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类芽孢杆菌ZX1905及其生产的胞外多糖Lubcan和应用

2021-03-13 02:59:15

类芽孢杆菌ZX1905及其生产的胞外多糖Lubcan和应用

　　技术领域

　　本发明属于微生物及微生物胞外多糖技术领域，涉及一种类芽孢杆菌Paenibacillus sp.ZX1905，及其生产的胞外多糖Lubcan，以及其在制备化妆品中的应用。

　　背景技术

　　微生物多糖具有复杂的化学结构和生物学功能，例如抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血糖和保湿吸湿等功能，在制药、食品和化妆品等行业有着广泛的应用。现已有多种菌株被用于生产多糖，如生产黄原胶的Xanthomonas campestris NRRL B-1459，生产结冷胶的Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461，生产琥珀酰聚糖的Sinorhizobium melilotiRm41或者Agrobacterium sp.ZCC3656，生产索拉胶的Agrobacterium sp.ZX09，以及生产透明质酸的Streptococcus sp.ID9102。

　　透明质酸由于其独特的保湿能力，被广泛应用在化妆品领域。透明质酸可以从动物组织中提取，或者通过链球菌发酵产生。从动物组织中提取高纯度和高分子量透明质酸的分离成本非常高，而且由于跨物种病毒的风险和其他不确定因素，限制了动物源性生化试剂的进一步应用。由链球菌菌株生产透明质酸的主要问题是成本高和产量有限，例如Streptococcus sp.ID9102在含有40g/L葡萄糖，7.5g/L酵母提取物和10g/L的酪蛋白胨的培养基中生产的透明质酸产量为6.94g/L(J.Im,J.Song,J.Kang,D.Kang,Optimization ofmedium components for high-molecular-weight hyaluronic acid production byStreptococcus sp.ID9102 via a statistical approach,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.36(11)(2009)1337-1344.)。为了解决这一难题，很多学者在筛选能够生产具有保湿能力多糖的微生物。Pseudomonas fluorescens PGM37生产的多糖的保湿能力优于甘油，但次于透明质酸(L.Zhao,F.Fan,P.Wang,X.Jiang,Culturemedium optimization of a new bacterial extracellular polysaccharide withexcellent moisture retention activity,Appl.Microbiol.Biotechnol.97(7)(2013)2841-2850.)；Zunongwangia profunda SM-A87生产的多糖的吸湿和保湿能力都低于透明质酸(M.L.Sun,S.B.Liu,L.P.Qiao,et al.,A novel exopolysaccharide from deep-seabacterium Zunongwangia profunda SM-A87:low-cost fermentation,moistureretention,and antioxidant activities,Appl.Microbiol.Biotechnol 98(17)(2014)7437-45.)。因此，寻找具有与透明质酸保湿性能相当的经济、高产的天然多糖具有重要意义。

　　发明内容

　　本发明的目的之一在于提供一种生产具有和透明质酸相当的保湿和吸湿能力的胞外多糖Lubcan的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.ZX1905)。

　　发明人从河南农田的土壤中分离得到一株菌株，经分子生物学鉴定为类芽孢杆菌属菌株(Paenibacillus sp.)，命名为Paenibacillus sp.ZX1905。该菌株已于2020年7月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020320。

　　本发明的目的之二在于提供上述类芽孢杆菌ZX1905生产的胞外多糖Lubcan。

　　本发明所述的胞外多糖Lubcan，其结构如下：

　　由葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖以摩尔比2:3:1:2:2组成。

　　本发明的目的之三在于提供上述胞外多糖Lubcan的生产方法，包括以下步骤：

　　步骤1，将类芽孢杆菌ZX1905种子液接种到发酵培养基中，发酵得到发酵液；

　　步骤2，发酵液加水稀释后加入0.1％NaOH混匀，沸水浴煮，离心收集上清液；

　　步骤3，上清液中加入乙酸钠和乙醇，离心收集沉淀，然后用乙醇清洗沉淀，得到Lubcan多糖纯品。

　　本发明中，所述的发酵培养基为：KH2PO4 0.6g/L，Na2HPO4 1.2g/L，CaCl2 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.3g/L，FeSO4 0.0125g/L，MnSO4 0.003g/L，ZnCl2 0.01g/L，蛋白胨4g/L，可溶性淀粉20～30g/L溶于水中，pH为8.0。

