靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备
技术领域
本发明属于CRISPR基因治疗领域，具体涉及靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备。
背景技术
病毒感染是危害人类健康的主要威胁之一，与人类密切相关的有呼吸道病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒等。目前应对病毒感染的方法主要依赖疫苗防御和药物治疗。但即使是最先进的疫苗也无法完全覆盖不同种族人群的全部感染型别。同时，很大一部分已经存在感染的人群无法接受疫苗的接种；而不断突变的病毒致病基因也给预防性疫苗的应用带来了挑战。此外，部分病毒疫苗价格昂贵，在中国及其他发展中国家推行全民疫苗接种，在经济、依从性和效果上均难以保障。最重要的一点是，很多病毒性感染疾病目前尚无有效的治疗性抗体或药物，导致已经存在感染的人群既无法接受疫苗的接种，亦无药物来彻底清除，只能定期筛查随访。长期反复的筛查给广大患者带来了严重的心理压力及经济负担，部分人群甚至失访。在此背景下，随着全基因组测序技术的成熟和基因功能的研究，通过基因编辑进行抗病毒治疗成为可能并有良好趋势。
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染是全球范围最常见的性传播疾病之一。流行病学研究表明，约80％的女性在一生中至少会感染一次HPV，而男性的几率约50％。高危型HPV持续感染会导致宫颈癌、外阴癌、阴道癌及阴茎癌、肛周癌等恶性肿瘤，同时也会增加HIV感染的机会。近年来，随着社会经济的发展，我国HPV感染逐渐泛滥，且有年轻化趋势，已成为一个严重的社会公共卫生问题。
HPV属于乳头多瘤空泡病毒科，无外包膜，其核心是由含有遗传信息的闭合环状双链DNA组成，双链呈高度螺旋化，由早期区(E)、晚期区(L)和上游调控区(URR)组成。其中，L区和URR区分别承担自身免疫原性和自身复制启始作用，而E区编码区是HPV致病的关键功能结构域，其生物学特征变化是导致宫颈癌的分子基础。确切证据表明，HPV整合入宿主基因组形成持续感染是宫颈癌发生发展的必要条件，整合后HPVE6、E7癌蛋白的持续异常表达，是宫颈癌发生发展的关键因素，而驱动E6E7癌蛋白持续高表达的主要受HPV上游调控序列URR的调控。HPVURR含E1和E2蛋白结合位点，以及其他病毒复制必需元件并包含了多种转录因子结合位点，这些转录因子通过与URR结合调节启动子的活性，从而影响致癌基因E6、E7的表达。另一方面，整合后的URR可以在独立于细胞周期本身的复制周期，开始独立复制，同时带动其两端侧翼序列的人基因组共同复制，导致人基因组重排，结构变异，最终促进癌变。因此URR区是HPV致癌的关键因素。
EBV病毒属疱疹病毒家族，由双链DNA，衣壳和脂质双层膜组成。EBV在人群中感染十分普遍，特别是在儿童期易感染，并可终生潜伏。EBV可引起急性和慢性疾病，要是急性传染性单核细胞增多症和肿瘤，如Burkit淋巴瘤，Hodgkin病、鼻咽癌，口咽鳞状细胞瘤和T细胞恶性肿瘤等。EBV致癌分子机制十分复杂，而且还没有完全认识清楚。EBV基因组表达6种核抗原和2种膜蛋白。核抗原EBVA2可以通过细胞水蛋白而与细胞启动子相互作用，致使感染的细跑转化和永生化。膜蛋白LMP1是一个关键蛋白，它可以使啮齿类成纤维细胞逐渐表现为肿瘤特性。研究证明LMP1基因可激话CAfYC等原癌基因表达，进而增加染色体易位的发生率。同时LMP1基因诱导抗测亡蛋白BCL2和A20表达，以促进细胞增殖和抗测亡。因此LMP1基因可能是EBV感染疾病的关键元件之一。
因此，在明确病毒性感染疾病的关键致病或致癌元件的前提下，可利用基因编辑工具定向切除关键元件，清除病毒达到逆转癌变的效果。目前的基因编辑技术主要包括ZFN、TALEN和CRISPR。但是研究发现，ZFN和TALEN设计困难，构建工艺复杂，而CRISPR系统操纵简单、编辑功能强大、通用性更广。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术由细菌和古细菌中存在的II型CRISPR/Cas9获得性免疫系统经人工改造而成。该系统的主要特点是在特异性guide RNA的指导下，Cas核酸酶靶向识别并降解外源DNA。该系统已在多种病毒(如HPV、HIV、HBV、EBV等)中证实了其的强大切割效率，因而，CRISPR系统在病毒持续性感染的治疗中具有巨大潜能。
CRISPR/Cas9发挥作用的主要机制是通过guide RNA特异性识别靶DNA序列，并将Cas核酸酶引导至靶DNA进行切割产生DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)。DSB是细胞内严重的致命性损伤，DSB产生可立即启动宿主细胞的自我修复机制。主要的修复机制有两种：同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)(Chapman,J R等，2012，Molecular cell.47：497-510)。同源重组可以利用以另一条姐妹染色单体或其他的DNA模板进行修复，是一种高保真的修复方式；非同源末端连接在整个细胞周期中具有活性，并且具有更高的修复能力，因为不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或广泛的DNA合成。这种修复方式虽然能避免DNA断裂造成的DNA降解对细胞生存的影响，但是极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，进而造成框移突变，最终下调基因的功能。若DSB产生过多或修复不及时，则对细胞中造成致命性损伤，细胞凋亡。因此，应用Cas9靶向切割病毒性疾病中的病毒关键元件，可通过在特异的DNA位点上诱导产生DSB，再借助细胞利用NHEJ方式修复DSB时造成框移突变，甚至直接诱导病变细胞死亡，达到彻底清除病毒或病变细胞的目的。
