一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法
技术领域
本发明属于蛋白质富集技术领域，尤其是涉及一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法。
背景技术
在不同病理状态或药物干扰的情况下，新生蛋白质的发现在揭示疾病发生机制、发现药物作用过程的解释中都具有极为重要的意义。然而，在复杂的生物样品中，新生蛋白质没有标记，很难区分新生蛋白质和已经存在的蛋白质，同时新生蛋白质的丰度极低，通过常规方法很难直接检测到。
目前，新生蛋白质富集的方法中BONCAT(PNAS,2006,103:9482-87；NatureProtocols,2007,2:532-540)应用最广，后期发展的QuaNCAT(Nature Methods,2013,10:343-46)方法结合了SILAC技术可以富集同时定量新生蛋白质，最近发展的HILAQ(J.Proteome Res.,2017,16:2213-2220；Nature Protocols,2018,13:1744–1762)技术结合了轻重同位素AHA富集并定量新生蛋白质。以上这些方法都是借助生物素(biotin)和链霉亲和素(avidin)的亲和富集，主要步骤是通过click反应将生物素接到含有AHA的新生蛋白质上，使新生蛋白质带上生物素标签从而富集。在生物医学领域，利用生物素和链霉亲和素的亲和相互作用进行富集得到了广泛应用。但是这种技术存在的问题有：(1)由于生物素和链霉亲和素之间是非共价作用，不能用比较强烈的条件进行洗涤，往往造成非特异吸附蛋白的干扰严重，如果洗脱条件很剧烈则回收率低；(2)富集后肽段带有生物素基团，生物素分子会影响色谱分离且降低肽段的离子化效率，严重影响蛋白质的鉴定。
发明内容
本发明基于背景技术中BONCAT、QuaNCAT和HILAQ方法存在的缺陷，而提供一种新的特异性可逆富集新生蛋白质的方法。
本发明是基于生物正交反应的可逆富集方法检测细胞中的新合成蛋白质。
本发明设计并合成炔基肽段键合到树脂材料制备得炔基树脂，炔基树脂结构稳定、富集容量高、分离方便可靠。该炔基树脂用于富集AHA标记的新生蛋白质，这一技术使得新生蛋白的研究更加便捷、更高通量。
本发明的方法高效、简便、可逆富集，能够在新生蛋白富集鉴定中广泛应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一种炔基树脂的制备方法，具体为：将炔基肽段与醛基树脂通过还原烷基化反应连接，合成炔基树脂，所述炔基树脂表示为alkyne-resin。
进一步地，所述炔基肽段为GLGAGLLAR(aPra)，其氨基酸序列为GLAGLLAR(L-Pra-NH2)。
其中，L-炔丙基甘氨酸简称为L-Pra，将L-Pra的羧基端经过氨基化处理，保护肽段末端活性羧基，可以避免羧基端潜在的副反应。经酰胺化的L-炔丙基甘氨酸表示为L-Pra-NH2，简称为aPra，为一整体结构，所以放在括号中进行表示为(aPra)，即该结构含有炔基用于后续的生物正交反应。
本发明中，设计该炔基肽段需具备两个重要的功能：其一，将L-Pra的羧基进行酰胺化保护形成aPra，仅留有炔基是活性基团；其二，设计该肽段的序列为GLAGLLAR，该序列能被胰蛋白酶识别并快速酶解(Nature Methods，2014，11：220-222)，可用于高效释放新生肽段。
在本发明的一个实施方式中，所述醛基树脂为可用还原胺化连接的醛基功能化树脂材料(AminoLink aldehyde-functionalized resin,Pierce)，可以选自商品化醛基树脂(
在本发明的一个实施方式中，炔基树脂的制备方法具体包括以下步骤：炔基肽段与醛基树脂的耦联：炔基肽段、醛基树脂、耦联试剂、还原试剂在室温反应，然后用洗涤试剂洗涤多次；
封闭剩余活性基团：加终止试剂，室温反应；
洗涤炔基树脂：洗涤多次，得到炔基树脂，保存备用。
其中，所述耦联试剂选自含有0.1M Na3PO4，0.15M NaCL，pH 7.2的PBS。
其中，所述还原试剂选自5M NaCNBH3。
