一种谷胱甘肽修饰的杂化材料及其制备与应用
技术领域
本发明涉及一种糖肽富集材料，具体是一种谷胱甘肽功能化的杂化材料及其制备，以及其在生物样品中的糖肽富集应用。
背景技术
蛋白质翻译后修饰一直是蛋白质组学研究的热点课题。蛋白质糖基化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，在众多重要的生命活动中起着十分关键的作用，哺乳动物体内50％以上的蛋白质都会在其一生的某个阶段发生糖基化修饰。许多与人类相关疾病都与蛋白质糖基化表达程度差异和糖链异常结构变化相关，分析和鉴定蛋白质糖基化修饰对疾病标志物发现和疾病诊断具有重要意义(文献1.Lowe,J.B.,Glycosylation,immunity,andautoimmunity[J].Cell,2001,104(6):809-812.)。目前临床上常用的癌症生物标志物中大部分为糖基化蛋白质，比如甲胎蛋白是肝癌的生物标志物，前列腺特异性抗原是前列腺癌的生物标志物(文献2.Krueger,K.E.,Srivastava,S.,Posttranslational proteinmodifications:current implications for cancer detection,prevention,andtherapeutics[J].Mol.Cell.Proteomics,2006,5(10):1799-1810.文献3.Polanski,M.,Anderson,N.L.,Polanski,M.,Anderson,N.L.,A List of Candidate Cancer Biomarkersfor Targeted Proteomics[J].Biomarker Insights,2007,1:1-48.)。然而在糖基化修饰研究中，糖基化蛋白质相对丰度较低，酶解后产生的糖基化肽段仅占蛋白质酶解肽段的2～5％，在质谱分析中的信号受到非糖基化肽段的抑制，因此，需要高效的分离富集方法去除糖基化样品中的非糖基化蛋白质或肽段。目前富集糖肽的主要方法有凝集素亲和色谱法，硼酸亲和色谱法，酰肼化学法，二氧化钛亲和色谱法和亲水相互作用色谱法。其中HILIC在选择性、重复性、质谱兼容性等方面的优势，使其在糖肽富集中得到越来越多的青睐。但目前亲水法所使用的富集材料大都存在制备过程繁琐、周期较长等缺陷。因此，发展一种制备方法简单的亲水富集材料依然是研究人员的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽功能化的杂化材料的制备及应用，其可用作亲水色谱的固定相高效快速地完成对蛋白质组学中糖肽的分离富集。
为实现上述目的，可按如下步骤操作，
1)乙烯基功能化的杂化材料的制备：首先称取5～50mg十二胺和10～40mg十六烷基溴化铵放入离心管中，并加入50～300μL乙醇和50～300μL水，超声溶解形成均一溶液后，在冰浴下加入50～200mg四乙氧基硅烷和50～200mg 7-辛烯基三甲氧基硅烷，再放入温度为35～55℃的水浴中反应12～48h；将得到杂化材料用乙醇/水溶液(1/1,v/v)洗涤三次，60℃真空干燥12～24h，得到乙烯基功能化的杂体材料。
2)谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备：首先将20～100mg谷胱甘肽和0.3～3.0mg的光引发剂DMPA溶解在乙醇含量为20％～80％的水溶液中。其次将乙烯基功能化的杂体材料平铺于直径为1～10cm的表面皿中，吸取1～10mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中。然后将表面皿至于紫外灯下曝光10～30min。取出后用药勺轻轻搅动杂化材料，添加1～10mL谷胱甘肽修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光10～30min。用乙醇含量为20％～80％的水溶液洗涤所得到的材料2～4次，60℃真空干燥12～24h，得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
所述谷胱甘肽功能化的杂化材料可用生物样品中糖肽的分离富集。
本发明具有如下优点：
(1)制备方法步骤简单，条件温和，易于操作；
(2)原料成本低廉，适合于大尺度制备。
附图说明
图1为乙烯基杂化材料制备示意图。