让CRISPR/Cas9在真核细胞中发挥作用，需要将其表达序列装入真核表达载体上。Minicircle DNA是近年研究出的一种新型载体，是传统质粒在大肠杆菌中通过特异性的基因位点重组得到的一种小环超螺旋DNA。Minicircle DNA不含有抗生素抗性标记或细菌的复制起点，这种小的载体可以在体内或体外长时间的表达基因，并且不像其他标准普通质粒由于含有细菌的DNA骨架而引起免疫原性反应，因此Minicircle DNA是一个理想的、安全的、高效的表达转基因的非病毒载体。
同时，要实现有效的基因治疗，基因递送体系是一个重要组成部分。由于Minicircle DNA，为高度亲水的大分子，表面携带负电荷，难以通过被动扩散的方式穿过细胞膜，因此需要基因载体来递送治疗基因。同时，考虑到宫颈癌、鼻咽癌等发生位置的特殊性，常规体系粘附力和渗透性不强，不易将Minicircle DNA递送进癌组织和细胞，因此，需要开发有效的基因载体，能复合质粒、保护质粒免受环境中各种因素(如酶)的降解，能跨越一系列生理屏障，携带质粒进入癌细胞，通过内涵体/溶酶体逃逸和基因释放来实现递送质粒的作用。因此，虽然阳离子聚合物种类繁多，对于特定的细胞体系，并不是所有的阳离子聚合物都能适用。
发明内容
本发明的目的是提供靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。
靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，它按以下步骤实现：
一、制备靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的质粒：
a、利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对人乳头瘤病毒16型的URR基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示；
b、利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对疱疹病毒的LMPI基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示；
二、构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体：
c、将人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒；
d、将疱疹病毒的LMPI基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒；
三、制备基因转染材料：
f、合成带有双键末端的中间产物；
g、利用步骤f中产物合成带氨基末端的中间产物；
h、利用步骤g中产物合成带羧基末端的中间产物；
i、利用步骤h中产物合成壳聚糖接枝聚-β-氨基酯，其结构通式为
，所述结构通式中m为10～30，壳聚糖部分的分子量为2～50w；
四、复合纳米粒的制备：将壳聚糖接枝聚-β-氨基酯超声溶解于溶剂中，然后加入靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒或靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒，涡旋振荡混匀后室温孵育30min，即完成靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备。
本发明利用构建的靶向高危型HPV URR癌基因的Minicircle-CRISPR/Cas9表达质粒和靶向EBV LMPI基因的Minicircle-CRISPR/Cas9表达质粒，通过合成具有黏膜粘附性和组织渗透性的新型聚合物壳聚糖接枝聚-β-氨基酯，制备复合纳米粒，将表达质粒高效转染到细胞中，特异性的诱导相应病毒阳性细胞的致癌元件移码突变，失去致癌特性，甚至直接由于DSB过多导致细胞凋亡。达到降低病毒负荷、清除病毒及病变细胞、逆转癌变的目的，具有重要的临床应用价值。
本发明中制备的靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒，对SiHa(人子宫颈鳞癌)细胞的杀伤力强，能有效抑制SiHa异位移植瘤的生长；并且本发明的制备方法简单，成本低。
本发明适用于敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因。