　　本发明中，所述的类芽孢杆菌ZX1905的发酵条件为：发酵温度28℃，转速230rpm，发酵时间28～32h。

　　在本发明的具体实施方式中，步骤2中，采用等体积的水稀释发酵液。

　　在本发明的具体实施方式中，步骤2中，沸水浴煮的时间为10min。

　　在本发明的具体实施方式中，步骤2中，离心速度为8000rpm，离心时间为10min。

　　在本发明的具体实施方式中，步骤3中，乙酸钠的加入量为1g/L，乙醇的加入量为上清液的2倍体积。

　　本发明的目的之四在于提供上述胞外多糖Lubcan在制备保湿产品中的应用。

　　本发明所述的保湿产品为透明质酸适用的具有保湿功能的产品，包括但不限于生物医药材料或化妆品等。

　　本发明的类芽孢杆菌ZX1905为能够分泌与透明质酸的保湿吸湿性能相当的胞外多糖Lubcan的菌株。类芽孢杆菌ZX1905的生长过程不分泌色素，菌种培养操作简单，与生产透明质酸相比，其培养基成份明确，成本低，适宜于工业化生产。类芽孢杆菌ZX1905生产的胞外多糖Lubcan为酸性多糖，与透明质酸的纯化过程相比，其提取纯化方法简单，生产成本低。本发明的胞外多糖Lubcan具有和透明质酸相当的保湿和吸湿能力，能够替代透明质酸，作为保湿成分应用于生物医药材料或化妆品领域中。

　　附图说明

　　图1是类芽孢杆菌ZX1905菌株的平板菌落。

　　图2是Lubcan组分测定的液相色谱图。其中A为标准单糖图谱；B为Lubcan的单糖组成分析图谱。图中标记：Man-甘露糖，Rha-鼠李糖，GlcA-葡萄糖醛酸，Glc-葡萄糖，Gal-半乳糖。

　　图3是Lubcan的一维核磁共振谱。A为1H NMR；B为13C NMR。

　　图4是Lubcan的二维核磁共振谱。A为COSY；B为HSQC；C为HMBC；D为TOCSY；E为NOESY。

　　图5是Lubcan的结构图。

　　图6是Lubcan和透明质酸及甘油的保湿吸湿性能对比图。A为样品在相对湿度43％下的吸湿性；B为样品在相对湿度81％下的吸湿性；C为样品在相对湿度43％下的保湿性。

　　本发明的类芽孢杆菌ZX1905(Paenibacillus sp.ZX1905)，已于2020年7月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2020320，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学。

　　具体实施方式

　　下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

　　实施例1

　　1.类芽孢杆菌Paenibacillus sp.ZX1905的筛选分离：

　　取河南农田的土壤，将1g土壤样品加入到配置好的液体培养基中，在温度28℃，转速230rpm下培养2天，然后取1ml菌液稀释涂布于固体培养基中，28℃下培养2～3天，待菌落长出后，根据菌落形态特征，挑取表面有粘性多糖产生的单菌落在新的固体培养基上稀释涂布，28℃下培养，待菌落长出后在挑取单菌落进行稀释涂布，重复此过程直至固体培养基上长出的菌落形态单一。

　　筛选培养基为：KH2PO4 1g/L，CaCl2 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.3g/L，FeSO4 0.0125g/L，KNO3 2g/L，sucrose 20g/L，pH 7.2，固体培养基需在加入琼脂15g/L。培养基121℃灭菌20min。

　　2.菌株的鉴定

　　对菌株进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。

　　(1)形态特征：在固体平板培养基上28℃培养2～3天后观察，菌落呈圆形，表面光滑，菌株分泌大量的胞外多糖，无色素产生。图1为平板培养基上的菌落。

　　(2)类芽孢杆菌的16S rDNA序列见序列表(SEQ ID NO.1)，经Blast比对，与Paenibacillus phyllosphaerae strain SM26的序列相似度高达97.97％，与Paenibacillus xanthanilyticus strain AS7相似度为97.89％，与Paenibacillusaurantiacus strain RC11相似度为97.82％，为类芽孢杆菌属，命名为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.ZX1905。

　　实施例2

　　类芽孢杆菌ZX1905生产的胞外多糖Lubcan的生产及纯化方法，具体步骤如下：

　　(1)配置培养基：将KH2PO4 0.6g/L，Na2HPO4 1.2g/L，CaCl2 0.1g/L，MgCl2·6H2O0.3g/L，FeSO4 0.0125g/L，MnSO4 0.003g/L，ZnCl2 0.01g/L，蛋白胨4g/L，可溶性淀粉20～30g/L溶于水中，pH为8.0；培养基121℃灭菌20min；

　　(2)向步骤(1)中灭菌后的培养基内加入平皿单菌落，在温度28℃，转速230rpm下培养12-18h，获得种子培养液；

　　(3)向步骤(1)中的灭菌后的培养基内加入步骤(2)中获得的种子培养液，在温度28℃，转速230rpm下发酵28～32h，获得发酵液；

　　(4)向步骤(3)得到的发酵液内加入等体积的水稀释发酵液，加入0.1％NaOH混匀，然后沸水浴煮10min，8000rpm离心10min后收集上清液；

　　(5)向步骤(4)得到的上清液内加入1g/L的乙酸钠和2倍体积的乙醇，沉淀用少量的乙醇清洗，得到Lubcan多糖纯品。

　　实施例3

　　类芽孢杆菌ZX1905生产的胞外多糖Lubcan，其结构解析如下：

　　(1)采用凝胶渗透色谱法测定Lubcan的分子量为3270KDa。

　　(2)将Lubcan用三氟乙酸完全酸水解、PMP衍生化、氯仿萃取及取水相过滤后进行高效液相分析。图2为单糖组分测定的液相色谱图。其中A图为标准单糖的出峰情况，B图为Lubcan完全酸水解后的出峰情况，同一组分在相同的位置出峰。由图可知，Lubcan是一种酸性杂多糖，由葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖以摩尔比2:3:1:2:2组成。

