的(图24A)。如先前对于AF-Pec+Cell所观察的，WF中的某些化合物似乎抑制D740 L的表面活性。然而，当D740 L被Pec+Cell替代时，该抑制效果不存在(图24C)，从而指示该抑制是酶/底物特异性的。
用Pec+Cell处理的豌豆壳纤维，在热处理之前进行pH调节
用PHF和Pec+Cell进行另外的实验，其中在热处理(HT)之前将pH调节到2.0或11.0，以观察这是否改变酶-颗粒相互作用以及此类颗粒是否仍能够使油滴稳定。
无论HT之前的pH如何，均获得稳定的油滴。对于调节至pH11.0的PHF分散体而言，在不热处理的情况下获得表面活性，这最可能是由于pH诱导的变性。对于在HT之前调节至pH2.0的样品，情况并非如此。
结论
-在苹果纤维(高果胶纤维)或小麦纤维(含有低纤维素或不含纤维素的纤维)的情况下或在不能降解膳食纤维的酶的情况下，未观察到PHF-Pec+Cell的官能化途径。
实施例3-厨房原型：液体咖啡奶精和感官
初步感官试验示出由经酶促处理的PHF作为酪蛋白酸钠的替代乳化剂制备的液体咖啡奶精的良好接受度。
在选择的食物原型中测试经酶促处理的PHF(PHF-Pec+Cell)。选择液体咖啡奶精作为模型系统，以评估经酶促处理(官能化)的豌豆壳纤维(和变性酶)作为乳化稳定剂的潜力，并针对常规乳化剂酪蛋白酸钠来衡量其稳定性能。模型液体奶精的简化配方示于表12中。
通过制备具有恒定量的经处理PHF(每10mL乳液0.5mL)和变化的油:水比的乳液进行初步试验。用Ultra-turax以两种不同的剪切速率(13,000 1/分钟和22,000 1/分钟)混合乳液。乳液在两层体系中不稳定，膏化层的高度与油的体积分数成比例。由于在较高剪切速率下的均化步骤，与通过手动摇动获得的先前制备的50％油/水乳液相比，液滴尺寸显著降低，如图17所示。液滴尺寸保持在50μm的范围内。这些相对较大的油滴被认为是增强口感/糊口感的有利特性(图18)。
接着，通过用不同浓度的PHF部分或完全替代液体奶精中的酪蛋白酸钠，在实验厨房中制备五种不同的制剂，酪蛋白酸钠是目前使用的主要乳化剂(表12)。
表12液体奶精原型和参考的配方。
a在此，PHF指PHF-Pec+Cell
邀请8名专门小组成员进行感官评价，目的是获得关于用根据本发明的经酶促处理的PHF稳定的液体奶精与参考相比的稳定性、味道、口感和外观的信息。给予专门小组成员五种不同的样品和一种对照(所述对照同样是参考)以评估该试验的有效性。
奶精的图片在图19中示出。用PHF替换酪蛋白酸钠产生浅米色。对于所有样品，均发生膏化，并且对于样品C和D最明显。50:50PHF：酪蛋白酸钠共混物掩盖了对外观的所有不利影响。
对于由咖啡和奶精制备的样品也是如此(图20)。
专门小组成员的评论指示，与参考相比，由PHF制得的液体奶精示出总体良好的感官接受度。
用PHF稳定的液体奶精的主要优点是用纤维替代常规乳化剂作为清洁标签替代物。功能上的优点在于，预期有较大的油滴，这将增强口感。另一个优点是不完全表面覆盖，这有利于增加油相和水相之间的质量传递，并且可捕获侵蚀性亲脂性香味化合物(在例如咖啡中)。
实施例4：技术试验“解决方案豌豆壳”
对巧克力慕斯进行厨房规模的试验，以查看经处理的PHF可允许部分/全部替代人造乳化剂和/或明胶的程度。
OR＝膨胀度值
架藏期间巧克力慕斯配方1至6的图片在移除一勺慕斯后从顶部示出(图26)，并从前部示出(图27)。
在上述说明书中提及的所有出版物均以引用方式并入本文。在不脱离本发明范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改形式和变型形式将对本领域的技术人员显而意见。虽然已结合具体优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求书保护的本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员显而易见的对用于实践本发明的所述模式的各种修改旨在落在以下权利要求书的范围内。