附图说明
图1为实施例中靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染SiHa细胞后，进行的诱导SiHa细胞凋亡的效率比较柱状图，其中Blank代表未处理的SiHa细胞凋亡率，Vector代表普通载体(保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的SiHa细胞凋亡率，Minicircle-V代表靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9(去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的SiHa细胞凋亡率；
图2为实施例中应用靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染SiHa细胞后，进行的T7E1酶切实验的电泳图，其中100bp Marker代表100bp标记物，Blank代表未处理组的酶切结果，Vector代表普通载体(保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的酶切结果，Minicircle-V代表靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9(去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的酶切结果；
图3为实施例中应用靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染SiHa细胞后，Minicircle-CRISPR/Cas9导致HPV16 mRNA(E6和E7)表达水平的柱状图，其中Blank代表未处理组的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达水平(即空白)，Vector-E6和Vector-E7代表普通载体(表达靶向HPV16 URR的CRISPR/Cas9，保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达水平，Minicircle-V-E6和Minicircle-V-E7代表靶向HPV16URR的Minicircle-CRISPR/Cas9(表达靶向HPV16 URR的CRISPR/Cas9，去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的SiHa细胞HPV16 E6/E7表达水平；
图4为实施例中应用靶向EBVL MP1的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染C666-1细胞后，进行的诱导C666-1细胞存活率对比图；其中NC代表未处理的C666-1细胞，EBV代表普通载体(保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的C666-1细胞存活率，EBV-pB1和EBV-pB2代表Minicircle-CRISPR/Cas9(去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的C666-1细胞存活率；
图5为实施例中应用靶向EBVLMP1的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染C666-1细胞后，进行的T7E1酶切实验的电泳图，其中NC代表未处理组的酶切结果，EBV代表普通载体(表达靶向HPV16 URR的CRISPR/Cas9，保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的酶切结果，EBV-pB1和EBV-pB2代表Minicircle-CRISPR/Cas9(去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的酶切结果；
图6为实施例中应用靶向EBVL MP1的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染C666-1细胞后，Minicircle-CRISPR/Cas9导致EBVLMP1 mRNA表达水平的柱状图，其中NC代表未处理组的C666-1细胞，EBV代表普通载体(保留了原核细菌的DNA骨架)转染后的C666-1细胞LMP1表达水平，EBV-pB1和EBV-pB2代表Minicircle-CRISPR/Cas9(去掉了原核细菌的DNA骨架)转染后的C666-1细胞LMP1表达水平；
图7为实施例中壳聚糖接枝聚-β-氨基酯的核磁氢谱图；
图8为实施例中不同结构的壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-GFP复合纳米粒在HEK293和SiHa细胞上的转染情况图；
图9为实施例中不同结构的壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-GFP复合纳米粒在小鼠阴道上皮细胞上的转染情况图；