其中，所述终止试剂选自1M Trist-HCl(pH7.4)。
其中，所述洗涤试剂为1M NaCl。
所述炔基肽段、醛基树脂、耦联试剂、还原试剂、终止试剂的比例关系为：5～20ug：10uL：200uL：20uL：200uL，此处醛基树脂用量可以根据需要按比例增加。
在本发明的一个具体实施方式中，炔基树脂的制备方法为：将10μg肽段与10μL醛基树脂耦联：加耦联试剂200μL，还原试剂5μL，在室温反应6h，用耦合试剂洗涤3次；封闭剩余活性基团：加终止试剂200μL，室温反应30min，得到炔基树脂；洗涤炔基树脂：洗涤3次每次200μL，4℃保存备用。
本发明还进一步提供上述制备方法获得的炔基树脂。炔基树脂结构稳定、富集容量高、分离方便可靠。
本发明提供一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法，其富集分离的具体步骤如下：
步骤1、用AHA标记细胞，提取全蛋白；
步骤2、取细胞全蛋白和所述炔基树脂通过click反应连接；
步骤3、用不同的缓冲液洗涤炔基树脂非特异吸附的蛋白质，以除去非特异性吸附的蛋白质；
步骤4、用胰蛋白酶酶切释放目标肽段；
步骤5、收集样品进行质谱分析。
在本发明的一个实施方式中，用AHA标记细胞即获得叠氮标记的蛋白样品，获得叠氮标记的蛋白样品的方法为：
先将待检测细胞在不含有甲硫氨酸的培养基(也称甲硫氨酸缺失培养基)中加入透析型血清，进行饥饿培养30min；
然后，将甲硫氨酸缺失培养基中加入1mM的叠氮丙氨酸(AHA)，即得AHA标记培养基，加入透析型血清，继续培养细胞，培养时间为1～24h，可以根据实验需要调整，收细胞；
加入细胞裂解液，超声裂解，离心取上清；BAC试剂盒定量蛋白质，-80℃保存备用。
在本发明的一个实施方式中，细胞培养选用DMEM，其组成见Gibco10566。甲硫氨酸缺失培养基是指将DMEM中甲硫氨酸去除的培养基，具体是选用甲硫氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺缺失的DMEM培养基(Gibco 21013024)，补加半胱氨酸和谷氨酰胺，得到自制甲硫氨酸缺失培养基。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞裂解液选择0.5％SDS细胞裂解液。
在本发明的一个实施方式中，细胞裂解液组成为0.5％SDS，1M NaCl，200mM Tris(pH8.4)。
在本发明的一个实施方式中，所述细胞裂解液加入量为8倍细胞沉淀的体积。
在本发明的一个实施方式中，细胞全蛋白和炔基树脂通过click反应连接的方法为铜催化生物正交反应，也称之为CuAAC反应，反应条件为：细胞全蛋白和炔基树脂混合后加入催化混合液，加PBS，放暗处在室温振荡1h。
其中，细胞全蛋白、炔基树脂、催化混合液、PBS加入量为500μg～2mg：10μL：2μL：8μL，其中炔基树脂用量可以根据需要按比例增加，具体操作时可以根据需要按照此比例放大反应量。
在本发明的一个实施方式中，所述催化混合液由抗坏血酸、BTTP、硫酸铜组成，抗坏血酸、BTTP、硫酸铜以摩尔比为10：6：1。
在本发明的一个实施方式中，所述催化混合液是将10mM抗坏血酸钠、1mM硫酸铜和6mM BTTP配成10X催化剂混合液。
在本发明的一个实施方式中，用不同的缓冲液洗涤炔基树脂上非特异吸附的蛋白的方法为：用SDS，尿素和乙腈，依次洗涤，洗涤液浓度为：1％SDS，8M尿素，50％乙腈/水(v/v)。
在本发明的一个实施方式中，不同的缓冲液洗涤非特异吸附的蛋白的具体操作方法为：用200μL 1％SDS洗涤树脂材料，10000g离心3min，重复三次，然后再依次用1％SDS，8M尿素，PBS和50％乙腈溶液洗涤材料，除去非特异性吸附的蛋白质及其它污染。其中1％SDS除去树脂材料上非特异吸附的蛋白质，用8M尿素是洗去1％SDS，用PBS是洗去8M尿素，50％乙腈洗残留的肽段。因为富集的连接是通过生物正交反应形成的化学键，故可以用严苛的条件洗涤，保证了富集的高选择性。
