一种可循环利用可选择杀菌的N-卤胺水凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用高分子材料领域，具体涉及一种可循环利用可选择杀菌的N-卤胺水凝胶的制备方法。
背景技术
随着经济的快速发展，人们越来越关注有关健康方面的问题。而由细菌感染所引发的相关医学问题正日益成为临床研究的热点。抗菌材料是通过物理或化学的方法赋予生物医用材料一定的抗菌性，从而减少细菌的传播，最终减少相关疾病的发生。
水凝胶是一种亲水性的三维网状结构聚合物材料，可以在水中溶胀，吸收并保持大量水分，而不溶于水，达到溶胀平衡后扔能保持其形状。首先，水凝胶具有类似于细胞外基质的性质，比其他任何合成的生物材料都要接近活体组织；另外，水凝胶的表面不易粘附蛋白质等物质，故在与血液、体液以及人体组织相接触时具有很好的生物相容性；再次，水凝胶由于其三维的网络结构使其具有优异的渗透性，便于营养物质以及代谢物质的运输，可持续水凝胶周围细胞的生存和繁殖。因水凝胶优良的生物相容性，在生物医用材料领域具有广泛的应用，如用于组织工程、药物释放、伤口敷料、分子印刷、角膜接触眼镜、形状记忆材料、人造皮肤、生物传感器等，近年来抗菌水凝胶已成为一种有效地防止细菌侵袭和伤口进一步损伤的新型敷料。
目前，常见的抗菌水凝胶大多是通过无机的抗菌剂和本体材料复合，如含有纳米银的水凝胶和含有抗生素的水凝胶等，这种释放型的水凝胶具有污染环境、短期有效性等缺点。另外，制备抗菌水凝胶的方法是通过在材料表面接枝抗菌分子或者引入小分子抗菌单体，然后利用聚合以及化学或者物理方法交联而成，这种本体抗菌材料具有无污染、作用持久和不会引起细菌抗性等优点，作为医用敷料具有明显优势。但是，上述方法所制备的水凝胶不能实现选择性杀菌的抗菌水凝胶较少，而且大多数抗菌水凝胶不能实现循环利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：
本发明的目的是提供一种可循环利用且能选择杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶及其制备方法。该抗菌高分子材料通过引入海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)和N-卤胺。本发明所制备的水凝胶具有生物相容性好、无毒无害，机械性强，可实现选择性杀菌和可循环利用。
本发明所采用的技术方案：
一种可循环利用且能选择杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶的制备方法，所述水凝胶的制备方法包括如下步骤：
1)MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)的制备：将5质量份D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5质量份无水K2CO3混合加入到119质量份无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。其化学反应方程式为:
2)均聚物pMAG的制备：取0.8质量份上述合成的MAG与0.04质量份引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)混合，加入9.5质量份DMF(N-N-二甲基甲酰胺)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。其化学反应方程式为:
3)pMAG-Cl的制备：将1.1质量份的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25质量份的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl其化学反应方程式为:
其中，n＝2220-3555。
4)将0.4-1.2质量份聚乙烯醇(PVA)，溶于95℃的蒸馏水中，加入0.3质量份SA(海藻酸钠)，搅拌溶解后再向其中加入0.03-0.12质量份pMAG-Cl，将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；
5)将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L CaCl2溶液浸泡0.5-2h，得到最终产物抗菌水凝胶。
本发明所获得的有益效果：
选择性杀菌：本发明所制备的可循环利用可选择性杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶可以进行选择性杀菌，对大肠杆菌的杀菌率可以达到100％，而对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的杀菌率均很弱，最高可以达到20％-30％。
可循环利用：本发明所制备的可循环利用可选择性杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶在进行了5次循环，杀菌率均可以达到100％，且在水凝胶不损坏的前提下，可以实现多次循环利用。
附图说明
图1.抗菌水凝胶合成路线图；
图2.MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)的H—核磁氢谱图；
图3.MAG和pMAG的红外光谱图；
图4.pMAG和pMAG-Cl的紫外光谱图；