图10为实施例中壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒对SiHa细胞存活率影响的柱状图；
图11为实施例中壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒对HPV16 mRNA(E6和E7)的表达水平的柱状图；
图12为实施例中壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒对SiHa异位移植瘤的生长抑制作用的柱状图；
图13为实施例中壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒对肿瘤组织HPV16 E6免疫组化图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备，它按以下步骤实现：
一、制备靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的质粒：
a、利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对人乳头瘤病毒16型的URR基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示；
b、利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对疱疹病毒的LMPI基因，设计其sgRNA序列；所述sgRNA序列如SEQ ID NO.2所示；
二、构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体：
c、将人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒；
d、将疱疹病毒的LMPI基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒；
三、制备基因转染材料：
f、合成带有双键末端的中间产物；
g、利用步骤f中产物合成带氨基末端的中间产物；
h、利用步骤g中产物合成带羧基末端的中间产物；
i、利用步骤h中产物合成壳聚糖接枝聚-β-氨基酯，其结构通式为
，所述结构通式中m为10～30，壳聚糖部分的分子量为2～50w；
四、复合纳米粒的制备：将壳聚糖接枝聚-β-氨基酯超声溶解于溶剂中，然后加入靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒或靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒，涡旋振荡混匀后室温孵育30min，即完成靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤三中所述制备基因转染材料的具体操作如下：
f、合成带有双键末端的中间产物：分别称取0.1mol 5-氨基-1-戊醇以及0.1mol1,4-丁二醇二丙烯酸酯，加1mLDMF，90℃搅拌反应24h；停止反应，用10mL DMF稀释反应液，再滴入6-10倍体积的乙醚中进行沉淀，蒸馏水洗两遍，用低速离心机离心得沉淀，干燥后得0.0045mol带有双键末端的中间产物；
g、利用步骤f中产物合成带氨基末端的中间产物：将上述0.0045mol带有双键末端的中间产物用5mLDMF溶解，加入5倍摩尔比的1,3-丙二胺，室温反应36h；停止反应，将反应液滴入相应体积的乙醚中进行沉淀，蒸馏水洗两遍，用低速离心机离心得沉淀，干燥后得0.0041mol带氨基末端的中间产物；
h、利用步骤g中产物合成带羧基末端的中间产物：将上述0.0041mol带氨基末端的中间产物用15mL DMF溶解，加入10倍摩尔比的琥珀酸酐，室温反应48h；停止反应，将反应液滴入相应体积的乙醚中进行沉淀，再次洗两遍后，用低速离心机离心得沉淀，干燥后得0.0037mol带羧基末端的中间产物；
i、利用步骤h中产物合成壳聚糖接枝聚-β-氨基酯：取上述带羧基末端的中间产物0.6g用3mL DMF溶解，与1.5倍摩尔量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和0.0052molN-羟基琥珀酰亚胺混合，反应4h后分成三等份，分别滴入到10mL不同浓度的壳聚糖水溶液中，冰浴反应4小时后，用1N NaOH将溶液的pH调节至6.7，离心去除沉淀，并将上清液的pH调节至8.0，离心收集沉淀后用去离子水和丙酮分别洗涤3次，冻干后得不同接枝度的壳聚糖接枝聚-β-氨基酯；所述不同浓度的壳聚糖水溶液中分别含有0.1g壳聚糖、0.2g壳聚糖和0.3g壳聚糖。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述壳聚糖接枝聚-β-氨基超声溶解于溶剂的体积质量比为0.015g:1ml。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述壳聚糖接枝聚-β-氨基超声溶解于靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒或靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒的质量比为(10～150):1。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述溶剂为水、枸橼酸缓冲液或醋酸缓冲液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