在本发明的一个实施方式中，用胰蛋白酶酶切释放目标肽段的反应条件为：在50mM NH4HCO3溶液中，将缓冲液洗涤后的炔基树脂，加胰蛋白酶37℃酶切过夜。
在本发明的一个实施方式中，用胰蛋白酶酶切释放目标肽段时，所述胰蛋白酶的加入质量与洗涤后的炔基树脂上残留的肽段的质量比例关系为1：10(其中，洗涤后的炔基树脂上残留的肽段是根据标准肽段估计的，10ug标准肽段/10uLresin)。可以酶切两次以提高释放效率。酶解解离并释放含有AHA的新生蛋白质，同时在AHA上带有(aPra)基团。
在酶切肽段的同时释放肽段，充分利用了酶切高效保证了高的释放效率，酶解位点的选择性进一步提高了富集释放的选择性；相对于传统的Biotin-streptavidin释放的方式，本发明方法不仅能耐受强烈的洗脱溶剂排除非特异性干扰，而且不用极端浓度SDS煮沸释放的方式，同时酶解条件与色谱质谱兼容，不影响质谱离子化效率提高了鉴定的结果，在操作流程上极大简化减少样品损失。
在本发明的一个实施方式中，收集样品进行质谱分析的方法为：nano-LC-MS/MS分析，肽段含有(aPra)-AHA可以指认对应的蛋白质为新生蛋白质。
在本发明的一个实施方式中，收集样品进行质谱分析前还有冻干除盐的步骤。
非天然氨基酸代谢掺入法可以标记新生成蛋白，本发明方法选用叠氮丙氨酸(Azidohomoalanine，AHA)代替甲硫氨酸，使细胞中的新生成的蛋白质带有非天然的叠氮基团。利用生物正交反应富集带有叠氮氨基酸的新生蛋白质，借助反应的正交性实现高选择性富集，借助化学键合的稳定性实现高特异性的富集，借助酶切可以高效释放，最终实现高效可逆富集细胞中的新生蛋白质。
本发明设计并合成炔基树脂材料，富集连接和解离过程保证了高选择性和高效性，富集后的新生肽段带有特定的质量标签(小分子量的氨基酸)，标签肽段可用于蛋白质的鉴定，更重要的是借助标签的质量增加可以直接指认新生蛋白质，解决鉴定同时质谱指认新生蛋白质的问题。本发明的方法通过共价键作用代替亲和作用富集新生蛋白质，利用高效酶切释放代替SDS解离，实现了新生蛋白质的高特异性富集，质量标签质谱兼容且帮助鉴定和指认新生蛋白质，整个富集流程得到大大简化减少了样本需要量。
本发明设计的方法中，材料上的炔基和新生蛋白质的叠氮通过生物正交连接，该反应具有高选择性，保证了对体内新生蛋白质富集的特异性，click反应的高反应效率保证了富集技术具有低的检测限；同时，富集过程不可避免地会有非特异吸附地干扰，click反应形成的是共价键，允许使用强的洗涤条件，可以最大程度地降低非特异性吸附；最后，材料上释放采用胰蛋白酶酶切，不仅保证了高效的释放效率，而且得到的肽段所在体系与色谱质谱兼容。整个流程在保证富集选择性的基础上，在操作得到极大简化。
本发明将高选择性的富集方法结合标记技术和色谱质谱分析技术，为鉴定新合成蛋白提供可能。
本发明通过生物标记、选择性共价键合、严格洗脱条件及选择性解离，实现对新合成低丰度蛋白质的高选择性富集，结合nano-LC-MS/MS能够实现大规模分析鉴定蛋白质，根据增加的质量标签可以进一步指认新生蛋白质。本方法为新生蛋白质的高效富集和准确指认提供了高效的方法，广泛用于低丰度的新生蛋白质组学的研究领域。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：
1.基于生物正交反应的高反应效率和胰蛋白酶的酶切效率，富集回收率高，可以达到84％；
2.借助生物正交反应的高选择性，和共价键合的牢固结合允许严苛的洗涤，富集的特异性高，达到目前文献最高蛋白的选择性达到95％以上；
3.本方法通过设计肽段的序列，将洗脱和释放合二为一，不仅简化流程，同时减少了样品的消耗。可以用最少量的样品500ug的起始样品量，单次实验鉴定并确认4335个新生蛋白质，是目前最大的鉴定量，HILAQ方法鉴定最大规模是3151新生蛋白质。
附图说明
图1为可逆标签(CBOT)的富集原理示意图。
GLAGLLAR(aPra)肽段含有三个反应位点，图中所示的位点1是肽段C-端炔基用于click反应结合叠氮肽段，TEV酶切特征的序列和位点(site 2)用于释放目标肽段，肽段N-端氨基通过还原胺化固定到醛基树脂(resin-CHO)。经过CBOT富集的肽段，带有一个(aPra)，质量增加112.14，用于质谱鉴定和肽段指认。
