一种安络小皮伞胞外多糖及应用
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，尤其涉及一种安络小皮伞胞外多糖及应用。
背景技术
安络小皮伞(Marasmiusandrosaceus)是一种药用真菌，普遍生长于茂密的林地之中，由于黑色和生长集中的麦芒状菌索，是以别称又叫鬼毛针，茶褐小皮伞等，研究表明安络小皮伞含有许多活性物质，如有胆甾醇醋酸酯、氨基酸、麦角甾醇、肉桂酸、β-谷甾醇、生物碱、蛋白质、甘露醇、腺苷以及多糖等大分子组分。
其中，多糖具有多种生物活性与功能，如抗氧化、降血糖、增强免疫等，其药理学活性等与其结构关系密切。目前，关于安络小皮伞多糖的药理研究主要集中于其免疫调节、抗氧化和镇痛等作用。
例如，中国专利201310150040.X公开了含有吸收促进剂的肠溶安络小皮伞糖蛋白微球在制备镇痛抗炎的药物中的应用。董媛等人在吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集中公开了安络小皮伞胞外及胞内多糖体外抗氧化性的研究。
然而，目前研究主要针对安络小皮伞粗多糖成分，而粗多糖的成分复杂，阻碍了安络小皮伞药用水平的提高，而关于安络小皮伞纯化、分离后得单一多糖组分及其相关活性等方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供一种安络小皮伞胞外多糖及应用，该多糖组分均一，结构新颖，具有良好的抗抑郁效果。
一种安络小皮伞胞外多糖，由包括如下步骤制备得到：
(1)将安络小皮伞接种于土豆培养基中活化，得种子液；
(2)将上述种子液接种于发酵罐，发酵培养，得发酵液；
(3)将上述发酵液压滤后得发酵滤液，将发酵滤液减压浓缩后，加入无水乙醇，搅拌后静置，离心、收集沉淀、冻干，得粗多糖；
(4)采用离子交换柱层析上述粗多糖后得三个组分，其中，含量第二的组分即为所得安络小皮伞胞外多糖。
进一步地，步骤(1)中，土豆培养基的制备方法包括：将200-300g土豆去皮，切丁，沸水煮30min，过滤，加入15-20g葡萄糖，定容至1L；
活化的条件包括：活化在摇床中进行，摇床转速为180rpm-250rpm；
活化的温度26℃-30℃，活化的时间5-8天。
进一步地，步骤(2)中，发酵培养的培养基为：蔗糖和/或葡萄糖10-20g/L，酵母浸粉和/或酵母膏和/或蛋白胨20-35g/L，KH2PO4 2.0-3.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0-3.5g/L，pH为7.0；
发酵培养的条件包括：转速为220rpm-300rpm，发酵的温度26℃-30℃，发酵的时间5-8天，通气量为150L/h-300L/h。
进一步地，步骤(3)中，发酵滤液减压浓缩至80℃的相对密度为1.15-1.25；静置的温度为4℃，静置的时间为12h；
无水乙醇与浓缩后的发酵滤液的体积比为4:1；
离心的条件为转速5000-8000rpm，时间为15-30min。
进一步地，步骤(4)具体为：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水以及氯化钠溶液进行梯度洗脱后，收集至洗脱管中进行多糖含量的测定；绘制离子交换层析洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，浓缩，透析，冻干，得各多糖组分。
进一步地，安络小皮伞胞外多糖分子量为85944Da；其中单糖组成摩尔比为：葡萄糖：阿拉伯糖＝0.56:0.08。
进一步地，安络小皮伞胞外多糖以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-阿拉伯糖为主链，以(1→6)-α-葡萄糖为侧链。
本发明还提出安络小皮伞胞外多糖在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明还提出安络小皮伞胞外多糖在制备抗抑郁保健品中的应用。
本发明提出安络小皮伞胞外多糖及应用具有以下优势：
本发明的安络小皮伞胞外多糖为首次从安络小皮伞发酵液中提取的，结构新颖，组分均一，其分子量为85944Da，单糖组成摩尔比为葡萄糖：阿拉伯糖＝0.56:0.08。采用FT-IR和NMR分析多糖的结构为以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-阿拉伯糖为主链，以(1→6)-α-葡萄糖为侧链；采用SEM分析多糖MEPS2的形貌具有非均质性，颗粒形态多样。经动物学实验测试MEPS2多糖具有良好的抗抑郁效果。本发明提出的安络小皮伞胞外多糖纯度高达98.89％。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS1、MEPS2、MEPS3的的洗脱曲线；