本实施例中使用的引物设计均使用Primer3 Plus在线引物设计工具(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)完成，由苏州金唯智生物科技有限公司合成；qRT-PCR试剂采用
1、从NCBI网站中查询获得URR/E6/E7癌基因的全长序列信息，利用CRISPR Design(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对HPV16(即人乳头瘤病毒16型)的URR设计并挑选1条最佳的sgRNA，挑选的HPV16序列为：
TAATTCATGTATAAAACTAAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(即人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA序列)；
其中，大写字母为sgRNA序列，即与靶DNA结合的序列，小写字母部分为scaffold，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。
从NCBI网站中查询获得疱疹病毒的LMPI癌基因的全长序列信息，利用CRISPRDesign(http://crispr.mit.edu/)在线sgRNA设计工具，针对EBV的LMPI设计并挑选1条最佳的sgRNA，挑选的EBV序列为：
GGGGCCCACCGGGCCCGCGAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(即疱疹病毒的LMPI基因的sgRNA序列)；
其中，大写字母为sgRNA序列，即与靶DNA结合的序列，小写字母部分为scaffold，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。
2、构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体：
将人乳头瘤病毒16型的URR基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的质粒；
将疱疹病毒的LMPI基因的sgRNA序列和Cas9序列克隆到真核表达载体PX330-Minicircle上，产物经鉴定后挑选出正确的克隆进行扩增并提取质粒，获得靶向敲除疱疹病毒关键基因的质粒；
上述构建Minicircle-CRISPR/Cas9的真核表达载体的具体操作如下：
(1)母本质粒(即Minicircle-CRISPR/Cas9)转化入细菌ZYCY10P3S2T中，在含有相应抗生素的培养基中，37℃下过夜培养，使细菌数量扩增；
(2)监测菌液，待OD(600)＝4～6，pH＝7.0时，加入诱导剂，30℃下培养5.5h，充分诱导重组酶的表达；
(3)将菌液收集离心去上清后，提取质粒；
(4)将所提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳及酶切鉴定是否为minicircle DNA以及其纯度；
所述含有相应抗生素的培养基的配置如下：
TB培养基；配制每L的TB培养基，胰化蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，溶解于900ml ddH2O中，高压灭菌30min；
TB buffer：0.17mol/L KH2PO4，0.72mol/L K2HPO4溶液(该溶液的配制方法是用90mL去离子水溶解2.31g KH2PO4和12.54g K2HPO4，完全溶解后，用去离子水定容至100mL并高压灭菌30min)；
将上述两部分分别高压灭菌后，当溶液冷至60℃或60℃以下将两部分溶液混合均匀。
所述加入诱导剂即：对于400mL的过夜培养，请准备一个包含400ml LB，16ml 1NNaOH和400μl20％L-阿拉伯糖的Minicircle诱导混合物(Minicircle Induction Reaction中的终浓度为0.01％)；其中，1N NaOH配置：就是1mol/L的NaOH，称取40g NaOH，溶解于600ml ddH2O，定容到1L；用0.22um针头滤器过滤后使用；
20％L-arabinose(L-阿拉伯糖)：称取L-arabinose 4g，溶解于15ml ddH2O，定容到20mL，用0.22um针头滤器过滤后使用。
所述酶切酶切的体系如下：minicircle DNA：1ug，EcoRI限制性内切酶10units，cutsmart buffer 2ul，补足ddH2O到20ul。
酶切条件为：37℃，30min。
