一种山黧豆生物组分的多级分离方法
技术领域
本发明涉及豆科植物加工利用技术领域，具体涉及一种山黧豆生物组分的多级分离方法。
背景技术
山黧豆为豆科山黧豆属植物，分布于朝鲜、日本和俄罗斯远东地区，在中国普遍分布于东北、华北、陕西、甘肃南部、青海东部。山黧豆多生于山坡、林缘、路旁、草甸等处，最高可到海拔2500米的地方生存，粗生，喜温暖湿润环境。山黧豆种子中蛋白质含量约为25％～28％，淀粉含量约为55％～61％，是比较理想的高蛋白豆科饲料作物，也是良好的植物淀粉资源。但由于山黧豆中含有山黧豆毒素(ODAP)，其神经毒素含量未达到安全食用水平，这使得山黧豆未得到广泛应用，然而这无疑会造成山黧豆资源的巨大浪费，因此，如何将山黧豆中的生物组分进行有效分离成为一大研究热点。
现有山黧豆中生物组分(如淀粉、蛋白质等)的分离多采用水提法进行，然后根据生物组分在水中的比重不同，进而通过离心、过滤等手段实现山黧豆中生物组分的分离，然而现有分离方法分离效率较低，淀粉、蛋白质等组分的提取率不高，造成部分山黧豆资源的浪费。
发明内容
本发明的目的在于克服现有山黧豆的分离方法淀粉、蛋白质等组分的提取率不高，无法高效分离山黧豆中生物组分的缺陷，进而提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将山黧豆粉碎，加水浸提，得到浸提液；
2)将浸提液过滤，得到纤维素和滤液；
3)将滤液进行凝胶层析，得到第一洗脱液；
4)将第一洗脱液浓缩后再进行凝胶层析，得到第二洗脱液；
5)将第二洗脱液浓缩，浓缩后加水，搅拌，离心分离，得到蛋白质溶液和淀粉沉淀；
6)向所述蛋白质溶液中加入硫酸铵水溶液，过滤，得滤渣，滤渣干燥，得到蛋白质。
优选的，步骤3)中所述凝胶层析处理步骤中所用洗脱液为正丁醇和醋酸水溶液的混合液；
步骤4)中所述凝胶层析处理中所用洗脱液为正丁醇和醋酸水溶液的混合液。
优选的，所述正丁醇和醋酸水溶液的质量比为(1.5-3):1；
所述醋酸水溶液的浓度为30-40wt％。
优选的，所述洗脱液为正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的混合液。
优选的，所述正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为(0.8-0.9):1:(0.2-0.3)。
优选的，所述正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为0.9:1:0.2；
所述醋酸水溶液的浓度为35wt％。
优选的，步骤3)中利用葡聚糖凝胶柱G-10对滤液进行凝胶层析；
步骤4)中利用葡聚糖凝胶柱G-25对浓缩后的第一洗脱液进行凝胶层析。
优选的，步骤1)中所述山黧豆和水的质量比为1：(7-10)；
所述浸提温度为50-70℃，所述浸提时间为0.5-3小时。
优选的，步骤2)中利用100-120目筛对浸提液进行过滤；
步骤5)中还包括对加水后的溶液调节pH至8-10的步骤；
步骤6)中在加入硫酸铵水溶液之前还包括将蛋白质溶液调节pH至3-4的步骤；所述硫酸铵水溶液为饱和硫酸铵水溶液。
优选的，还包括将淀粉沉淀用水洗涤，然后烘干的步骤。
本发明所用葡聚糖凝胶柱G-10和葡聚糖凝胶柱G-25均为本领域现有常规色谱柱，可通过现有常规方法自行装填相应的固相载体获得，也可以通过市售获得。本发明所用葡聚糖凝胶柱G-10的分离范围<700Mr，葡聚糖凝胶柱G-25的分离范围1000-5000Mr。本发明所述的山黧豆即为山黧豆种子。
本发明的有益效果：
1)本发明提供的山黧豆生物组分的多级分离方法，通过将山黧豆进行水浸提，过滤分离得到纤维素和滤液，然后将滤液进行两次凝胶层析，洗脱液经过离心分离等操作，从而实现山黧豆中纤维素、蛋白质和淀粉成分的高效分离，本发明所述分离方法可大大提高山黧豆中淀粉和蛋白质的提取率。同时本发明的分离方法可避免山黧豆中含有的山黧豆毒素(ODAP)对山黧豆实际应用的限制，实现了山黧豆的分类利用。
2)本发明提供的山黧豆生物组分的多级分离方法，进一步的，步骤3)中所述凝胶层析处理步骤中所用洗脱液为正丁醇和醋酸水溶液的混合液；步骤4)中所述凝胶层析处理中所用洗脱液为正丁醇和醋酸水溶液的混合液。优选的，所述正丁醇和醋酸水溶液的质量比为(1.5-3):1；所述醋酸水溶液的浓度为30-40wt％。本发明通过使用上述正丁醇和醋酸水溶液的混合液作为洗脱液，有利于山黧豆中生物组分的脱离，提高山黧豆中淀粉和蛋白质的提取率，进而实现山黧豆中生物组分的有效分离。
3)本发明提供的山黧豆生物组分的多级分离方法，进一步的，所述洗脱液为正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的混合液。优选的，所述正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为(0.8-0.9):1:(0.2-0.3)。本发明在洗脱液中加入2-乙氧基丁烷，并控制正丁醇、醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为(0.8-0.9):1:(0.2-0.3)，经研究发现可大大提高山黧豆中淀粉和蛋白质的提取率。
