昆布多糖锶络合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种昆布多糖锶络合物及其制备方法和应用。
背景技术
骨再生和修复已成为全球范围内的主要临床挑战之一，涉及多个过程，包括炎症反应、血管生成和骨再生。锶是一种对软骨和骨骼具有有益作用的微量元素，它可以促进骨再生。然而过多游离的锶离子在体内具有毒性，使得锶在骨再生和修复领域的应用受限。
发明内容
基于此，有必要提供一种无毒且能够促进骨再生的昆布多糖锶络合物的制备方法。
此外，还提供一种昆布多糖锶络合物及其应用。
一种昆布多糖锶络合物的制备方法，包括如下步骤：
将昆布多糖和水溶性锶盐在pH为9～11的条件下反应，制备反应液；及
向所述反应液中加入沉淀剂，静置反应，再经固液分离，制备昆布多糖锶络合物。
在其中一个实施例中，所述昆布多糖和所述水溶性锶盐中的锶元素的质量摩尔比为60g:1mol～250g:1mol。
在其中一个实施例中，所述将昆布多糖和水溶性锶盐在pH为9～11的水溶液中反应的步骤中，反应时间至少为1h，优选地，反应时间为1h～3h。
在其中一个实施例中，所述将昆布多糖和水溶性锶盐在pH为9～11的水溶液中反应的步骤包括：
将所述昆布多糖和所述水溶性锶盐分别溶解在水中，制备昆布多糖溶液和锶盐水溶液；
调节所述昆布多糖溶液的pH为9～11，向所述昆布多糖溶液中加入所述锶盐水溶液，然后继续在pH为9～11的条件下搅拌反应1小时以上。
在其中一个实施例中，所述昆布多糖溶液的浓度为0.5g/mL～5g/mL；及/或，所述锶盐水溶液中的锶元素的浓度为1.5mol/L～2.0mol/L；及/或，所述调节所述昆布多糖溶液的pH为9～11的步骤中，所用的试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾。
在其中一个实施例中，所述沉淀剂选自乙醇及丙酮中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述沉淀剂与所述反应液的体积比为2:1～5:1。
在其中一个实施例中，所述静置反应的时间至少为12h，优选地，所述静置反应的时间为24h～30h。
在其中一个实施例中，所述固液分离的步骤之后，还包括采用乙醇水溶液对固液分离后的沉淀进行纯化的步骤。
在其中一个实施例中，所述采用乙醇水溶液对固液分离后的沉淀进行纯化的步骤包括：依次使用不同浓度的乙醇水溶液清洗所述沉淀，再将所述沉淀干燥。
在其中一个实施例中，所述干燥的步骤中，干燥温度为-10℃～0℃；及/或，所述依次使用不同浓度的乙醇水溶液清洗沉淀的步骤包括：依次使用体积百分浓度为75％～85％的乙醇水溶液、体积百分浓度为55％～65％的乙醇水溶液以及体积百分浓度为35％～45％的乙醇水溶液与所述沉淀混合搅拌，混合搅拌的时间分别为至少30分钟。
一种昆布多糖锶络合物，由上述的昆布多糖锶络合物的制备方法制备。
上述的昆布多糖锶络合物在制备骨修复材料或制备抗炎材料中的应用。
实验证明：采用上述昆布多糖锶络合物的制备方法通过锶与昆布多糖大分子的络合反应，能够避免过多游离锶离子所带来的毒性，且制备的昆布多糖锶络合物能够通过促进血管生成和成骨细胞增殖而促进骨修复和再生，能够应用于骨修复领域。
附图说明
图1为一实施方式的昆布多糖锶络合物的制备方法的工艺流程图；
图2为实施例1、对比例3的产物的XRD图；
图3为实施例1得到的产物和对比例3的昆布多糖的红外光谱图；
图4为实施例1、对比例3及对照组的人脐静脉内皮细胞的增殖实验结果图；
图5为实施例1、对比例3及对照组的小鼠前成骨细胞的增殖实验结果图；
图6为实施例1、对比例3、诱导组及对照组的小鼠前成骨细胞的碱性磷酸酶染色图；
图7为实施例1、对比例3及对照组的人脐静脉内皮细胞的血管内皮生长因子VEGF的基因表达分析结果图；
