仿生边界润滑剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种防护关节软骨的仿生边界润滑剂及其制备方法。
发明背景
骨关节炎(Osetoarthritis,OA)是一种常见的关节表面润滑与减阻能力降低的疾病，发展至最后可能会进一步导致关节活动障碍，最终导致关节坏死，严重影响患者的生活质量。滑液中主要的润滑成分是润滑素。润滑素作为一种高分子量的糖蛋白，能降低边界模式的润滑中的摩擦系数[Swann et al.(1972)J.Biol.Chem.247:8069-73；Jay et al.(1998)J.Biomed.Mat.Res.40:414–8；Chawla et al.(2013)Acta Biomat.6:3388-94]。在骨关节炎进展期间，软骨中的主要大分子聚集蛋白聚糖可以保护细胞外基质的降解。润滑素与II型胶原和羟基磷灰石的相互作用有助于在关节表面保持润滑素的蛋白质分子薄膜。这种保护性润滑剂层在损伤和疾病之后经常被破坏，并且软骨本身不能快速恢复表面上的薄膜以延缓软骨退化。大量的实验表明，表面区域中延迟的润滑剂表达和分泌与愈合受损相关[Elsaid et al.(2012)Osteoarthritis Cartilage 20:940–948]。
目前关于与其他聚合物接枝的润滑性聚合物对于治疗骨关节炎治疗的报道，大部分集中于结构及其功能的模拟，即使注射以后有效果也不能长久地保留，其注射物在关节滑液中会随着时间而逐渐消失。例如，Samaroo将聚乙二醇(PEG)接枝到聚丙烯酸(pAA)核上以模拟润滑素的亲水性粘蛋白样结构域，润滑素模拟物的润滑和结合取决于共聚物的结构参数，其摩擦系数在0.140±0.024至0.248±0.030范围内，摩擦系数较高[KirkJ.Samaroo,et al.Binding and Lubrication of Biomimetic Boundary Lubricants onArticular Cartilage.JOURNAL OF ORTHOPAEDIC RESEARCH MARCH.2017DOI 10.1002/jor.23370]。中国专利申请CN 104870020 A公开了一种制备仿生润滑剂的方法，以聚丙烯酸PAA作为主链，聚乙二醇PEG作为接枝侧链，其中PEG侧链只是作为单纯的亲水性基团，赋予生物组织适当水平的润滑性，制得的仿生润滑剂的摩擦性能不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好生物相容性和生物摩擦性能的防护关节软骨的仿生边界润滑剂及其制备方法。
实现本发明目的的技术方案如下：
仿生边界润滑剂，以聚丙烯酸(pAA)为主链，N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-N,N-二甲基-N-丙烷磺酸内盐(DMMPPS)为两性离子聚电解质接枝侧链，4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)为接枝中间体，通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)和原子转移自由基聚合(ATRP)制备。
仿生边界润滑剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤1，避光、无水和无氧环境下，在丙烯酸中加入自由基引发剂4,4-偶氮二(氰基戊酸)(4,4′-azobis4-cyanopentanoicacid，A-CPA)和链转移剂为4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸(4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate，CPA-DB)，在50～60℃下搅拌反应，反应结束后，透析，冻干得到分子量级为60kDa～100kDa的聚丙烯酸(pAA)；
步骤2，按聚丙烯酸与DMMPPS的摩尔比为3:2～1:1，在聚丙烯酸的硼酸盐缓冲溶液中加入DMMPPS，混合均匀后，滴加DMTMM的硼酸盐缓冲溶液，调节pH至6～7，搅拌反应，反应结束后，透析，冻干得到仿生边界润滑剂。
优选地，步骤1中，所述的丙烯酸：链转移剂：自由基引发剂的摩尔比为762:1:0.25。
优选地，步骤1中，所述的反应时间48～72h。
优选地，步骤1和2中，所述的透析采用水透析，透析袋的分子量在5kDa以上，透析时间为3天以上。
优选地，步骤2中，所述的硼酸盐缓冲液的pH为8.5。
