一种荧光共价有机骨架纳米药物载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于材料和生物医药技术领域，具体涉及一种荧光共价有机骨架纳米药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
化疗药物的副作用一直限制着抗癌药物的开发和使用。尽管许多抗癌药对癌细胞具有显着的抑制作用，但它们也会干扰正常细胞的运作并给患者带来过多的身体负担，使病人感到痛苦。葡萄糖氧化酶在癌症治疗方面的研究已经很好地解决了这个问题。由于其生物酶的特性和特异性，它对正常细胞几乎没有毒性和副作用，但是将其递送至癌细胞的过程极为困难。关于抗癌药物载体的研究提出了新的挑战。（参见 Y. Hu, H. Cheng, X.Zhao, ACS Nano, 11 (2017) 5558-5566；J. Zhou, M. Li, Y. Hou, PhotothermalTherapy, ACS Nano, 12 (2018) 2858-2872.）。
共价有机骨架材料的出现为解决此类问题提出了新的思路（参见H. Wang, Z.Zeng, P. Xu, Chem. Soc. Rev., 48 (2019) 488-516； H. Wang, Z. Zeng, P. Xu,Chem. Soc. Rev., 48 (2019) 488-516.），该材料不仅具有大的共轭结构，较强的共价键，还可以根据需求选择不同的单体进行设计合成；同时载体所负载的葡萄糖氧化酶的生物酶药物的特性，使其与其他的药物载体相比，所涉及的材料具有以下的几种优势：
但是由于葡萄糖氧化酶很难递送至癌细胞，且考虑到共价有机骨架材料具有一定的孔隙率与共轭性，目前尚无使用共价有机骨架材料负载生物酶的公开报道以及技术研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种共价有机骨架纳米药物载体，该载体提供的葡萄糖氧化酶的控释方式和途径，可显著提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作用，提高药物的治疗效果。
本发明还提供该纳米药物载体与葡萄糖氧化酶药物负载的制备方法。
本发明也提供了该纳米药物载体在制备抗癌药物中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种共价有机骨架纳米药物载体，将N，N，N'，N'-四（4-甲酰基苯基）-1,1'-联苯-4,4'-二胺单体与3,3',5,5'-四甲基联苯胺单体反应得到共价有机骨架材料，然后通过室温反应负载药物葡萄糖氧化酶。
上述纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）特定共价有机骨架单体材料的制备：将N，N，N’，N’-四苯基联苯胺和咪唑加入到圆底烧瓶中，然后加入乙腈，在氮气氛中滴加三氟乙酸酐，将混合物回流直到N，N，N’，N’-四苯基联苯胺完全耗尽，将反应溶液倒入水中以溶解出黄色粉末沉淀，用水洗涤滤饼直至滤液变为无色，得到产物单体前体A，将前体A溶解在四氢呋喃中，然后泵送HCl气体，将反应溶液回流10-20小时，将反应溶液冷却至室温，并形成橙色固体；将反应混合物过滤并从乙醚中重结晶，得到化合物单体B；
（2）特定共价有机骨架材料的制备：将上述化合物单体B与3,3',5,5'-四甲基联苯胺加入圆底烧瓶中，加入四氢呋喃，并添加0.1-10 mL甲酸作为催化剂，在油浴锅下进行回流反应并待溶液冷却至室温，形成黄橙色混合物体，将混合物抽滤，并在25℃下干燥得到共价有机骨架材料固体C；
（3）葡萄糖氧化酶药物的负载：将固体C溶解在磷酸盐缓冲盐水中，然后顺序添加葡萄糖氧化酶溶液，在室温下于黑暗中搅拌， 将得到的混合物高速离心，分离上清液，将下部固体用PBS溶液洗涤，然后冷冻干燥，获得黄棕色固体粉末。
优选地，上述制备方法中，步骤（1）中，N，N，N’，N’-四苯基联苯胺与咪唑的质量比为1-3.5：0.9-3.1，N，N，N’，N’-四苯基联苯胺2.0-7.0 g加入到90 mL乙腈中，乙腈、三氟乙酸酐的体积比为0.9：0.15-0.25；
步骤（1）中前体A 8-15g溶解在200 mL 四氢呋喃中，盐酸、四氢呋喃的体积比为2:1，HCl气体的浓度为2.5 mol L-1。
优选地，上述制备方法中，，步骤（2）中化合物单体B与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的质量比：1 ：0.75~1.75。
优选地，上述制备方法中，所述步骤（2）中油浴锅中的回流反应的温度为65~75℃，时间为4h~72h。
优选地，上述制备方法中，所述步骤（3）中固体C与葡萄糖氧化酶的质量比为:10:0.5~3，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为0.1~0.5 mg / mL，葡萄糖氧化酶的分子量为100000~200000。