图8为实施例1、对比例3及对照组的小鼠前成骨细胞的炎症因子IL-6的基因表达分析结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
锶是一种对软骨和骨骼具有有益作用的微量元素，它可以促进骨再生。昆布多糖对血管具有保护作用。本发明将昆布多糖和锶络合制备昆布多糖锶络合物发现，昆布多糖锶络合物具有较好地促进骨再生和修复的作用，且无毒，相较于昆布多糖而言，昆布多糖锶络合物具有较好的抗炎作用。
具体地，请参阅图1，本发明一实施方式的昆布多糖锶络合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：将昆布多糖和水溶性锶盐在pH为9～11的条件下反应，制备反应液。
其中，昆布多糖是指昆布中的大分子多糖物质。昆布多糖可以降低尿蛋白、净化血液的尿酸、改善血脂浓度，且对痛风、高血脂肾病、早中期肾衰竭有很好的防治作用。昆布多糖与一般的多糖类物质不同，它的分子链末端含有硫酸基，硫酸基与多糖通过酯键相连。在本实施方式中，将昆布多糖和锶离子络合，使得昆布多糖锶络合物具有促进血管生成和成骨细胞的增殖的作用，进而促进骨再生和修复。
具体地，昆布多糖和水溶性锶盐在水中反应。
通过控制pH为9～11，以使反应能够顺利地进行，而生成昆布多糖锶络合物。在其中一个实施例中，pH为9、9.5、10、10.5或11。实验证明，pH过高或过低，锶不能引入昆布多糖中从而不能生成昆布多糖锶络合物。
具体地，昆布多糖与水溶性锶盐中的锶元素的质量摩尔比为60g:1mol～250g:1mol。在其中一个实施例中，昆布多糖与水溶性锶盐中的锶元素的质量摩尔比为60g:1mol、100g:1mol、150g:1mol、200g:1mol或250g:1mol。优选地，昆布多糖与水溶性锶盐中的锶元素的质量摩尔比为80g:1mol～160g:1mol。锶元素过多，会使得络合物中有大量锶离子的残留，而残留的锶离子在体内具有毒性，导致该材料在体内产生危害作用。若锶元素加入量过少，则昆布多糖过量，使得络合反应不充分或部分昆布多糖中未络合上锶。
具体地，水溶性锶盐可以为本领域常用的、能够溶解在水中的锶盐，例如水溶性锶盐为氯化锶或硝酸锶。优选地，水溶性锶盐为氯化锶。氯化锶能够使制备的昆布多糖锶络合物中的副产物较少，纯度较高，且几乎无毒。
具体地，步骤S110中，使用氢氧化钠和/或氢氧化钾作为pH调节剂。可以理解，在其它实施例中，pH调节剂不限于为氢氧化钠和/或氢氧化钾，还可以为本领域常用的其他碱性试剂，如氨水等。但在本实施方式中，由于昆布多糖本身含有钠和钾，用氢氧化钠或者氢氧化钾作为pH调节剂不会产生多余的杂质，而氨水可能会给体系引入新的杂质。
在其中一个实施例中，pH调节剂为浓度为1.5mol/L～2.0mol/L的氢氧化钠水溶液或浓度为1.5mol/L～2.0mol/L的氢氧化钾水溶液。氢氧化钠和氢氧化钾均为强碱，浓度增大会造成昆布多糖的局部氧化，浓度过低为控制pH为9～11将造成加入的体积过大，使得反应液中昆布多糖和水溶性锶盐的浓度降低过多，反应不易发生。
具体地，将昆布多糖和水溶性锶盐在水中反应的步骤是在室温条件下进行的。其中，在本实施方式中，室温指的是10℃～40℃。将昆布多糖和水溶性锶盐在水中反应的步骤在搅拌的条件下进行，且反应时间至少为1h，以使昆布多糖和水溶性锶盐充分络合反应。具体地，反应时间为1h～3h。在其中一个实施例中，反应时间为1h、2h或3h。
在其中一个实施例中，步骤S110包括：
将昆布多糖和水溶性锶盐分别溶解在水中，制备昆布多糖溶液和锶盐水溶液；
调节昆布多糖溶液的pH为9～11，向昆布多糖溶液中加入锶盐水溶液，然后继续在pH为9～11的条件下搅拌反应1小时以上。
优选地，将昆布多糖和水溶性锶盐分别溶解在水中的步骤中使用的水为去离子水，以尽可能地减少杂质，提高产物的纯度。