　　(3)将Lubcan多糖和还原糖醛酸后的reduced-lubcan多糖进行甲基化分析，结果见表1。

　　表1 Lubcan的甲基化分析

　　a部分甲基化糖醇乙酸酯。

　　b结果以相对于1,4-linked-Manp残基的摩尔比表示。

　　c通过对lubcan和reduced-lubcan的比较分析确定。

　　由表1可知Lubcan由1,3-linked Rhap，1,3-linked Glcp，1,4-linked Manp，1,4-linked GlcAp，1,3-linked Galp和1,4,6-linked Glcp组成，且各糖苷的摩尔比与单糖分析结果一致。

　　(4)将Lubcan用三氟乙酸部分酸水解，用D2O配置成80mg/ml，使用TMSP作为内标进行NMR分析。多糖的一维核磁谱见图3。其中，A图为1H NMR；B图为13C NMR。多糖的二维核磁谱见图4。其中，A图为COSY；B图为HSQC；C图为HMBC；D图为TOCSY；E图为NOESY。

　　1H NMR中，化学位移在δ5-6ppm的是alpha异头质子，化学位移在δ4-5ppm的是beta异头质子，化学位移δ1.27和1.28ppm归位于鼠李糖的–CH3，δ1.45ppm归位于丙酮酸的–CH3。13CNMR中，δ96-106ppm之间有10个信号，表明Lubcan有10个异头碳，在HSQC谱上也可以观察到10个异头信号交叉峰。13C NMR中化学位移δ19.44ppm归位于鼠李糖的–CH3，δ28ppm归位于丙酮酸的–CH3，δ178.29和178.90ppm分别归位于葡萄糖醛酸和丙酮酸的–COOH。COSY和TOCSY用来准确分配每个糖苷的质子化学位移，13C和HSQC用来分配碳的化学位移，HMBC和NOESY用来确定糖残基的连接顺序。根据Lubcan的一维和二维NMR及前人研究成果，将Lubcan的1HNMR和13C NMR的化学位移归纳总结在表2中。表2中加粗的化学位移为糖残基取代位点。

　　表2 Lubcan的1H NMR和13C NMR化学位移(ppm)

　　(5)结合以上分析，可确定类芽孢杆菌ZX1905生产的胞外多糖Lubcan的结构见图5。

　　实施例4

　　胞外多糖Lubcan、透明质酸和甘油的保湿吸湿性能测试实验，具体如下：

　　在吸湿性测试之前，将多糖样品粉碎成细粉。将样品冷冻干燥24h。将干燥后的样品(0.1g)放入密闭的保湿容器中，并保持温度在25℃。饱和K2CO3维持43％相对湿度(RH43％)，饱和(NH4)2SO4维持81％相对湿度(RH81％)。通过1、2、4、6、8、10、12和24h后样品的重量增加来评估吸湿能力。通过下式计算样品的吸湿率(Ra)：

　　W0和Wt是将样品放入密闭容器之前和之后的重量。

　　在样品的保湿性检测中，首先将冷冻干燥24h后的样品(0.1g)放入盛有一定体积蒸馏水的密闭容器中，在25℃下保持24h，然后将样品转移到饱和K2CO3(RH43％)的密闭容器内，通过1、2、4、6、8、10、12和24h后的重量损失来评估样品的水分保持能力。通过下式计算样品的保湿率(Rh)：

　　W0和Wt是放入RH43％的密闭容器之前和之后样品中水的重量。

　　图6是Lubcan和透明质酸及甘油的保湿吸湿性能对比图。A图为样品在RH43％下的吸湿性，在整个检测时间内，Lubcan和透明质酸的Ra都高于甘油，在24h时，Lubcan的Ra(16.98％)与透明质酸的Ra(17.28％)几乎相同，且高于甘油(11.26％)。B图为样品在RH81％下的吸湿性，Lubcan在24h时的Ra值为40.41％，透明质酸为41.20％，甘油为70.48％。C图为样品在RH43％下的保湿性，Lubcan和透明质酸的Rh在前8h内显示出持续下降，然后达到稳定值，而甘油的Rh在整个测试时间内持续下降。脱水24h后，Lubcan、透明质酸和甘油的Rh值分别为29.34％、25.16％和17.21％。综上所述，Lubcan具有与透明质酸相当的水分吸收和保持能力。

　　序列表

　　<110> 南京理工大学

　　<120> 类芽孢杆菌ZX1905及其生产的胞外多糖Lubcan和应用

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1377

　　<212> DNA

　　<213> 类芽孢杆菌(Paenibacillus )

　　<400> 1

　　gttagcggcg gacgggtgag taacacgtag gtaacctgcc tgtaagaccg ggataacatt 60

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