优选地，上述制备方法中，所述步骤（3）中离心的转速为5000~8000 r/min，时间为5~20 min。
本发明制成的载体中，固体C共价有机骨架材料为100-500 nm的单层或者多层的层状结构或者球状。
上述方法制备的纳米药物载体在制备抗癌药物中的应用。
有益效果
（1）以轻质元素合成的共价有机骨架材料作为载体，避免了以往在载体中引入过量重金属导致的过多身体负担，同时较为简单的合成过程避免了复杂的合成工序，有望实现较大的规模生产。
（2）利用生物酶材料作为药物，避免了由于药物而引起的身体机能损伤，可以实现对癌细胞的针对性损伤。极大的降低了药物的毒副作用。
（3）载体材料具有较明显的荧光性，在负载酶药物后，会产生一定的荧光强度下降，并且在紫外灯下照射，可以明显观察到这一现象，可以实现可视化的药物负载。
（4）可以实现药物的无损装载和可控释放。抗癌药物通过强物理吸附作用吸附到载体上，避免了共价键对药物分子的损伤，而且这种吸附方式负载的药物可以缓慢释放，有利于长时间保持药效。
附图说明
图1为共价有机骨架材料（COF）在不同溶剂下的荧光光谱图；
图2为COF载体材料与两种合成单体TPB与TMB的红外谱图；
图3为共价有机骨架材料在热场扫描电镜（SEM）与透射电镜（TEM）下的图片；
图4为共价有机骨架材料（COF）与负载前后的葡萄糖氧化酶药物（GOX）的红外谱图；
图5为COF材料在不同溶剂下的分散图片；
图6为不同浓度GOX、COF、GOX+COF的HeLa细胞的存活率。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
1、特定共价有机骨架单体材料的制备
（1）将N，N，N’，N’-四苯基联苯胺（5 g）和咪唑（5 g）加入到250 mL的两口圆底烧瓶中，然后加入90 mL乙腈。在氮气氛（N2）中滴加三氟乙酸酐（17.5 mL）。将混合物回流直到N，N，N’，N’-四苯基联苯胺完全耗尽（通过薄层色谱法监测）。将反应溶液倒入1L水中以溶解出黄色粉末沉淀。用水洗涤滤饼直至滤液变为无色，得到产物单体前体A。将前体A（10 g）溶解在200 mL 四氢呋喃（THF）中。然后泵送HCl气体（100 mL，通过将21.0 mL浓HCl加入79.0 mLH2O中而制备的2.5 mol L-1）。将反应溶液回流12小时。将反应溶液冷却至室温，并形成橙色固体。将反应混合物过滤并从乙醚中重结晶，得到化合物单体B（TPB）。
（2）将N，N，N’，N’-四苯基联苯胺（5 g）和咪唑（5 g）加入到250 mL的两口圆底烧瓶中，然后加入90 mL乙腈。在氮气氛（N 2）中滴加三氟乙酸酐（17.5 mL）。将混合物回流直到N，N，N’，N’-四苯基联苯胺完全耗尽（通过薄层色谱法监测）。将反应溶液倒入1L水中以溶解出黄色粉末沉淀。用水洗涤滤饼直至滤液变为无色，得到产物单体前体A。将前体A（15 g）溶解在200 mL 四氢呋喃（THF）中。然后泵送HCl气体（100 mL，通过将21.0 mL浓HCl加入79.0mL H2O中而制备的2.5 mol L-1）。将反应溶液回流12小时。将反应溶液冷却至室温，并形成橙色固体。将反应混合物过滤并从乙醚中重结晶，得到化合物单体B（TPB）。
（3）将N，N，N’，N’-四苯基联苯胺（5 g）和咪唑（5 g）加入到250 mL的两口圆底烧瓶中，然后加入90 mL乙腈。在氮气氛（N 2）中滴加三氟乙酸酐（17.5 mL）。将混合物回流直到N，N，N’，N’-四苯基联苯胺完全耗尽（通过薄层色谱法监测）。将反应溶液倒入1L水中以溶解出黄色粉末沉淀。用水洗涤滤饼直至滤液变为无色，得到产物单体前体A。将前体A（10 g）溶解在200 mL 四氢呋喃（THF）中。然后泵送HCl气体（100 mL，通过将21.0 mL浓HCl加入79.0mL H2O中而制备的2.5 mol L-1）。将反应溶液回流16小时。将反应溶液冷却至室温，并形成橙色固体。将反应混合物过滤并从乙醚中重结晶，得到化合物单体B（TPB）。
（4）将N，N，N’，N’-四苯基联苯胺（5 g）和咪唑（5 g）加入到250 mL的两口圆底烧瓶中，然后加入90 mL乙腈。在氮气氛（N2）中滴加三氟乙酸酐（17.5 mL）。将混合物回流直到N，N，N’，N’-四苯基联苯胺完全耗尽（通过薄层色谱法监测）。将反应溶液倒入1L水中以溶解出黄色粉末沉淀。用水洗涤滤饼直至滤液变为无色，得到产物单体前体A。将前体A（15 g）溶解在200 mL 四氢呋喃（THF）中。然后泵送HCl气体（100 mL，通过将21.0 mL浓HCl加入79.0 mLH2O中而制备的2.5 mol L-1）。将反应溶液回流16小时。将反应溶液冷却至室温，并形成橙色固体。将反应混合物过滤并从乙醚中重结晶，得到化合物单体B（TPB）。
2、共价有机骨架材料的制备