Minicircle载体的产生原理：在母本质粒目的基因的两侧插入重组酶识别位点，然后通过arabinose诱导细菌表达重组酶phiC31整合酶和Sce I核酸内切酶，重组酶会识别DNA序列中的酶切位点，母本质粒则会被切割成2部分：一部分为携带目的基因的Minicircle DNA，而另一部分为会被降解的细菌骨架质粒，同时表达的Sce-I核酸内切酶可以识别骨架质粒上Sce-I位点，因此骨架质粒会被Sce-I核酸内切酶作用而最终降解，提高了Minicircle DNA的纯度，也有利于产率的提高。Minicircle载体相比较于普通载体而言，表达效果更强，持续时间更久。
3、CRISPR/Cas9-URR转染后诱导细胞凋亡：
CRISPR/Cas9-URR质粒转染到细胞后表达出来的靶向HPV16 URR的CRISPR/Cas9-URR系统，可以迅速识别HPV16 URR序列，发挥切割作用。切割后细胞主要通过不受细胞周期限制的NHEJ途径快速修复，从而引入小片段的插入或缺失(indel)，导致移码突变，最终使得URR功能丧失(驱动E6E7癌基因转录)，HPV16 E6E7癌蛋白的表达受到抑制。另一方面，由于URR的拷贝数可高达50个拷贝，均可被sgRNA识别并被Cas9切割，从而可产生多个DSB，DSB修复不及时并积累会诱发细胞程序性死亡机制，直接清除携带HPV的病变细胞。以上均可导致HPV感染细胞表现为增殖能力下降，凋亡增加。另一方面，针对HPV16 URR设计的sgRNA仅能特异性的识别并结合HPV16URR序列，不能识别其他序列。
具体操作方法是：
(1)细胞培养
HPV16阳性宫颈癌细胞系SiHa用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。
(2)质粒转染
24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2ugMinicircle-CRISPR/Cas9质粒，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的普通载体(2μg)作为对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)细胞凋亡的检测
转染48小时后，常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用南京凯基生物的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：KGA-107)中的Binding Buffer重悬细胞，分别加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟。Beckman公司的CytoFLEX流式细胞仪检测细胞凋亡。
试验结果显示，针对HPV16 URR设计的sgRNA质粒，转入minicircle-CRISPR/Cas9的SiHa细胞凋亡明显增加，如图1所示，凋亡率达到28％左右，而转入普通载体的SiHa细胞凋亡率为17％左右，未处理组SiHa细胞凋亡率未见明显增加。
4、CRISPR/Cas9-URR的sgRNA的切割效率验证
Cas9在细胞内发挥作用后切割形成的DSBs，可以迅速的诱导细胞进行自我NHEJ修复。但是NHEJ这种易错的修复方式极易在断裂点处引入小片段的基因插入或缺失，此时，若将这种已经过剪切又经细胞错误修复的碱基序列与未处理的正常的(野生型的)碱基序列混合后退火延伸，即可形成一种在剪切位点处存在错配的特殊的杂交双链(与修复后的碱基插入或缺失相对应)。这种杂交双链可被T7 Endonuclease I识别并在错配处切断。
因此，细胞转染质粒后，将这所有细胞的总基因组DNA提取出来，即可得到既含有切割后修复的DNA序列也含有未被处理的野生型序列的混合产物。再经PCR扩增，得到切割后修复的DNA序列和野生型序列的混合PCR产物，将此混合产物纯化后直接退火延伸，即可形成杂交双链，再应用T7 Endonuclease I进行酶切处理，就能识别并切断杂交双链，通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨。
具体实施方案如下：
(1)细胞的培养
SiHa细胞的融合度达90％以上时，常规0.25％胰酶消化，接种到6孔板中，每孔种植细胞量约5×105个，继续在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。
(2)质粒的转染
细胞培养过夜后，相差显微镜下观察细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％以上，即可进行质粒转染。每孔转染2ug minicircle-CRISPR/Cas9质粒，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，以等量的普通载体(2μg)作为对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养。
(3)基因组DNA的提取
转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟,弃除培养基，PBS洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)提取细胞基因组DNA，测量DNA浓度。
(4)引物的设计