在其中一个实施例中，昆布多糖溶液的浓度为0.5g/mL～1.5g/mL。在其中一个实施例中，昆布多糖溶液的浓度为0.5g/mL、0.8g/mL、1.0g/mL、1.2g/mL或1.5g/mL。昆布多糖溶液的浓度最大为1.5g/ml，而溶液浓度过小，会使得昆布多糖的含量太少，导致络合反应难以发生。
锶盐水溶液中的锶元素的浓度为1.5mol/L～2.0mol/L。在其中一个实施例中，锶盐水溶液中的锶元素的浓度为1.5mol/L、1.6mol/L、1.7mol/L、1.8mol/L或2.0mol/L。若锶离子浓度过大，锶盐的水解程度减小，溶液中的氢离子增多，从而影响pH，导致生成的络合物不稳定。锶离子浓度过低，配位键的形成较少，反应不完全。
可以理解，在其它实施例中，步骤S110不限于为上述步骤，还可以将昆布多糖溶液加入到锶盐水溶液中；或者，直接将昆布多糖和水溶性锶盐加入到水中进行搅拌反应。
步骤S120：向反应液中加入沉淀剂，静置反应，再经固液分离，制备昆布多糖锶络合物。
通过加入沉淀剂，然后静置反应，以使反应液中的昆布多糖锶络合物沉淀。具体地，沉淀剂为有机沉淀剂。沉淀剂可以为本领域常用的有机沉淀剂。具体地，沉淀剂选自丙酮及乙醇中的至少一种。进一步地，沉淀剂为无水乙醇。相对于无水丙酮，无水乙醇的毒性较小，使得制备得到的昆布多糖锶络合物也具有较小毒性，且无水乙醇较为廉价，有利于降低生产成本。
具体地，静置反应的时间为12小时以上，以使反应液中的昆布多糖锶络合物能尽可能地沉淀下来。进一步地，静置反应的时间为24h～30h。在其中一个实施例中，静置反应的时间为24h、25h、26h、28h或30h。
具体地，沉淀剂与反应液的体积比为2:1～5:1，以达到在不浪费较多沉淀剂的前提下使昆布多糖锶络合物充分沉淀的目的。在其中一个实施例中，沉淀剂与反应液的体积比为2:1、3:1、4:1或5:1。
进一步地，步骤S120之后，还包括纯化处理的步骤。具体地，采用乙醇水溶液清洗固液分离后的沉淀，以对昆布多糖锶络合物进行纯化处理。使用乙醇水溶液清洗以清洗掉沉淀中的氯化锶，提高昆布多糖锶络合物的纯度，且不会使昆布多糖锶络合物重新溶解。
具体地，使用乙醇水溶液清洗沉淀的步骤包括：依次使用不同浓度的乙醇水溶液清洗沉淀，再将沉淀干燥。在其中一个实施例中，将沉淀干燥的步骤中，干燥温度为-10℃～0℃。干燥时间为12h。在其中一个实施例中，干燥温度为-10℃、-5℃或0℃。实验证明，采用冷冻干燥的方式不会对所制备的昆布多糖锶络合物的结构造成破坏，从而保持昆布多糖锶络合物的性能。可以理解，在其他实施例中，将沉淀干燥的步骤中，还可以在加热的条件下进行干燥。
在其中一个实施例中，依次使用不同浓度的乙醇水溶液清洗沉淀的步骤包括：使用体积百分浓度为75％～85％的乙醇水溶液、体积百分浓度为55％～65％的乙醇水溶液以及体积百分浓度为35％～45％的乙醇水溶液依次与沉淀混合，混合搅拌的时间分别为至少30分钟。具体地，每种浓度的乙醇水溶液与步骤S110得到的反应液的体积比为2.5:1～5:1，以达到有效的洗涤和纯化目的。可以理解，在其他实施例中，不同浓度的乙醇水溶液不限于为体积百分浓度为75％～85％、55％～65％及35％～45％，还可以为其他浓度。
实验证明：采用上述昆布多糖锶络合物的制备方法制备的昆布多糖锶络合物通过锶与昆布多糖大分子的络合反应，能够避免过多游离锶离子在用于骨修复时的毒性。同时，制备的昆布多糖锶络合物还具备两者各自特性，并使锶能在体内有效释放，发挥锶对炎症减轻的作用，且能够通过促进血管生成和骨细胞增殖而较好地辅助骨修复。
另外，采用昆布多糖与锶进行络合，较采用其他多糖大分子与锶络合，昆布多糖对血管有更好的保护作用。
本发明还提供一实施方式的昆布多糖锶络合物，该昆布多糖锶络合物由上述实施方式的昆布多糖锶络合物的制备方法制备。该昆布多糖锶络合物具有较好的骨修复效果，且具有抗炎性。另外，该昆布多糖锶络合物还能够避免过多游离锶离子在体内应用时的毒性。
此外，本发明还提供一实施方式的昆布多糖锶络合物在制备骨修复材料或制备抗炎材料中的应用。由昆布多糖锶络合物制备的骨修复材料具有较好的骨修复效果和血管再生效果，且能有效抑制炎症。