图2为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS2的红外(FT-IR)光谱图；
图3为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS2的核磁氢谱(H-NMR)图；
图4为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS2的核磁碳谱(C13-NMR)图；
图5为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS2的扫描电子显微镜(SEM)图；
图6为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS1、MEPS2、MEPS3对小鼠强迫游泳不动时间的影响；
图7为本发明实施例所得安络小皮伞胞外多糖MEPS1、MEPS2、MEPS3对小鼠悬尾不动时间的影响。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
安络小皮伞是一种药用真菌，其内含有许多活性物质，如氨基酸、多糖等大分子组分。目前安络小皮伞多糖的研究，主要集中于粗多糖，然而其成分复杂，药用机理尚不清楚，阻碍了安络小皮伞药用水平的提高。
一种安络小皮伞胞外多糖，安络小皮伞胞外多糖为均一组分，分子量为85944Da；其中单糖组成摩尔比为：葡萄糖：阿拉伯糖＝0.56:0.08。
具体而言，安络小皮伞胞外多糖以α-(1→4)-D-葡萄糖和α-(1→3)-阿拉伯糖为主链，以(1→6)-α-葡萄糖为侧链。
本发明通过对安络小皮伞胞外粗多糖进行进一步分离纯化得到均一组分的安络小皮伞胞外多糖，对其单糖组成、分子量、结构以及药用活性等进行分析，得到具有抗抑郁作用的多糖组分，为未来安络小皮伞高附加值产品的开发提供重要的参数依据和新颖的思路。
本发明实施例提出一种安络小皮伞胞外多糖，由包括如下步骤制备得到：
(1)将安络小皮伞接种于土豆培养基中活化，得种子液；
(2)将上述种子液接种于发酵罐，发酵培养，得发酵液；
(3)将上述发酵液压滤后得发酵滤液，将发酵滤液减压浓缩后，加入无水乙醇，搅拌后静置，离心、收集沉淀、冻干，得粗多糖；
(4)采用离子交换柱层析上述粗多糖后得三个组分，其中，含量第二的组分即为所得安络小皮伞胞外多糖，记为MEPS2。
本发明中，利用醇沉法提取安络小皮伞胞外粗多糖，Sevag法除蛋白，并通过阴离子交换层析法对多糖进行分离，由此提取分离出纯度高的均一安络小皮伞胞外多MEPS2。
本发明一实施例中，步骤(1)中，土豆培养基的制备方法包括：将200-300g土豆去皮，切丁，沸水煮30min，过滤，加入15-20g葡萄糖，定容至1L。
进一步地，活化的条件包括：活化在摇床中进行，摇床转速为180rpm-250rpm；活化的温度26℃-30℃，活化的时间5-8天。
本发明一实施例中，步骤(2)中，发酵培养的培养基为：蔗糖和/或葡萄糖10-20g/L，酵母浸粉和/或酵母膏和/或蛋白胨20-35g/L，KH2PO4 2.0-3.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0-3.5g/L，pH为7.0。蔗糖和/或葡萄糖为蔗糖或葡萄糖中的至少一种。酵母浸粉和/或酵母膏和/或蛋白胨中的至少一种。
进一步地，发酵培养的条件包括：转速为220rpm-300rpm，发酵的温度26℃-30℃，发酵的时间5-8天，通气量为150L/h-300L/h。
本发明一实施例中，步骤(3)中，压滤采用板框压滤机进行。
进一步地，发酵滤液减压浓缩至80℃的相对密度为1.15-1.25。
进一步地，静置的温度为4℃，静置的时间为12h。
进一步地，无水乙醇与浓缩后的发酵滤液的体积比为4:1。
进一步地，离心的条件为转速5000-8000rpm，时间为15-30min。
本发明一实施例中，步骤(4)具体为：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水以及氯化钠溶液进行梯度洗脱后，收集至洗脱管中进行多糖含量的测定；绘制离子交换层析洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，浓缩，透析，冻干。