图5.pMAG和pMAG-Cl的XPS图；
图6.水凝胶的扫描电镜图；
图7.水凝胶的失水图；
图8.水凝胶的溶胀图；
图9.不同PVA含量水凝胶的应力-应变曲线；
图10.不同PVA含量水凝胶的拉伸模量图；
图11.不同浸泡时间水凝胶的应力-应变曲线；
图12.不同浸泡时间水凝胶的拉伸模量图；
图13.不同pMAG-Cl含量水凝胶的应力-应变曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
其中实施例1-实施例8的抗菌水凝胶合成路线图见图1。
实施例1
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.4g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.06g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例2
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.8g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.06g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例3
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将1.2g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.06g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例4
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.4g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.03g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例5
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.4g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.12g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例6
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将1.2g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.12g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡1h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例7
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.8g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.06g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡0.5h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例8
将5g D(+)-氨基葡萄糖盐酸盐与5g无水K2CO3混合加入到119mL无水甲醇中，冰浴反应4h后，通过硅胶层析柱进行纯化，将纯化后的样品真空干燥24h，得到MAG。取0.8g上述合成的MAG与0.04g引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混合，加入9.5mL N-N-二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，70℃反应10h，再将反应产物用透析袋透析3天，冷冻干燥后得到其均聚物pMAG。将1.1mL的10％的NaClO溶液稀释至3％-5％，用盐酸调节PH＝7±0.02，将0.25g的pMAG加入上述NaClO溶液中，磁力搅拌12h后，用透析袋透析3天后，冷冻干燥得到pMAG-Cl；将0.8g聚乙烯醇，溶于约95℃的蒸馏水中，加入0.3g海藻酸钠搅拌，溶解后再向其中加入0.06g pMAG-Cl。将混合液倒入模具中，将其在冰箱-22℃下存放22h；将冷冻水凝胶解冻，再将水凝胶用0.1mol/L的CaCl2溶液浸泡2h，得到最终产物抗菌水凝胶。
实施例9
本发明所制备的可循环利用可选择性杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶(质量比SA:PVA＝0.3：0.4，0.3：0.8，0.3：1.2)分别与106cfu/mL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌作用，对大肠杆菌的杀菌率可以达到100％，而对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的杀菌率均很弱，最高可以达到20％-30％，由此可以说明对大肠杆菌具有选择性杀菌功能。将不同PVA含量(0.4g、0.8g、1.2g)的水凝胶分别与GLC-82细胞接触24h，细胞存活率均高于空白值，由此可以说明不同含量的PVA水凝胶均没有细胞毒性，而且有助于细胞增殖。