4)本发明提供的山黧豆生物组分的多级分离方法，进一步的，步骤3)中利用葡聚糖凝胶柱G-10对滤液进行凝胶层析；步骤4)中利用葡聚糖凝胶柱G-25对浓缩后的第一洗脱液进行凝胶层析。本发明通过在不同的步骤中利用葡聚糖凝胶柱G-10和葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，可最大程度保证山黧豆中生物成分脱离出来，从而有利于实现山黧豆中生物组分的有效分离。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明山黧豆生物组分的多级分离工艺流程图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将5g山黧豆粉碎，加入山黧豆重量8倍的水进行浸提，得到浸提液；所述浸提温度为60℃，所述浸提时间为1小时，然后将浸提液过100目筛，得到纤维素和滤液；
2)将步骤1)得到的滤液上葡聚糖凝胶柱G-10进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇和35wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和35wt％的醋酸水溶液的质量比为2:1)，合并3次洗脱液，即为第一洗脱液；
3)将第一洗脱液浓缩后上葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇和35wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和35wt％的醋酸水溶液的质量比为2:1)，合并3次洗脱液，即为第二洗脱液；
4)将第二洗脱液浓缩后加入100ml水，调节溶液pH为9，在40℃下搅拌50分钟，然后用碟片式离心机进行离心，分离得到上层蛋白质溶液和下层淀粉沉淀；
5)将下层淀粉沉淀用水洗涤至中性，然后置于40℃下烘干3小时，得到干燥淀粉；将步骤4)中得到的上层蛋白质溶液调节pH为4，加入100ml饱和硫酸铵水溶液，然后加热至40℃后通过纳滤膜(所述纳滤膜的截留分子量MWCO 300 Dalton)过滤，分离得到滤渣，滤渣在40℃下烘干5小时，得到蛋白质。
经检测，所得蛋白质的提取率为79％；所得淀粉的提取率为81％；
蛋白质的提取率/％＝步骤5)所得蛋白质的质量/山黧豆中蛋白质质量；
淀粉的提取率/％＝步骤5)所得淀粉的质量/山黧豆中淀粉质量。
实施例2
本实施例提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将5g山黧豆粉碎，加入山黧豆重量7倍的水进行浸提，得到浸提液；所述浸提温度为70℃，所述浸提时间为0.5小时，然后将浸提液过200目筛，得到纤维素和滤液；
2)将步骤1)得到的滤液上葡聚糖凝胶柱G-10进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为60ml，洗脱液由正丁醇和30wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和30wt％的醋酸水溶液的质量比为1.5:1)，合并3次洗脱液，即为第一洗脱液；
3)将第一洗脱液浓缩后上葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为60ml，洗脱液由正丁醇和30wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和30wt％的醋酸水溶液的质量比为1.5:1)，合并3次洗脱液，即为第二洗脱液；
4)将第二洗脱液浓缩后加入100ml水，调节溶液pH为8，在40℃下搅拌50分钟，然后用碟片式离心机进行离心，分离得到上层蛋白质溶液和下层淀粉沉淀；
5)将下层淀粉沉淀用水洗涤至中性，然后置于40℃下烘干3小时，得到干燥淀粉；将步骤4)中得到的上层蛋白质溶液调节pH为3，加入100ml饱和硫酸铵水溶液，然后加热至40℃后通过纳滤膜(所述纳滤膜的截留分子量MWCO 300 Dalton)过滤，分离得到滤渣，滤渣在40℃下烘干5小时，得到蛋白质。
经检测，所得蛋白质的提取率为73％；所得淀粉的提取率为77％；
蛋白质的提取率/％＝步骤5)所得蛋白质的质量/山黧豆中蛋白质质量；
淀粉的提取率/％＝步骤5)所得淀粉的质量/山黧豆中淀粉质量。
实施例3
本实施例提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将5g山黧豆粉碎，加入山黧豆重量10倍的水进行浸提，得到浸提液；所述浸提温度为50℃，所述浸提时间为3小时，然后将浸提液过200目筛，得到纤维素和滤液；