以下为具体实施例部分(以下实施例如无特殊说明，则不含有除不可避免的杂质以外的其它未明确指出的组分)：
实施例1
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程具体如下：
(1)将昆布多糖溶解在去离子水中，配制成浓度为1g/mL的昆布多糖溶液；将氯化锶溶解在去离子水中，配制成浓度为1.8mol/L的氯化锶的水溶液；将氢氧化钠溶解在去离子水中，配制成浓度为1.8mol/L的氢氧化钠水溶液。
(2)在室温的条件下，按照昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为150g:1mol，向不断搅拌且使用氢氧化钠水溶液调节pH为10的昆布多糖水溶液中加入氯化锶的水溶液，待氯化锶的水溶液加入完成后，继续在pH值为10和室温下搅拌反应1小时，得到反应液。
(3)在反应液中加入有机沉淀剂，然后静置24小时，经过滤，收集沉淀。其中，有机沉淀剂为无水乙醇，有机沉淀剂与反应液的体积比为2:1。
(4)将沉淀与体积百分浓度为80％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，然后过滤得到滤渣；将滤渣与体积百分浓度为60％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，接着过滤，再将滤渣与体积百分浓度为40％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，再过滤，收集固体，将固体在-5℃下干燥12小时，得到昆布多糖锶络合物，其中，步骤(4)中每种浓度的乙醇水溶液与沉淀的体积质量比为3.5:1。
实施例2
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程具体如下：
(1)将昆布多糖溶解在去离子水中，配制成浓度为0.5g/mL的昆布多糖溶液；将氯化锶溶解在去离子水中，配制成浓度为2mol/L的氯化锶的水溶液；将氢氧化钠溶解在去离子水中，配制成浓度为1.5mol/L的氢氧化钠水溶液。
(2)在室温条件下，按照昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为60g:1mol，向不断搅拌且使用氢氧化钠水溶液调节pH为9的昆布多糖水溶液中加入氯化锶的水溶液，待氯化锶的水溶液加入完成后，继续在pH值为9和室温下搅拌反应2小时，得到反应液。
(3)在反应液中加入有机沉淀剂，然后静置25小时，经过滤，收集沉淀。其中，有机沉淀剂为无水乙醇，有机沉淀剂与反应液的体积比为3:1。
(4)将沉淀与体积百分浓度为80％的乙醇水溶液混合，并搅拌40分钟，然后过滤得到滤渣；将滤渣与体积百分浓度为60％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，接着过滤，再将滤渣与体积百分浓度为40％的乙醇水溶液混合，并搅拌50分钟，再过滤，收集固体，将固体在0℃下干燥12小时，得到昆布多糖锶络合物，其中，步骤(4)中每种浓度的乙醇水溶液与沉淀的体积质量比为2.5:1。
实施例3
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程具体如下：
(1)将昆布多糖溶解在去离子水中，配制成浓度为1.5g/mL的昆布多糖溶液；将氯化锶溶解在去离子水中，配制成浓度为1.5mol/L氯化锶的水溶液；将氢氧化钠溶解在去离子水中，配制成浓度为2mol/L的氢氧化钠水溶液。
(2)在室温下，按照昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为250g:1mol，向不断搅拌且使用氢氧化钠水溶液调节pH为11的昆布多糖溶液中加入氯化锶的水溶液，待氯化锶的水溶液加入完成后，继续在pH值为11和室温下搅拌反应3小时，得到反应液。
