一种纤维软骨糖胺多糖及其提取方法
技术领域
本发明属于糖胺多糖提取技术领域，具体涉及一种纤维软骨糖胺多糖及其提取方法。
背景技术
酸性黏多糖又称糖胺多糖(GAG，glycosaminoglycan)，是一种长链复合糖分子，由己糖醛酸和氨基己糖或中性糖组成的二糖单位彼此相连而成，可与蛋白质相连形成蛋白多糖(proteoglycan)。糖胺多糖具有维持人皮肤及结缔组织的弹性、维系软骨细胞外基质稳定等重要作用。以往科学研究中对于纤维软骨中糖胺多糖的提取多采用盐酸胍等化学试剂提取，进一步再利用透析的方法去除残留的化学试剂。但该方法流程繁琐、操作复杂，且需要添加盐酸胍等化学试剂，引入了有害物质，也使得造价较高。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种纤维软骨糖胺多糖及其提取方法，通过简单易行的方法从纤维软骨中提取糖胺多糖，成本低廉，且不采用化学试剂，有效解决了现有技术中需要添加化学试剂和造价较高等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种纤维软骨糖胺多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜的动物纤维软骨去除周围脂肪肌肉组织，清洗，在-20～37℃温度区间进行4～6个冻融循环，然后将纤维软骨剪成3～5mm的组织块；
(2)将步骤(1)所得组织块浸泡在超纯水中，在3～5℃温度下搅拌36～60h，离心并收集上清液，然后冷冻干燥，得纤维软骨糖胺多糖。
进一步，步骤(1)中，取新鲜牛或羊的纤维软骨去除周围脂肪肌肉组织，并用脱酶水清洗。
进一步，步骤(1)中，纤维软骨为纤维环、半月板或椎间盘。
进一步，步骤(1)中，每次冻融周期为24h，分别为-20℃持续12h，37℃持续12h。
进一步，步骤(2)中，将组织块浸泡在超纯水中，在4℃温度下搅拌48h。
进一步，步骤(2)中，在-75～-65℃温度下冷冻干燥。
进一步，步骤(2)中，在-70℃温度下冷冻干燥。
上述的提取方法制得的纤维软骨糖胺多糖。
综上所述，本发明具备以下优点：
1、本发明通过简单易行的方法从纤维软骨中提取糖胺多糖，成本低廉，且不采用化学试剂，避免引入有害物质，非常有利于后续的生物学应用，有效解决了现有技术中需要添加化学试剂和造价较高等问题。
2、先取新鲜的牛、羊的纤维软骨去除脂肪肌肉组织，并用脱酶水清洗去除残留血迹，以便进行冻融循环处理；冻融循环能够使得组织松散，在剪成组织块时也更加方便；然后在超纯水中浸泡并持续搅拌，将组织中的糖胺聚糖溶于水，便于后续的收集；再离心收集上清液，冷冻干燥即得纤维软骨糖胺多糖。本发明的提取方法简单易操作，能够快速提取动物中的纤维软骨糖胺多糖，且安全高效，其提取效果并不弱于化学试剂提取法，成本更低，便于提取方法的推广使用。
附图说明
图1为糖胺多糖干重含量检测示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种纤维软骨糖胺多糖，其提取方法包括以下步骤：
(1)取新鲜的牛尾椎纤维环去除周围脂肪肌肉组织，清洗，在-20～37℃温度区间进行5个冻融循环(每次冻融周期为24h，分别为-20℃持续12h，37℃持续12h)，然后将纤维软骨剪成3～5mm的组织块；
(2)将步骤(1)所得组织块浸泡在超纯水中，在3℃温度下搅拌36h，离心并收集上清液，然后冷冻干燥(-70℃)，得纤维软骨糖胺多糖。
实施例2
一种纤维软骨糖胺多糖，其提取方法包括以下步骤：
(1)取新鲜的牛尾椎髓核去除周围脂肪肌肉组织，清洗，在-20～37℃温度区间进行5个冻融循环(每次冻融周期为24h，分别为-20℃持续12h，37℃持续12h)，然后将纤维软骨剪成3～5mm的组织块；
(2)将步骤(1)所得组织块浸泡在超纯水中，在4℃温度下搅拌48h，离心并收集上清液，然后冷冻干燥(-70℃)，得纤维软骨糖胺多糖。
对比例
将现有的盐酸胍化学试剂提取法(Guanidine extraction after dialysis)对新鲜的牛尾髓核进行提取，并用透析法去除残留化学试剂，具体提取步骤见下；采用三种不同空隙的透析膜(12-14K MwCO、50K MwCO和100K MwCO)对盐酸胍化学试剂提取法和实施例2提取结果通过二甲基亚甲基蓝(DMMB)比色法进行糖胺聚糖干重含量测定全面检测，其结果见图1。
盐酸胍化学试剂提取方法：
1、盐酸胍化学试剂提取液组成：盐酸胍浓度为4M，乙酸钠浓度为50mM，Tris-EDTA浓度为100mM，溶液PH＝5.8。
2、提取过程：
(1)取3g牛尾椎髓核，剪成3-5mm，加入45ml盐酸胍化学试剂提取液(W：V＝1：15)和100ul蛋白酶抑制剂。在4℃条件下摇床48h。
(2)离心(16000G，30min)，将上清液转移至新的离心管并在-80℃保存。
3、透析去除化学试剂
(1)样本：上一步提取的上清液；
(2)准备透析膜和透析膜夹；
(3)将样本放入透析膜中；
(4)将装有样本的透析膜置于透析液(50mM三水乙酸钠，MW136.08g/mol，pH＝6.3)中，在4℃下摇床过夜48h；
(5)每两小时更换透析液，将透析完成后的样本在-70摄氏度下冷冻干燥。
由图1可知，不论采用何种孔径透析膜进行透析，本发明都能获得与盐酸胍化学试剂提取法一致的提取效果，本发明所得糖胺多糖(GAG，glycosaminoglycan)干重含量均超过400ug/mg，不低于盐酸胍化学试剂提取法。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