图2为乙烯基杂化材料与制备功能单体的傅里叶变换-红外光谱对比图。
图3为实施案例乙烯基杂化材料的扫描电镜图。
图4为乙烯基杂化材料的氮气吸附/脱附曲线和孔径分布图。a，c：实施例1；b，d：实施例2。
图5为实施例1中谷胱甘肽修饰后杂化材料对免疫球蛋白(IgG)酶解液富集前后的质谱对比图。
图6为实施例1中谷胱甘肽修饰后杂化材料对鼠肝酶解液富集后的色谱分离图。
图7为富集后鼠肝蛋白质酶解液鉴定结果Venn图。
图8为谷胱甘肽修饰后杂化材料对免疫球蛋白(IgG)酶解液富集后的质谱图。a：实施例2；b：实施例3。
具体实施方式
实施例1谷胱甘肽功能化的杂化材料用于糖肽的分离富集。
谷胱甘肽功能化的杂化材料的制备：
1)乙烯基功能化的杂化材料的制备：首先称取5mg十二胺和20mg CTAB放入离心管中，并加入175μL乙醇和125μL水，超声溶解形成均一溶液后，在冰浴下加入100mg四乙氧基硅烷和100mg 7-辛烯基三甲氧基硅烷，再放入温度为40℃的水浴中反应24h；将得到杂化材料用乙醇/水溶液(1/1，v/v)洗涤三次，60℃真空干燥12h，得到乙烯基功能化的杂体材料。
2)谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备：首先将20mg谷胱甘肽和2mg的光引发剂DMPA溶解在10mL乙醇含量为50％的水溶液中。其次将100mg乙烯基功能化的杂体材料平铺于直径为2cm的表面皿中，吸取5mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中。然后将表面皿至于紫外灯下曝光20min。取出后用药勺轻轻搅动杂化材料，添加5mL谷胱甘肽修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光20min。用乙醇含量50％的水溶液洗涤所得到的材料3次，60℃真空干燥12h，得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
实施例2谷胱甘肽功能化的杂化材料用于糖肽的分离富集。
谷胱甘肽功能化的杂化材料的制备：
1)乙烯基功能化的杂化材料的制备：首先称取50mg十二胺和20mg CTAB放入离心管中，并加入175μL乙醇和125μL水，超声溶解形成均一溶液后，在冰浴下加入100mg四乙氧基硅烷和100mg 7-辛烯基三甲氧基硅烷，再放入温度为40℃的水浴中反应24h；将得到杂化材料用乙醇/水溶液(1/1,v/v)洗涤三次，60℃真空干燥12h，得到乙烯基功能化的杂体材料。
2)谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备：首先将20mg谷胱甘肽和2mg的光引发剂DMPA溶解在10mL乙醇含量为50％的水溶液中。其次将100mg乙烯基功能化的杂体材料平铺于直径为2cm的表面皿中，吸取5mL谷胱甘肽修饰液于表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中。然后将表面皿至于紫外灯下曝光20min。取出后用药勺轻轻搅动杂化材料，添加5mL谷胱甘肽修饰液。再次将表面皿至于紫外灯下曝光20min。用乙醇含量50％的水溶液洗涤所得到的材料3次，60℃真空干燥12h，得到谷胱甘肽修饰的杂化材料。
IgG酶解样品的制备：人血清免疫球蛋白(Human immunoglobulin G，IgG)1mg溶解在含8M尿素的100mM的碳酸氢铵溶液中(pH＝8.2)，加入80μmol二硫苏糖醇，在60℃恒温1h，再加入40μmol碘代乙酰胺，避光40min，用100mM的碳酸氢铵溶液将尿素浓度稀释成1M，按照与胰蛋白酶的质量比为1:40的加入胰蛋白酶，在37℃的水浴中反应时间16h，获得的酶解液除盐，冻干后保存在-20℃的冰箱中备用。
糖基化肽的富集：首先将10μg IgG酶解液或者80μg鼠肝酶解液用200μL上样液(ACN/H2O/TFA，88:11.9:0.1，v/v/v)稀释，加入10mg谷胱甘肽功能化的杂化材料后，室温震荡10min。离心，除去上清液。然后采用上样液(400μL×3次)清洗，以除去非糖肽和其他杂质。接着加入60μL洗脱液(ACN/H2O/TFA，30:69.9:0.1，v/v/v)并室温震荡10min后，混合物离心，取上清液用Triple TOF 5600质谱进行MALDI-TOF/MS分析。另外，可将上清液冷冻干燥后，加入60μL含1000U PNGase F酶的10mmol/L NH4HCO3溶液(pH＝8.0)，37℃下孵育12h，以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用MALDI-TOF/MS或者nano-LC-MS/MS方法进行分析。