进一步地，步骤(4)具体为：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水、0.1M(mol/L)、0.2M(mol/L)、0.3M(mol/L)、0.4M(mol/L)的氯化钠溶液进行梯度洗脱后，收集至不同序号的洗脱管中进行多糖含量的测定；然后以各洗脱管的序号为横坐标，各管吸光度值为纵坐标，绘制离子交换层析洗脱曲线，同一吸收峰内的洗脱液合并，浓缩，透析，冻干，得各多糖组分。
具体而言，粗多糖溶液的浓度为10-12mg/mL。
进一步地，离子交换柱层析选用DEAE凝胶柱作为层析柱；DEAE-52作为柱料。
进一步地，洗脱过程中，洗脱液的流速为1.5-2mL/min，洗脱液用量为500-800mL，自动接收器设置为1-2min/管。
进一步地，采用苯酚-硫酸法对每管中的多糖含量进行测定。
本发明还提出安络小皮伞胞外多糖MEPS2在制备抗疲劳药物中的应用。
本发明还提出安络小皮伞胞外多糖MEPS2在制备抗疲劳保健品中的应用。
本发明实施例中，服用MEPS2药物的动物，经过强迫游泳实验，小鼠悬尾不动实验，测得其抗抑郁性能较佳。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1安络小皮伞多糖MEPS2的提取与分离
(1)菌种活化：安络小皮伞接种于土豆培养基中活化，得种子液；
其中，土豆培养基的制备方法包括：将250g土豆去皮，切丁，沸水煮30min，过滤，加入18g葡萄糖，定容至1L；活化条件为：摇床转速为200rpm，发酵温度28℃，发酵时间7天。
(2)菌种培养：将步骤(1)所得种子液接种于发酵罐，培养，得发酵液；
其中，发酵培养基为：蔗糖和/或葡萄糖15g/L，酵母浸粉和/或酵母膏和/或蛋白胨28g/L，KH2PO4 2.5g/L，MgSO4·7H2O 3g/L，pH为7.0；发酵培养条件为：转速为260rpm，发酵温度28℃，发酵时间7天，通气量为200L/h。
(3)多糖提取：将步骤(2)所得发酵液采用板框式压滤法将发酵液过滤，得到发酵滤液；用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩至相对密度1.2(80℃)后，加入四倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12h，5000r/min离心20min，得其沉淀，沉淀部分加水复溶，采用活性炭吸附色素及Sevag试剂(氯仿:正丁醇v/v＝4:1)反复除蛋白，离心，减压浓缩，冷冻干燥，即得粗多糖。
(4)粗多糖分离：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M的氯化钠溶液进行梯度洗脱后，收集至洗脱管中进行多糖含量的测定；然后以各管的序号为横坐标，各管吸光度值为纵坐标，绘制离子交换层析洗脱曲线。同一吸收峰内的洗脱液合并，减压浓缩，透析，冻干，收集相应组分，分别记为MEPS1、MEPS2及MEPS3，并计算各多糖组分的含量，结果显示MEPS1、MEPS2及MEPS3含量比为6:2:1。其中，含量第二的组分即为所得目标安络小皮伞胞外多糖MEPS2。
安络小皮伞胞外多糖(MEPS)样品离子交换柱层析洗脱曲线如图1所示。
实施例2安络小皮伞多糖MEPS2组分的提取与分离
(1)菌种活化：安络小皮伞接种于土豆培养基中活化，得种子液；
其中，土豆培养基的制备方法包括：将200g土豆去皮，切丁，沸水煮30min，过滤，加入15g葡萄糖，定容至1L；活化条件为：摇床转速为180rpm，发酵温度26℃，发酵时间5天。
(2)菌种培养：将步骤(1)所得种子液接种于发酵罐，培养，得发酵液；
其中，发酵培养基为：蔗糖10g/L，酵母浸粉、酵母膏、蛋白胨20g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，pH为7.0；发酵培养条件为：转速为220rpm，发酵温度26℃，发酵时间5天，通气量为150L/h。
(3)多糖提取：将步骤(2)所得发酵液采用板框式压滤法将发酵液过滤，得到发酵滤液；用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩至相对密度1.15(80℃)后，加入四倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12h，5000r/min离心20min，得其沉淀，沉淀部分加水复溶，采用活性炭吸附色素及Sevag试剂(氯仿:正丁醇v/v＝4:1)反复除蛋白，离心，减压浓缩，冷冻干燥，即得粗多糖。