实施例10
本发明所制备的可循环利用可选择性杀菌的N-卤胺抗菌水凝胶(质量比SA:PVA＝0.3：0.4，0.3：0.8，0.3：1.2)，在一次杀完菌之后(即水凝胶中的活性氯(Cl+、N-Cl、ClO-)全部释放完)，将另一块儿还有活性氯(Cl+、N-Cl、ClO-)的水凝胶覆盖到此水凝胶上，在很短的时间之内，另一块儿水凝胶上的活性氯(Cl+、N-Cl、ClO-)便可释放到此水凝胶之中，此水凝胶又具备了杀菌功能，这样就达到了循环利用。本发明所进行了5次循环，杀菌率均可以达到100％，且在水凝胶不损坏的前提下，可以实现多次循环利用。
对实施例1-8所制备的MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)进行相应测试：
如图2所示，MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)的H—核磁氢谱数据(D2O)：δ＝5.61ppm和δ＝5.38ppm分别是C＝C上的两个氢的化学位移值。δ＝5.13ppm和δ＝4.69ppm分别是吡喃葡萄糖环1位碳上的α-CH和β-CH的化学位移值。δ＝3.36-3.81ppm为葡萄糖环中除1位碳以外其他5个碳上的氢的化学位移值。δ＝1.84ppm是CH3上氢的化学位移值。上述特征峰的峰面积比约为1:1:0.52:0.43:6:3。证明MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)合成成功。
如图3所示，MAG(2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖)和pMAG的红外吸收光谱数据(KBr)：通过比较可以看出，在MAG中，3090cm-1左右存在＝C-H键的伸缩振动吸收峰，1654cm-1左右有C＝C键的伸缩振动吸收峰，而在pMAG中并无此特征吸收峰值。通过＝C-H键和C＝C键伸缩振动吸收峰的消失，证明pMAG合成成功。
对实施例1-8所制备的pMAG-Cl进行相应测试：
碘量法测定pMAG-Cl：碘量法可以测定N-卤胺中的有效氯含量，另一方面，由于在滴定过程中存在明显的颜色变化，我们也可以对其进行定性判断。pMAG-Cl的水溶液为透明无色。向其中加入H2SO4和KI后，变为浅黄色，证明N-卤胺中的活性Cl将I-氧化生成I2，I2与过量I-结合形成I3-，而I3-在低浓度时为浅黄色。加入淀粉后，溶液变为蓝黑色，这也证明了I2和I3-的存在。用Na2S2O3标准溶液进行滴定，可以观察到蓝黑色逐渐变浅，直至恢复无色，此时即为滴定终点。通过碘量法，证明了pMAG-Cl中有效氯的存在，表明pMAG-Cl的成功合成。
如图4所示，pMAG-Cl的紫外光谱数据：在加入1％的KI溶液、2mol/L的H2SO4溶液、以及pMAG-Cl的溶液中，在288nm和350nm处存在明显的吸收峰，证明pMAG-Cl合成成功。
如图5所示，pMAG-Cl的XPS数据：102eV、152eV、200eV、285eV、400eV、532eV分别为Si 2p、Si 2s、Cl 2p、C 1s、N 1s、O 1s的电子结合能。需要指出的是，Si并不是样品所包含的元素，Si 2p、Si 2s的电子结合能是由固定样品的基底产生的。在样品氯化前后，N 1s的电子结合能仅发生了微小的改变。从图中可以观察到pMAG-Cl在200eV存在明显的Cl 2p峰值，说明有效氯的存在。由此得出，pMAG-Cl合成成功。
对实施例1-8所制备的抗菌水凝胶进行相应测试：
如图6所示，水凝胶的扫描电镜测试：将制成的水凝胶样品放入冷冻干燥中干燥24h，取一小块儿测扫描电镜。可以看出，水凝胶呈现明显的孔洞结构，说明合成的水凝胶具有双网络结构。
如图7-8所示，失水与溶胀测试：为了测量水凝胶的含水量，取直径约为2cm，厚度约为2mm的水凝胶样品。每隔固定的时间间隔，称取水凝胶的质量。由图可以看出，水凝胶的失水速率呈现先快后慢的趋势，到24h后，水凝胶的质量基本不再发生变化，按公式计算含水量，水凝胶的含水量约为92.36％。
Qd＝(Ws-Wd)/Ws×100％
其中，Ws是水凝胶样品的初始质量，Wd是干燥后水凝胶样品的质量。
为了测量水凝胶的溶胀率，取直径约为2cm，厚度约为2mm的水凝胶样品，冷冻干燥24h后取出。将干燥后的样品浸泡于磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.3)中，每隔固定的时间间隔，将水凝胶取出，用滤纸尽量擦干水凝胶表面的溶液，并称取其质量。一段时间后，水凝胶的质量基本不再发生变化，按公式计算水凝胶的溶胀率。
Qw＝(M1-M0)/M0×100％
其中，M0是干燥后水凝胶的质量，M1是水凝胶放入缓冲溶液浸泡后的质量。如图所示，浸泡约3h后，水凝胶的质量基本不再发生变化，溶胀率约为650％-750％。
如图9-13所示，水凝胶的机械强度测试：通过拉伸法测试机械强度得出以下结论：一、控制其他组分不变，当聚乙烯醇(PVA)的含量增大时，水凝胶的强度逐渐增大，且拉伸模量也逐渐增大；二、在氯化钙溶液中的浸泡时间越长，水凝胶的强度逐渐增大，且拉伸模量也逐渐增大；三、控制其他组分不变，当pMAG-Cl的含量逐渐增大时，水凝胶的强度逐渐减小，相应的拉伸模量也逐渐减小，这是因为高分子N-卤胺的加入阻碍了网络结构的形成。