(3)在反应液中加入有机沉淀剂，然后静置30小时，经过滤，收集沉淀。其中，有机沉淀剂为无水乙醇，有机沉淀剂与反应液的体积比为3:1。
(4)将沉淀与体积百分浓度为80％的乙醇水溶液混合，并搅拌35分钟，然后过滤得到滤渣；将滤渣与体积百分浓度为60％的乙醇水溶液混合，并搅拌50分钟，接着过滤，再将滤渣与体积百分浓度为40％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，再过滤，收集固体，将固体在-10℃下干燥12小时，得到昆布多糖锶络合物，其中，步骤(4)中每种浓度的乙醇水溶液与沉淀的体积质量比为5:1。
实施例4
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程具体如下：
(1)将昆布多糖溶解在去离子水中，配制成浓度为0.8g/mL的昆布多糖溶液；将氯化锶溶解在去离子水中，配制成浓度为1.6mol/L氯化锶的水溶液；将氢氧化钠溶解在去离子水中，配制成浓度为1.6mol/L的氢氧化钠水溶液。
(2)在室温的条件下，按照昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为100g:1mol，向不断搅拌且使用氢氧化钠水溶液调节pH为10的昆布多糖水溶液中加入氯化锶的水溶液，待氯化锶的水溶液加入完成后，继续在pH值为10和室温下搅拌反应3小时，得到反应液。
(3)在反应液中加入有机沉淀剂，然后静置26小时，经过滤，收集沉淀。其中，有机沉淀剂为无水乙醇，有机沉淀剂与反应液的体积比为4:1。
(4)将沉淀与体积百分浓度为80％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，然后过滤得到滤渣；将滤渣与体积百分浓度为60％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，接着过滤，再将滤渣与体积百分浓度为40％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，再过滤，收集固体，将固体在0℃下干燥12小时，得到昆布多糖锶络合物，其中，步骤(4)中每种浓度的乙醇水溶液与沉淀的体积质量比为4:1。
实施例5
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程具体如下：
(1)将昆布多糖溶解在去离子水中，配制成浓度为1.2g/mL的昆布多糖溶液；将氯化锶溶解在去离子水中，配制成浓度为1.7mol/L氯化锶的水溶液；将氢氧化钠溶解在去离子水中，配制成浓度为1.6mol/L的氢氧化钠水溶液。
(2)在室温的条件下，按照昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为200g:1mol，向不断搅拌且使用氢氧化钠水溶液调节pH为9的昆布多糖水溶液中加入氯化锶的水溶液，待氯化锶的水溶液加入完成后，继续在pH值为9和室温下搅拌反应2小时，得到反应液。
(3)在反应液中加入有机沉淀剂，然后静置28小时，经过滤，收集沉淀。其中，有机沉淀剂为无水乙醇，有机沉淀剂与反应液的体积比为5:1。
(4)将沉淀与体积百分浓度为80％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，然后过滤得到滤渣；将滤渣与体积百分浓度为60％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，接着过滤，再将滤渣与体积百分浓度为40％的乙醇水溶液混合，并搅拌30分钟，再过滤，收集固体，将固体在-5℃下干燥12小时，得到昆布多糖锶络合物，其中，步骤(4)中每种浓度的乙醇水溶液与沉淀的体积质量比为3:1。