产物表征
实施案例1制备杂化材料的红外图如图2所示，在功能单体四乙氧基硅烷和7-辛烯基三甲氧基硅烷的红外谱图中，波数2974和2889cm-1处的吸收峰为Si-O-C2H5中的C-H伸缩振动。而波数1391、1296cm-1处的吸收峰为-CH3中C-H的对称弯曲振动。1100与1073cm-1处的吸收峰为Si-O-C2H5中的Si-O伸缩振动。自由基反应完成后，得到的杂化材料的红外谱图中出现了1602cm-1处的C＝C伸缩振动峰，1391、1296cm-1处归属于-CH3中的C-H的对称弯曲振动，而1100与1073cm-1处归属于Si-O-C2H5中的Si-O伸缩振动双峰被1080cm-1处Si-O-Si的Si-O宽峰取代。这说明合成的杂化材料中引入了C＝C官能团，这为材料的后期修饰提供了有利条件。
扫描电镜如图3a和b，可以清晰看到材料经过研磨后大部分破碎成无定型状。
氮气吸附脱/附曲线如图4a所示，孔径分布曲线如图4b所示。材料BET比表面积为485cm2/g，孔体积为0.20cm3/g，有明显的4.0nm左右的介孔。
产物应用
采用标准蛋白IgG评价材料的糖肽富集效果。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行检测。图5为IgG酶解液富集前后的效果对比图。如图5a所示，富集前，谱图中峰强度较高的信号绝大多数为非糖肽，糖肽的信号几乎都被抑制了，仅检测出一条。用材料富集后，如图5b所示，非糖肽明显减少，可以检测到20条典型的N-连接糖肽。为了验证富集的肽段均为糖肽，肽段采用PNGase F酶进行去糖基化处理。结果发现，图5b中的糖肽信号基本消失，图5c中仅能见到两条明显的肽段信号(EEQFNSTFR，m/z＝1158.65；EEQYNSTYR，m/z＝1190.32)，这说明功能材料从IgG中所富集的肽段均为糖肽。
表1谷胱甘肽功能化材料富集到的IgG酶解液中糖肽的分子量及糖型组成
N#表示糖基化位点；Hex:甘露糖；HexNAc:N-乙酰葡糖胺；Fuc:岩藻糖。
将材料进一步应用于更复杂的样品鼠肝酶解液中糖肽的深度富集，用nano-LC-MS/MS方法进行分析鉴定。共进行了三次独立分析实验，每次使用10mg吸附剂对80μg的鼠肝蛋白质酶解液进行富集。富集后在C18硅胶分析柱上的色谱分离图如图6所示，三次独立分析鉴定结果如图7所示。通过对搜库结果的处理计算，总共鉴定到了来自711个蛋白的1638条糖肽以及674个糖基化位点。这一结果，与文献报道的使用两性金团簇颗粒以及使用聚酰亚胺和麦芽糖分步修饰的磁性纳米颗粒作为HILIC吸附剂时的效果相当，但是本专利所采用的方法更加简单，成本也更加低廉。
实施例2利用谷胱甘肽功能化的杂化材料用于糖肽的分离富集。
谷胱甘肽功能化的杂化材料的制备：
1)乙烯基功能化的杂化材料的制备：同实施例1，在预聚液中减低烯基单体的含量，将四乙氧基硅烷和7-辛烯基三甲氧基硅烷的质量分别更换为170mg和30mg，采用与实施例1相同的步骤制备杂化材料。
2)谷胱甘肽修饰的杂化材料的制备：采用与实施例1相同的步骤对乙烯基杂化材料进行谷胱甘肽的修饰。
结果:实施案例2制备的材料的扫描电镜如图3c，d所示，材料略成微球状。氮气吸附/脱附曲线如图4c，d所示，BET测试比表面积为1493m2/g，孔体积为0.63cm3/g。孔径分布图上看不出有明显的介孔，说明材料中含有大量的微孔。在IgG酶解液中仅富集到了15条糖肽，低于同等条件下实施案例1所制备的材料的糖肽富集效果(图8a)，这可能归因于实施案例2合成的预聚液中7-辛烯基三甲氧基硅烷单体含量较低，导致合成的杂化材料中可供亲水修饰的乙烯基基团较少，加上微孔里的活性位点利用率较低，进一歩导致亲水富集效果的下降。
实施例3利用谷胱甘肽功能化的杂化材料用于糖肽的分离富集。
谷胱甘肽功能化的杂化材料的制备：
在预聚液中使用烯基间隔臂较短的乙烯基三甲氧基硅烷代替隔臂较长的7-辛烯基三甲氧基硅烷，采用与实施案例1相同的步骤制备杂化材料及后期修饰，糖肽富集结果如图8b所示，同等条件下仅可以从IgG酶解液中富集出9条糖肽。这说明较长的间隔臂可以提高谷胱甘肽的键合量，有利于糖肽的富集。