优选地，步骤2中，所述的反应时间为24～48h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)利用原子转移自由基聚合的方法，制备出了一种新型两性离子瓶刷聚合物，反应条件温和；
(2)采用具有良好的生物相容性的DMMPPS作为接枝侧链单体，两性离子聚合物刷段在水中电离出阴阳离子，与滑液中的水合阴阳离子牢固结合，在生物组织表面形成水合鞘和表面水合层，使其润滑边界层具有更高的摩擦承载能力，润滑性能优异，在软骨摩擦实验中摩擦系数保持在0.096±0.021，相较于PEG接枝到聚丙烯酸pAA上中0.140±0.024至0.248±0.030范围内的摩擦系数明显降低；
(3)后期应用中，可以通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联反应使PAA的羧酸基团与软骨表面氨基团结合以形成固定位点，从而锚定在关节软骨表面起边界润滑作用，减轻关节软骨的摩擦磨损，对关节软骨损伤及关节炎起到防护和治疗作用在骨关节炎、软骨损伤治疗与防护中的应用前景广阔。
附图说明
图1为两性离子在软骨表面形成水合层的示意图。
图2为本发明pAA主链上进行接枝的分子反应式。
图3为本发明的仿生润滑素示意图。
图4为本发明的仿生边界润滑剂的AFM图。
图5为两性离子单体接枝前后的红外图。
图6为不同接枝比例制得的仿生边界润滑剂的摩擦情况图。
图7为本发明的仿生边界润滑剂在软骨表面使用前后的水接触角。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
(1)将不透光烧瓶洗净干燥，通入N2，排出烧瓶内的氧气。
(2)将烧瓶置于磁力搅拌器上，随后加入AA(19ml)。
(3)待N2吹扫几分钟后，将作为链转移剂(CTA)的CPA-DB配制为溶液并加入到烧瓶中，具体配制如下：将CPA-DB(106mg，38×10-2mmol)溶于N2吹扫过的甲醇(58ml)中。
(4)N2吹扫几分钟后，将作为自由基引发剂(I)的A-CPA加入到步骤(3)配制好的溶液中，A-CPA配制如下：A-CPA(26mg，9.26×10-2mmol)溶于14ml甲醇中。
(5)待最后的氮气吹扫之后，将烧瓶密封并置于60℃的水浴中磁力搅拌以引发聚合。48小时后，将烧瓶打开，反应物暴露于空气中并在冰中冷却以停止反应。
(6)将溶液用0.01M硼酸盐缓冲液稀释并用去离子水透析3天，每天更换两次水，然后在冷冻干燥机中冻干得白色蜡状粉末即聚丙烯酸(pAA)。
(7)在烧瓶中加入120mL的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.5)，溶解并混合pAA和DMMPPS。
(8)将DMTMM(960mg)溶解在30mL的0.1mol/L硼酸盐缓冲液中，并滴加到烧瓶的混合物中。
(9)然后滴加1N的HCl，直至将混合液pH调节至6-7。
(10)搅拌使反应进行24小时，最后用去离子水透析3天并冷冻干燥后得到仿生边界润滑剂。
AFM表征制得的仿生边界润滑剂的结构，如图4所示，a图浓度为50μg/mL时，很少观察到分离的链。大多数链往往形成2至5个分子的小聚集体。在a图浓度为100μg/mL时，表面聚合物链明显增多。对两性离子单体接枝前后进行红外表征，结果如图5所示，(a)为接枝前PAA主链，(b)为接枝前DMMPPS单体，(c)为接枝反应后所生成产物的红外光谱。将pAA接枝DMMPPS单体的红外光谱图线、DMMPPS单体的红外光谱对比，可以明显地发现，接枝单体后的样品在1600cm-1处没有特征峰，而其他的单体特征峰仍然存在，只是特征峰的位置发生了少许变化，这表明接枝改性样品中不存在碳碳双键，单体DMMPPS已经发生聚合，接枝到大分子主链上。图7为软骨表面在使用边界润滑剂前后的亲水性接触角变化，可以看出使用仿生边界润滑剂后相较于之前表现出了更好的亲水性。
将边界润滑剂溶解于培养基中，使用时作为摩擦的润滑环境，在猪软骨切片表面上进行摩擦实验，其中固定载荷为50g，滑动速率为0.25m/s。软骨切片置于不同接枝比例(pAA：DMMPPS，(a)2:1(82mg:10mg)(b)3:2(61.5mg:10mg)(c)1:1(41mg:10mg)(d)1:2(20.5mg:10mg))制得的边界润滑剂环境中，其摩擦情况如图6所示，其摩擦系数所在范围分别为：(a)0.093±0.012，(b)0.098±0.021，(c)0.087±0.007，(d)0.102±0.016；图6c显示在该接枝比例下，其摩擦效果最佳。