分别根据HPV16 URR基因序列设计引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分切开的两个小片段)。本实施例中与URR sgRNA相对应的引物序列为：
HPV16 URR-F:gcgtgccaaatccctgtttt
HPV16 URR-R:agttgtttgcagctctgtgc
(5)PCR反应
以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的2×Easy
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。
(6)T7 Endonuclease I酶切反应及聚丙烯凝胶电泳
本实验使用的T7 Endonuclease I以及配套的10×NEB Buffer 2购自NewEngland Biolabs公司(货号：M0302S)。
具体操作步骤如下：
取200ng纯化PCR产物进行如下反应：
反应体系：
退火条件：
退火反应完成后，此时再加入T7 Endonuclease I 1μL，震荡混匀后，37℃孵育20分钟完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果显示(见图2)，上述PCR产物能被T7 Endonuclease I切断，出现一大一小两条条带，说明CRISPR/Cas9-URR在细胞内分别成功的切割HPV16 URR基因序列，通过Image J软件对条带的灰度值进行测算，就能估算CRISPR/Cas9的切割效率。
5、qRT-PCR明确靶向HPV16 URR的minicircle-CRISPR/Cas9对HPV 16的E6/E7mRNA转录水平的影响：
(1)样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离：每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。
③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
(2)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制均在冰上进行)
应用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System进行Real TimePCR反应，反应程序采用两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1：预变性
Reps：1
95℃30秒
Stage 2：PCR反应
Reps：40
95℃5秒
60℃30～34秒；
结果如图3所示，靶向HPV16 URR的Minicircle-CRISPR/Cas9和普通载体分别转染SiHa细胞后，Minicircle-CRISPR/Cas9导致HPV16 mRNA(E6和E7)表达水平降低比普通载体的更加明显。
6、CRISPR/Cas9-LMPI转染后诱导EBV阳性鼻咽癌细胞凋亡及机制：
CRISPR/Cas9-LMPI质粒转染到细胞后表达出来的靶向LMP1的CRISPR/Cas9-LMP1系统，可以迅速识别LMPI序列，发挥切割作用。切割后细胞主要通过不受细胞周期限制的NHEJ途径快速修复，从而引入小片段的插入或缺失(indel)，导致移码突变，最终使得LMPI功能丧失，LMPI癌蛋白的表达受到抑制。试验结果结果如图4、5和6所示，针对LMPI设计的sgRNA质粒，转入minicircle-CRISPR/Cas9的C666-1细胞存活率明显降低；T7E1酶切实验表明，CRISPR/Cas9-LMPI在细胞内分别成功的切割LMPI基因序列；qRT-PCR进一步证实了minicircle-CRISPR/Cas9具有最高的LMPI表达抑制能力。
7、基因转染材料壳聚糖接枝聚-β-氨基酯的合成：
从壳聚糖接枝聚-β-氨基酯(以下简称CP)的核磁共振氢谱图(见图7)可以看到：化学位移值处在4.12ppm属于1,4-丁二醇二丙烯酸酯上-COOCH2-的氢信号峰，1.52、1.68ppm处为5-氨基-1-戊醇上亚甲基-CH2-的氢信号峰，3.6-4.0ppm处为壳聚糖上的-OH质子峰，说明CP的合成成功。通过4.12ppm和3.6-4.0ppm的积分面积比可计算CP中聚(β-氨基酯)(PBAE)的质量百分数，分别为30％，50％和80％，记为CP0.3，CP0.5和CP0.8。
8、壳聚糖接枝聚-β-氨基酯的转染效率及杀伤能力：
以绿色荧光蛋白质粒(GFP)为模型，验证CP对SiHa细胞(HPV16阳性)的转染能力。将0.015gCP或对照PEI 25kD溶于1mLpH5.5的醋酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液与GFP按照不同质量比混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得CP-GFP复合物溶液。加入至融合度80％左右的SiHa细胞培养皿中，24h后将用荧光显微镜观察转染情况。从图8可以看到，CP0.5对SiHa细胞的转染能力最强，CP0.3和CP0.8次之，但均强于基因转染的“金标准”PEI 25kD，说明CP能将GFP快速有效的递送到细胞内，经溶酶体逃逸之后在细胞核大量表达绿色荧光蛋白。同时，CP的化学组成对其转染能力有显著的影响，PBAE含量中等的CP转染效率最高，无明显规律可寻。