（1）将上述化合物单体B（TPB）（600 mg）与3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（440 mg）加入到250 mL的圆底烧瓶中，加入120 mL的四氢呋喃（THF），并添加几滴甲酸作为催化剂，在油浴锅下进行70℃回流反应3天并待溶液冷却至室温，形成黄橙色固体约400 nm左右。如图3热场扫描电镜与透射电镜所示显示出明显的400 nm的球状纳米载体。将混合物抽滤，并在25℃下干燥得到共价有机骨架材料固体C。如图1所示，ab、cd分别为COF材料溶于DMSO、乙酸乙酯下的荧光谱图。如图2红外谱图所示，COF成功被合成了出来，并与两种单体作为对比。同时将COF分散到不同溶剂中观察COF的分散性，如图5所示，COF在不同的溶剂中都显示出良好的分散性。
（2）将上述化合物单体B（TPB）（600 mg）与3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（440mg）加入到250 mL的圆底烧瓶中，加入120 mL的四氢呋喃（THF），并添加几滴甲酸作为催化剂，在油浴锅下进行70℃回流反应1天并待溶液冷却至室温，形成黄橙色固体约200 nm左右。将混合物抽滤，并在25℃下干燥得到共价有机骨架材料固体C。
（3）将上述化合物单体B（TPB）（600 mg）与3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（440mg）加入到250 mL的圆底烧瓶中，加入120 mL的四氢呋喃（THF），并添加几滴甲酸作为催化剂，在油浴锅下进行75℃回流反应3天并待溶液冷却至室温，形成黄橙色固体约500 nm左右。将混合物抽滤，并在25℃下干燥得到共价有机骨架材料固体C。
（4）将上述化合物单体B（TPB）（600 mg）与3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）（440mg）加入到250 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL的四氢呋喃（THF），并添加几滴甲酸作为催化剂，在油浴锅下进行65℃回流反应3天并待溶液冷却至室温，形成黄橙色固体约500 nm左右。将混合物抽滤，并在25℃下干燥得到共价有机骨架材料固体C。
共价有机骨架材料为100-500 nm的单层或者多层的层状结构或者球状。
3、葡萄糖氧化酶药物的负载
（1）将5 mg 固体C溶解在5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后顺序添加1 mL 葡萄糖氧化酶溶液（0.5 mg / mL），葡萄糖氧化酶的分子量为150000，在室温下于黑暗中搅拌24 h。将得到的混合物高速离心，分离上清液，将下部固体用PBS溶液洗涤，然后冷冻干燥，获得黄棕色固体粉末。如图3红外谱图所示，GOX被成功负载到了COF载体上。
（2）将5 mg 固体C溶解在5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后顺序添加1 mL 葡萄糖氧化酶溶液（0.1 mg / mL），葡萄糖氧化酶的分子量为180000，在室温下于黑暗中搅拌24h。将得到的混合物高速离心，分离上清液，将下部固体用PBS溶液洗涤，然后冷冻干燥，获得黄棕色固体粉末。
（3）将5 mg 固体C溶解在5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后顺序添加1 mL 葡萄糖氧化酶溶液（0.3 mg / mL），葡萄糖氧化酶的分子量为150000，在室温下于黑暗中搅拌24h。将得到的混合物高速离心，分离上清液，将下部固体用PBS溶液洗涤，然后冷冻干燥，获得黄棕色固体粉末。
（4）将10 mg 固体C溶解在5 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后顺序添加1 mL 葡萄糖氧化酶溶液（0.3 mg / mL），葡萄糖氧化酶的分子量为180000，在室温下于黑暗中搅拌24h。将得到的混合物高速离心，分离上清液，将下部固体用PBS溶液洗涤，然后冷冻干燥，获得黄棕色固体粉末。
4、毒理实验：COF细胞毒性以及COF+GOX及抗癌活性
将实施例2中得到的载体与不同比例的GOX混合，完成药物负载得到COF+GOX，然后用超滤去掉未结合的GOX，沉淀用PBS重新溶解均匀，放于4℃冰箱中保存备用。
将HeLa细胞分别接种于96孔板中，24小时后将GOX与COF+GOX分别加入并形成浓度梯度，加入培养基后进行培养。相同条件下，分别以纯COF、纯GOX和负载相同浓度GOX的COF+GOX，做平行对照，24小时后进行细胞存活率检测。
结果如图6所示，可以看出，GOX与COF载体不同的浓度时HeLa细胞的存活率。同时实验表明，即使在高的浓度下，COF对细胞基本上也没有显著毒性。在相同浓度下的GOX，被COF载体所负载的药物显示出更优异的治疗效果，并有很好的缓释效果。