图2为评价功能化树脂材料(resin-alkyne)上炔基容量的MALDI谱图。
图中炔基肽段GLAGLLAR(aPra)(m/z 864,用“*”标记)；内标肽用“#”标记(m/z1048)。分别取炔基肽段1μg(a),5μg(b),10μg(c)and 20μg(d)与10μL醛基树脂耦联，MALDI检测上清中炔基肽段的残留。
图3为铜催化生物正交(CuAAC)反应中还原剂和配体的比较。通过MALDI检测产物，还原剂分别是抗坏血酸和TCEP(a)，配体分别比较了BTTP，BTTAA，BTTPS和THPTA(b)。
图4为实施例1中考察CBOT富集叠氮肽段的富集回收率。
富集前(a)叠氮肽段和富集后(b)经酶切得到的产物肽段的MALDI谱图。叠氮肽段(AZA)ALELFR(m/z 860)用“#”标记，产物(aPra)(AZA)ALELFR(m/z 972)用“*”标记，内标肽(m/z 1048)用“◆”标记。
图5为CBOT富集细胞中新生蛋白质的实验流程。
具体流程为首先AHA标记使新生蛋白质带有叠氮标签，将蛋白质酶解为肽段后，经click连接、强烈洗涤、酶切释放富集标记肽段，最后色质联用鉴定新生蛋白质。
图6为实施例2中HEK293T细胞中新生蛋白质的鉴定结果。
CBOT富集后鉴定到的新生蛋白质(a)和AHA肽段(b)的数目，以及在三次技术重复中的交盖情况。
图7为实施例2中在蛋白质和肽段层面上评价CBOT方法的富集效率。
图(a)表示富集前后鉴定到的蛋白质和肽段的柱状图，具体数目列在图(b)表中。其中A、C柱代表带有AHA标记的新生蛋白质或肽段，B、D柱代表不含AHA的蛋白质或者肽段，深色(A、B)代表蛋白质，浅色(C、D)代表肽段。
图8为实施例3中CBOT方法用于定量细胞中新生蛋白质的组学结果。
经轻重同位素AHA/hAHA标记的HEK293T细胞，经CBOT富集可以定量新生蛋白质，图中是含有AHA的蛋白质(a)和AHA肽段(b)的数目以及在三次技术重复中的交盖情况。
图9为实施例3CBOT定量新生蛋白质的定量结果相关性和数据分布直方图。
图10为实施例4CBOT方法用于雷帕霉素激活自噬过程(a)和自噬过程中鉴定定量到的新生蛋白质(b)。
图11为实施例4雷帕霉素激活自噬的生物通路。
自噬通路上的已知自噬相关蛋白质，灰色高亮的是CBOT富集后鉴定到的新生蛋白质。
图12为实施例4Western验证雷帕霉素诱导致使自噬通路被激活后LC3和p62的表达量。
Rapa代表雷帕霉素激活自噬，Baf/Wort是抑制自噬通路的对照组，其中ACTB是上样量的参照。
具体实施方式
本发明利用特异性可逆富集的方法来实现细胞新合成蛋白的富集，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：基于可断裂生物正交可逆标签(CBOT)建立的方法富集合成的叠氮肽段，CBOT标签的富集原理见图1，实验具体流程如下：
(1)取商品化的醛基树脂10μL，加10μg合成的炔基肽段GLAGLLAR(aPra)，在pH7.4的PBS中加入还原剂NaCNBH3，使发生还原烷基化反应，得到炔基功能化的树脂材料，简称炔基树脂；
(2)取合成的炔基树脂，加入10μg叠氮肽段(m/z 860)，CuAAC催化共价结合到炔基树脂上；
(3)胰蛋白酶酶解，释放的目标肽段加上了aPra基团，MALDI检测，分子量增加112.12(m/z 972)。
图2为评价功能化树脂材料上炔基容量的MALDI谱图。不同体积(20、10、5、1μL)树脂和10μg炔基肽段偶联后，取上清用MALDI检测，评价树脂材料容量达到10μg肽段/10μL树脂材料。
图3为炔基九肽(864m/z)与叠氮十二肽(1196m/z)进行click反应，MALDI检测产物(2060m/z)。以叠氮肽的减少作为依据评价click连接效率。
图4为实施例1中考察CBOT富集叠氮肽段的富集回收率。富集前和富集后肽段的MALDI谱图，经过内标肽段的校正计算得到CBOT富集回收率是84％。