实施例6
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例1的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例中没有进行步骤(4)。
实施例7
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例1的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例的步骤(3)中有机沉淀剂为无水丙酮。
实施例8
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例1的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例的步骤(1)和步骤(2)中用硝酸锶代替氯化锶。
实施例9
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例2的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例的步骤(2)的昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为55g:1mol。
实施例10
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例3的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例的步骤(2)的昆布多糖与锶元素的质量摩尔比为255g:1mol。
实施例11
本实施例的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例1的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：本实施例的步骤(1)和步骤(2)中用氢氧化钾代替氢氧化钠。
对比例1
对比例1的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例2的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：对比例1的步骤(2)中pH控制为8.5。
对比例2
对比例2的昆布多糖锶络合物的制备过程与实施例3的昆布多糖锶络合物的制备过程相似，区别在于：对比例2的步骤(2)中pH控制为11.5。
对比例3
对比例3为实施例1中所用的昆布多糖，未进行络合处理。
以下为测试部分：
1、XRD测试：
图2为实施例1和对比例3的产物的XRD图。从图2中可以看出，相较于对比例3的昆布多糖的XRD结果，实施例1的昆布多糖锶络合物几乎没有XRD衍射峰，与对比例3的XRD谱图不同，表明掺入锶后昆布多糖的结晶度发生变化。XRD表征证实了锶成功地引入了昆布多糖中并形成新的复合物-昆布多糖锶络合物。
其中，实施例2～11制备的产物具有与实施例1的产物相似的XRD图，在此不再重复提供图谱，即实施例2～11也得到了昆布多糖锶络合物。对比例1和对比例2得到的产物与对比例3的昆布多糖的XRD相似，说明对比例1和对比例2的产物也仍然为昆布多糖，没有合成昆布多糖锶络合物。
2、红外光谱测试：
图3为实施例1得到的产物和对比例3的昆布多糖的红外光谱图，从图3中可以看出，相对于对比例3的昆布多糖，实施例1得到的昆布多糖锶络合物的基本骨架基本没有发生变化。
其中，实施例2～11得到的产物具有与实施例1的产物相似的红外光谱图，对比例1和对比例2得到的产物的红外光谱图与对比例3的昆布多糖的红外光谱图相似，在此不再赘述。
3、人脐静脉内皮细胞及小鼠前成骨细胞增殖实验：