(4)粗多糖分离：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M的氯化钠溶液进行梯度洗脱后，收集至洗脱管中进行多糖含量的测定；然后以各管的序号为横坐标，各管吸光度值为纵坐标，绘制离子交换层析洗脱曲线。同一吸收峰内的洗脱液合并，减压浓缩，透析，冻干，收集相应组分，分别记为MEPS1、MEPS2及MEPS3，并计算各多糖组分的含量，结果显示MEPS1、MEPS2及MEPS3含量比为6:2:1。其中，含量第二的组分即为所得目标安络小皮伞胞外多糖MEPS2。
实施例3安络小皮伞多糖MEPS2组分的提取与分离
(1)菌种活化：安络小皮伞接种于土豆培养基中活化，得种子液；
其中，土豆培养基的制备方法包括：将300g土豆去皮，切丁，沸水煮30min，过滤，加入20g葡萄糖，定容至1L；活化条件为：摇床转速为250rpm，发酵温度30℃，发酵时间8天。
(2)菌种培养：将步骤(1)所得种子液接种于发酵罐，培养，得发酵液；
其中，发酵培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸粉和酵母膏35g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 3.5g/L，pH为7.0；发酵培养条件为：转速为300rpm，发酵温度30℃，发酵时间8天，通气量为300L/h。
(3)多糖提取：将步骤(2)所得发酵液采用板框式压滤法将发酵液过滤，得到发酵滤液；用旋转蒸发仪将滤液减压浓缩至相对密度1.25(80℃)后，加入四倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12h，5000r/min离心20min，得其沉淀，沉淀部分加水复溶，采用活性炭吸附色素及Sevag试剂(氯仿:正丁醇v/v＝4:1)反复除蛋白，离心，减压浓缩，冷冻干燥，即得粗多糖。
(4)粗多糖分离：将粗多糖溶解制成粗多糖溶液，转入层析柱，经蒸馏水、0.1、0.2M、0.3M、0.4M脱管中进行多糖含量的测定；然后以各管的序号为横坐标，各管吸光度值为纵坐标，绘制离子交换层析洗脱曲线。同一吸收峰内的洗脱液合并，减压浓缩，透析，冻干，收集相应组分，分别记为MEPS1、MEPS2及MEPS3，并计算各多糖组分的含量，结果显示MEPS1、MEPS2及MEPS3含量比为6:2:1。其中，含量第二的组分即为所得目标安络小皮伞胞外多糖MEPS2。
实施例4抗抑郁安络小皮伞胞外多糖MEPS2的纯度和分子量分析
用去离子水把多糖配制1mg/mL的溶液，用0.22μm膜过滤。色谱条件：用Agilent系列高效液相色谱仪系统；色谱柱为TSK G5000PWXL柱(7.8mm×300mm)；检测器是RI示差检测器；流动相为超纯水；流速为0.6mL/min；柱温25℃；检测器温度35℃；样品与葡聚糖标品进样量为20μL。各种葡聚糖标准品(2000KDa、500KDa、70KDa、40KDa和10KDa)的对数值(logM)为纵坐标，以其出峰时间(t)为横坐标，单糖标准曲线为y＝-0.186x+7.997；R2＝0.9994；
结果显示，MEPS2的纯度为98.89％，MEPS2的分子量为85944Da。
实施例5抗抑郁安络小皮伞胞外多糖MEPS2的单糖组成分析
采用HPLC对MEPS2进行单糖组成分析。
取多糖样品2mg，加2M TFA(三氟乙酸)2mL，密封120℃水解3h，冷却至室温离心取上清，加5mL甲醇，减压浓缩，氮气吹至干，得多糖水解产物。采用PMP(1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮)进行衍生化，具体操作如下：加适量水溶解，得样品水解液，取其100μL，加100μL 0.3MNaOH混匀，再加100μL 2M PMP-甲醇溶液混匀。70℃密封水浴30min，冷却至室温，离心，取上清，加100μL 0.3M HCl混匀，再加900μL氯仿除去多余PMP，离心除去下层氯仿层，取水层多糖衍生物，加500μL水稀释，过0.22μm的膜，进行HPLC分析。
HPLC检测条件如下：C18柱色谱柱(4.6×150mm)；流动相为0.1M pH 6.7磷酸缓冲盐：乙腈(v/v)＝83：17；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长250nm；上样量为20μL；
以甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖(Gal)123mg、木糖、阿拉伯糖及岩藻糖为标准品，在上述条件下，进行HPLC分析；