在此基础上，将上述CP-GFP复合物溶液按30微升每只小鼠的剂量注射其阴道中，3天后用PBS冲取小鼠阴道/宫颈上皮细胞，PBS离心洗涤后上流式细胞仪检测转染效率。从图9可以看到，与体外转染类似，CP0.5对S小鼠阴道/宫颈上皮细胞的转染能力最强，CP0.3和CP0.8次之，但均强于基因转染的“金标准”PEI 25kD。
9、壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒(即靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的复合纳米粒)，对SiHa细胞的生长抑制能力：
将0.015g CP0.5或PEI 25kD溶于1mL pH5.5的醋酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液分别与针对HPV16 URR的HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9质粒按照不同质量比混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得质粒-CP0.5/PEI 25kD复合物溶液，加入至融合度80％左右的SiHa细胞培养皿中，36h后终止培养后，弃去孔内培养基，加入DMSO，置于酶标仪板上，振荡10s，在490nm处测定其紫外吸光度值，计算细胞的存活率，验证质粒对细胞的杀伤能力。从图10和11可以看到，CP0.5与对应质粒复合后对细胞的杀伤能力最强。此外，从E6、E7癌基因的表达量来看，质粒-CP0.5复合物可有效下调基因表达量，而PEI虽然也有一定的细胞杀伤能力，但对癌基因的表达影响不明显，其细胞毒性可能来自于PEI本身对细胞的破坏作用。
10、壳聚糖接枝聚-β-氨基酯-HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9复合纳米粒(即靶向敲除人乳头瘤病毒关键基因的复合纳米粒)，对SiHa移植瘤的治疗效果：
将0.015g CP0.5或PEI 25kD溶于1mL pH5.5的醋酸缓冲液中，超声溶解得载体溶液，将载体溶液与0.00003g针对HPV16 URR的HPV16 URR Minicircle-CRISPR/Cas9质粒混合均匀，涡旋振荡，室温孵育30min即得质粒-CP/PEI 25kD复合物溶液1mL；
另培养SiHa细胞至足够数量，消化细胞，用PBS洗两遍，再将细胞分散在PBS里，在裸鼠颈背部侧后皮下注射1E7个细胞，观察裸鼠出瘤情况。将植瘤成功的裸鼠随机分组，当肿瘤体积长至50-100mm3时，开始瘤周注射不同制剂，包括生理盐水(Saline)、纯质粒(mDNA)、质粒-PEI复合物(mDNA+PEI25 kD)和质粒-CP0.5复合物(mDNA+CP0.5)，质粒的剂量为6μg每只裸鼠。
每隔两天给药一次，将第一次给药记为第0天，共给三次药，测量裸鼠肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式为：体积＝长×宽×宽×0.5；第20天处死裸鼠，剥离肿瘤，将每组的肿瘤组织各取一部分用PBS洗净后存放至4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋后做免疫组化染色。
从肿瘤生长曲线图12和13可以看到：单独给予生理盐水或质粒时，肿瘤体积始终在变大，质粒组明显没有抑制肿瘤生长的作用，说明质粒不能被肿瘤细胞所摄取，而质粒-PEI复合物抑制肿瘤生长能力较弱，只有质粒-CP0.5复合物才能有效的抑制肿瘤的生长，说明CP0.5能将质粒递送至肿瘤细胞内，释放出质粒对相应基因组进行编辑，引起肿瘤细胞的凋亡，进而影响肿瘤组织的生长。免疫组化结果也证实，经过治疗后，质粒-CP0.5复合物组的HPV16 E7蛋白在肿瘤细胞上的表达相较于其它组有明显的较少，即该基因被成功编辑。
序 列 表
<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司
<120> 靶向敲除人乳头瘤病毒或疱疹病毒关键基因的复合纳米粒的制备
<160> 4
<210> 1
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HPV 16 URR基因的sgRNA序列。
<400> 1
taattcatgt ataaaactaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EBV LMPI基因的sgRNA序列。
<400> 2
ggggcccacc gggcccgcga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物HPV 16 URR-F。
<400> 3
gcgtgccaaa tccctgtttt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物HPV 16 URR-R。
<400> 4
agttgtttgc agctctgtgc 20