实施例2：将实施例1的基于生物正交反应结合胰酶酶解的可裂解标签用于293T细胞中新生蛋白的富集鉴定，建立的新生蛋白质的富集鉴定流程见图5，具体实验流程如下：
(1)AHA标记293T细胞，提取全样品：1mM AHA，培养4h，收集细胞裂解提取蛋白；
(2)按照实施例1中的步骤(1)制备炔基树脂10μL；
(3)按照实施例1中的步骤(2)，用AHA标记的500μg全蛋白的酶解肽段替代10μg叠氮肽段，完成CuAAC催化连接；
(4)强烈的洗脱条件，除去非特异性吸附的蛋白质。用200倍体积的洗脱试剂依次洗涤，分别为1％SDS、8M尿素、PBS和50％乙腈溶液。
(5)胰蛋白酶酶解，蛋白质和酶的比例为10：1，释放的新生蛋白的肽段经nanoLC-MS/MS分离鉴定。质谱搜库设置中增加可变修饰：AHA(Met)，在Met被AHA代替并加上富集标签后质量变化+107.07设为可变修饰用于蛋白质的鉴定和指认。
分析结果：500μg样品经过可逆富集流程，鉴定蛋白2213个，蛋白质的选择性95.3％。
图6为HEK293T细胞中新生蛋白样品的富集后鉴定结果的三次重复数据交盖图，显示富集流程稳定，可重复性好，两次重复鉴定的比例达到70％以上。
图7在蛋白质和肽段层面上评价CBOT方法的富集效率。富集前鉴定结果中标记肽段仅占1.6％，富集后的结果中AHA标记肽段有83.6％，鉴定灵敏度提高52倍。富集后鉴定到的新生蛋白质占总蛋白的95％以上。
实施例3：将实施例2的CBOT富集新生蛋白质的流程结合轻重同位素AHA/hAHA用于HEK293T细胞中新生蛋白质的定量研究。具体实验流程如下：
(1)用AHA和hAHA分别标记293T细胞，孵育4h，分别收集细胞裂解；
(2)分别提取并定量蛋白质，1：1等质量混合两个样品；
(3)按照蛋白质实施例2中的流程富集新生蛋白质；
(4)质谱搜库设置中增加可变修饰：AHA(Met)和hAHA(Met)，设置质量变化+107.07和+113.17设为可变修饰用于蛋白质的鉴定和指认。同时根据AHA肽段和对应hAHA肽段对蛋白质进行定量分析。
图8为实施例3中CBOT方法用于定量细胞中新生蛋白质的组学结果。经轻重同位素AHA/hAHA标记的HEK293T细胞，经CBOT富集可以定量2453个新生蛋白质，其中1722个蛋白质至少在两次技术重复中得到定量信息。
图9为实施例3分析CBOT定量新生蛋白质的定量结果相关性和数据分布直方图。结果两次技术重复的相关系数均超过0.5，从数据分布直方图中可以得出小于2倍CV的蛋白质超过80％。说明定量结果具有良好的重复性和准确性。
实施例4：将实施例3的CBOT富集定量流程进一步用于自噬过程中新生蛋白质的变化的研究。本部分内容设计用雷帕霉素激活自噬，实验设计如图10(a)，具体实验流程如下：
(1)用AHA和hAHA分别标记293T细胞24h；
(2)移去标记培养基，替换成完全培养基，同时AHA标记的样品用雷帕霉素刺激诱导自噬，hAHA标记的细胞用自噬抑制剂Baf和Wort抑制自噬作为对照样本，6后收集细胞；
(3)分别提取并定量蛋白质，1：1等质量混合两个样品；
(4)按照蛋白质实施例2中的流程富集新生蛋白质，并按照实施例3中的设置定量蛋白质；
(5)利用生物信息学技术分析分析差异表达的蛋白质。
通过CBOT富集技术结合定量技术，研究雷帕霉素激活过程中蛋白质的变化，图10(b)的结果显示三次技术重复中鉴定的全部蛋白质中95％以上是新生蛋白质，93.4％以上的蛋白质有定量信息。
图11为雷帕霉素激活自噬的生物通路。自噬通路灰色高亮的是CBOT富集后鉴定到的新生蛋白质。
图11是已知的自噬通路的蛋白质，其中CBOT富集并鉴定到20多个蛋白质，用灰色高亮的为标注。
图12为通过Western验证雷帕霉素诱导自噬后LC3和p62的表达量。LC3是自噬激活的标志分子，LC3-II的上调说明自噬通路被激活；p62被认为是自噬的底物蛋白，其降解可以说明自噬流的发生，用于监测不同细胞自噬降解的周期。
实施例4说明CBOT技术可以用于自噬过程中蛋白质动态变化的研究，可以提供短时间刺激窗口内新生蛋白质的变化，帮助阐明自噬降解的生物机制。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