2)将步骤1)得到的滤液上葡聚糖凝胶柱G-10进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇和40wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和40wt％的醋酸水溶液的质量比为3:1)，合并3次洗脱液，即为第一洗脱液；
3)将第一洗脱液浓缩后上葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇和40wt％的醋酸水溶液混合构成，正丁醇和40wt％的醋酸水溶液的质量比为3:1)，合并3次洗脱液，即为第二洗脱液；
4)将第二洗脱液浓缩后加入100ml水，调节溶液pH为10，在40℃下搅拌60分钟，然后用碟片式离心机进行离心，分离得到上层蛋白质溶液和下层淀粉沉淀；
5)将下层淀粉沉淀用水洗涤至中性，然后置于50℃下烘干3小时，得到干燥淀粉；将步骤4)中得到的上层蛋白质溶液调节pH为4，加入110ml饱和硫酸铵水溶液，然后加热至45℃后通过纳滤膜(所述纳滤膜的截留分子量MWCO 300 Dalton)过滤，分离得到滤渣，滤渣在40℃下烘干5小时，得到蛋白质。
经检测，所得蛋白质的提取率为75％；所得淀粉的提取率为78％；
蛋白质的提取率/％＝步骤5)所得蛋白质的质量/山黧豆中蛋白质质量；
淀粉的提取率/％＝步骤5)所得淀粉的质量/山黧豆中淀粉质量。
实施例4
本实施例提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将5g山黧豆粉碎，加入山黧豆重量9倍的水进行浸提，得到浸提液；所述浸提温度为55℃，所述浸提时间为0.8小时，然后将浸提液过100目筛，得到纤维素和滤液；
2)将步骤1)得到的滤液上葡聚糖凝胶柱G-10进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷混合构成，正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为0.8:1:0.3)，合并3次洗脱液，即为第一洗脱液；
3)将第一洗脱液浓缩后上葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷混合构成，正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为0.8:1:0.3)，合并3次洗脱液，即为第二洗脱液；
4)将第二洗脱液浓缩后加入100ml水，调节溶液pH为9，在40℃下搅拌50分钟，然后用碟片式离心机进行离心，分离得到上层蛋白质溶液和下层淀粉沉淀；
5)将下层淀粉沉淀用水洗涤至中性，然后置于40℃下烘干3小时，得到干燥淀粉；将步骤4)中得到的上层蛋白质溶液调节pH为4，加入120ml饱和硫酸铵水溶液，然后加热至40℃后通过纳滤膜(所述纳滤膜的截留分子量MWCO 300 Dalton)过滤，分离得到滤渣，滤渣在40℃下烘干5小时，得到蛋白质。
经检测，所得蛋白质的提取率为85％；所得淀粉的提取率为88％；
蛋白质的提取率/％＝步骤5)所得蛋白质的质量/山黧豆中蛋白质质量；
淀粉的提取率/％＝步骤5)所得淀粉的质量/山黧豆中淀粉质量。
实施例5
本实施例提供一种山黧豆生物组分的多级分离方法，包括如下步骤：
1)将5g山黧豆粉碎，加入山黧豆重量8倍的水进行浸提，得到浸提液；所述浸提温度为60℃，所述浸提时间为1小时，然后将浸提液过100目筛，得到纤维素和滤液；
2)将步骤1)得到的滤液上葡聚糖凝胶柱G-10进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷混合构成，正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为0.9:1:0.2)，合并3次洗脱液，即为第一洗脱液；
3)将第一洗脱液浓缩后上葡聚糖凝胶柱G-25进行凝胶层析，上样吸附后，加洗脱液洗脱3次(每次洗脱液的用量为50ml，洗脱液由正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷混合构成，正丁醇、35wt％的醋酸水溶液和2-乙氧基丁烷的质量比为0.9:1:0.2)，合并3次洗脱液，即为第二洗脱液；
4)将第二洗脱液浓缩后加入100ml水，调节溶液pH为9，在40℃下搅拌50分钟，然后用碟片式离心机进行离心，分离得到上层蛋白质溶液和下层淀粉沉淀；
5)将下层淀粉沉淀用水洗涤至中性，然后置于40℃下烘干3小时，得到干燥淀粉；将步骤4)中得到的上层蛋白质溶液调节pH为4，加入100ml饱和硫酸铵水溶液，然后加热至40℃后通过纳滤膜(所述纳滤膜的截留分子量MWCO 300 Dalton)过滤，分离得到滤渣，滤渣在40℃下烘干5小时，得到蛋白质。
经检测，所得蛋白质的提取率为87％；所得淀粉的提取率为91％；
蛋白质的提取率/％＝步骤5)所得蛋白质的质量/山黧豆中蛋白质质量；
淀粉的提取率/％＝步骤5)所得淀粉的质量/山黧豆中淀粉质量。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