将实施例1的昆布多糖锶络合物和对比例3的昆布多糖作为样品，分别用含有体积百分浓度为5％的FBS(胎牛血清)的DMEM培养基配制成浓度为10μg/ml的样品溶液，并将未添加样品的含有体积百分浓度5％的FBS的DMEM培养基作为对照液。
取人脐静脉内皮细胞HUVECs，用胰酶消化后并吹打制成单细胞悬液。在计数板上计数后，用含有体积百分浓度为5％的FBS的DMEM培养基稀释，然后种入96孔板中，孔板的每孔中的细胞大约为5000个，且每孔加入100μL单细胞悬浮液。然后将96孔板放置在二氧化碳培养箱中培养24小时，再将96孔板中的培养基吸出，接着向96孔板的孔中分别加入200μL上述样品溶液作为实验组，加入200μL的对照液作为对照实验，每种样品溶液设置平行的四个孔，例如，实施例1的昆布多糖锶络合物配制成的样品溶液设置四个孔，每个孔中的样品溶液为200μL。
采用细胞计数试剂盒-8检测人脐静脉内皮细胞在第一天和第五天的细胞增殖率，细胞计数试剂盒-8检测的原理为：成分WST-8被细胞脱氢酶生物还原为可溶于培养基的橙色甲产物，并且产生的甲产物的量与活细胞的数量成正比。运用酶标仪对每孔吸光度进行测量，得到吸光度值，通过吸光度值反映细胞增殖率。每种浓度的样品溶液的吸光度值为四个孔所测得的吸光度值的平均值。取小鼠前成骨细胞，采用同样的方法检测小鼠前成骨细胞在第一天和第五天的细胞增值率。
实施例1、对比例3及对照组的人脐静脉内皮细胞和小鼠前成骨的吸光度柱状图分别如图4和图5所示。其中，图4为实施例1、对比例3及对照组的人脐静脉内皮细胞的增殖实验结果图，图5为实施例1、对比例3及对照组的小鼠前成骨细胞的增殖实验结果图。从图4和图5中可以看出，昆布多糖锶络合物在第五天的时候能明显观察到对人脐静脉内皮细胞及小鼠前成骨细胞增殖的促进作用。
另外，培养7天后，将实施例1、对比例3和对照实验组的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1收集进行ALP活性检测，得到如图6所示的结果。简而言之，将收集到的细胞用胰蛋白酶消化后，加入细胞裂解缓冲液将细胞在冰上裂解1小时。然后将裂解物转移到离心管中，并在4℃(离心力为12000g)下离心5分钟。收集上清液，使用碱性磷酸酶分析试剂盒进行分析。
碱性磷酸酶(ALP)是成骨表型的标志物。如图6所示，与对照组和对比例3相比，实施例1的ALP活性水平更高，表明昆布多糖锶在加速MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化方面更有效，从而更有利于骨再生。
另外，由上述实验结果中可以看出，实施例1所制备的昆布多糖锶络合物能够促进人脐静脉内皮细胞及小鼠前成骨细胞增殖，这也可以说明昆布多糖锶络合物是无毒的。
4、基因表达分析
提取实施例1和对比例3的人脐静脉内皮细胞的mRNA，对其血管内皮生长因子VEGF进行基因表达分析，得到图7的实验结果。VEGF是诱导血管生成以加速骨愈合的关键因素，如图7所示，与对比例3和对照实验组相比，实施例1的人脐静脉内皮细胞的VEGF mRNA表达显著上调。这主要是因为昆布多糖锶中Sr离子的释放，可以刺激VEGF的表达。因此，昆布多糖锶络合物应有益于血管生成。
提取实施例1和对比例3的小鼠前成骨细胞的mRNA，对其炎症因子IL-6进行基因表达分析，得到图8所示结果。从图8中可以看出，相比较空白对照，对比例3和实施例1的炎症因子的表达都有明显下降，而比起对比例3，实施例1的炎症因子的表达量降低更多，由此说明昆布多糖锶络合物具有更好的抑炎效果。
从上述实验结果中可以看出，实施例1制备的昆布多糖锶络合物能够通过促进血管生成和成骨细胞增殖而促进骨修复和再生，能够应用于骨修复领域。
需要说明的是，上述进行实验测试所采用的是实施例1制备的昆布多糖锶络合物，实施例2～实施例11所制备的昆布多糖锶络合物的效果与实施例1相当，在此不再赘述。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