结果显示，MEPS2由葡萄糖和阿拉伯糖两种单糖组成，摩尔比为0.56：0.08，可看出，MEPS2为杂多糖。
实施例6抗抑郁安络小皮伞胞外多糖MEPS2的FT-IR分析
称取MEPS2样品1mg，与150mg KBr成分混匀，快速充分研磨压薄片，利用傅立叶变换红外光谱仪进行扫描，具体波长扫描范围4000～400cm-1，MEPS2的红外图谱如图所示，由图2红外光谱所示，从图2可以看出3412cm-1处的吸收峰是羟基(-OH)伸缩振动吸收峰，2923cm-1及2852cm-1处的吸收峰是-CH伸缩振动吸收峰，这两个基团是多糖的特征峰；1663cm-1处的吸收峰是羟基(-OH)弯曲振动吸收峰，1402cm-1处则是-CH2的变形吸收峰，1069cm-1处则是醇羟基(R-CH2OH)变角振动吸收峰，1053cm-1的吸收峰表明多糖由α-D-吡喃多糖组成。
实施例7抗抑郁安络小皮伞胞外多糖MEPS2的NMR分析
准确称取MEPS2样品5mg，溶于1.0mL重水(D2O)中，充分溶解后置于核磁管，利用核磁共振仪测定样品各自氢谱、碳谱，结果如图3、4所示。
从图3、4可得，MEPS2结构信息共振信号出现超过δ5ppm，表明葡萄糖基键为α形式，并在δ5.259ppm出现葡萄糖的异头氢信号化学位移，即MEPS2的还原末端可能为α-D-Glc，这与FT-IR测定的结果相符；5.15、3.83和3.60ppm处的单体碳信号表明存在T-α-Araf，3.63-3.66ppm处的单体碳信号表明存在T-β-Araf，这与HPLC测定的组分MEPS2的单糖组成结果一致。
MEPS2的13C-NMR在160到180ppm的低场有信号，这表明含有糖醛酸，在100.87ppm的碳信号归因于(1→4)-D-葡聚糖，这进一步证实了具有α-吡喃型葡聚糖；69ppm的信号表明α-1-葡萄糖苷键和α-1，6-葡萄糖苷键的存在；102.3ppm信号可归因于T-α-Ara。
δ174.56和175.09ppm信号峰依次乙酰基中羰基、羧基峰，表明MEPS2部分羧基被乙酰基取代。δ61-78ppm是其他信号堆叠。
实施例8抗抑郁安络小皮伞胞外多糖MEPS2的SEM分析
用移液枪分别取多糖溶液滴一滴于1cm×1cm云母片上，室温静置5min，滤纸吸去多余的液体，喷金，SEM观察，结果如图5所示，从图5可得，MEPS2具有高度的非均质性，颗粒形态多样，大小不一，具有纤维方面的特征。
实施例9抗抑郁安络小皮伞多糖MEPS2的性能测试
通过强迫游泳实验、悬尾不动实验对小鼠进行动物实验，测试MEPS1、MEPS2、MEPS3三者的抗抑郁性能，仅在下列实验均表现出较优的抗抑郁性能时，才可证明其性能。
(1)小鼠强迫游泳实验
实验设MEPS1、MEPS2、MEPS3三个实验组和空白对照组，每组10只。实验组给药剂量按照离子交换柱层析纯化结果，根据以前研究基础安络小皮伞胞外多糖在给药剂量250mg/kg下具有明显的抗抑郁活性，计算可得MEPS1、MEPS2、MEPS3各实验组给药剂量分别为：180mg/kg、60mg/kg和30mg/kg，各组均按10mL/kg比例灌胃相应浓度的供试品或蒸馏水(空白对照组)。连续灌胃给药7days后，于末次给药30min后，将各组小鼠分别放进装有65-70％体积的水温为23-25℃的水桶中，使动物后肢远离水桶底部，不能依靠其支撑身体。将动物放于水中适应15min，观察各组动物6min内的不同游泳行为，分别记录每只动物的静止时间。其中，本实验静止时间的判断标准为小鼠的头部或头部及以下部分浮出水面，身体累计静止不动或有轻微动作的时间，游泳结束后，将动物擦干放于干净鼠笼中。结果如图6所示，MEPS1和MEPS3对小鼠强迫游泳实验中小鼠的不动时间无显著作用，而MEPS2能够显著缩短小鼠的不动时间至84±4s(*P<0.05)，发挥一定的抗抑郁作用。
(2)小鼠悬尾不动实验
动物分组以及给药剂量同上所述，连续给药7days后，于末次给药30min后，距离小鼠尾部1cm处用医用胶带贴于固定装置上，以保证每只小鼠头距离台面至少30cm，悬挂时间设6min，秒表计时后5min内小鼠累计不动时间(Immobility time/s)。结果如图7所示，MEPS1能够显著缩短小鼠的不动时间至87±4s(*P<0.05)，相同的，MEPS2能够显著缩短小鼠的不动时间至77±4s(**P<0.01)，而MEPS3对小鼠的不动时间无显著影响。
综上可知，MEPS2能够显著缩短小鼠强迫游泳和悬尾实验中的不动时间，具有良好的抗抑郁作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
