一株高效降解木质素的白囊耙齿菌
技术领域
本发明涉及一株高效降解木质素的白囊耙齿菌，属于微生物工程技术领域。
背景技术
木质纤维素类生物质是地球上储量最丰富的可再生资源，来源广泛，产生的碳排量较低，可用于获取洁净能源和高附加值化学品。以木质纤维素类生物质为原料，通过生物发酵将其转化成生物燃料和高值化学品的研究吸引到越来越广泛的关注。但是木质纤维素生物质的生物转化受到其复杂结构组成的影响，严重制约了其实现工业化炼制的进程。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，在木质纤维素结构中，木质素通过共价键和非共价键与纤维素和半纤维素发生化学相互作用，形成复杂的异质三维网状结构屏障，严重限制了纤维素酶和半纤维素酶与纤维素和半纤维素等多糖底物的结合，导致木质纤维素类生物质难以被降解利用。木质素分子是由愈创木基、紫丁香基和对羟苯基三种结构单元通过醚键和碳碳键连接而成的三维网状酚类非结晶性高分子聚合物，木质素的这种复杂结构、高分子量和不溶性使其成为植物抗降解的天然屏障。传统的物理、化学等方法对生物质中的木质素脱除率低，处理后产生的水解产物对于后续生物转换有较大的抑制作用，且易污染环境。而采用生物方法降解木质素具有条件温和、利于环保，且不产生后续发酵抑制物等优点。因此对能用于木质素高效降解的菌株的筛选与研究开发已经成为推动木质纤维素工业化生物炼制进程中的重要步骤之一。
已有研究表明，在自然环境中，对于木质素的完全降解，是真菌和细菌共同作用的结果，其中白腐真菌是降解木质素的主力军。白腐真菌可通过分泌多种木质素降解酶类来降解木质素，包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。其中，木质素过氧化物酶可降解近90％的非酚性木质素聚合物单元，而锰过氧化物酶可将Mn2+氧化为Mn3+，促进酚性和非酚性单元的氧化，漆酶可以氧化多种酚类和苯胺类化合物。此外，白腐真菌还可以通过类似于褐腐真菌的芬顿非酶氧化途径产生羟基自由基对木质素进行氧化解聚。
尽管已经分离出多种能降解木质素的白腐真菌，并对其开展了深入研究，但是仍存在菌株生长较慢、酶活性不高、木质素降解效率较低、木质素降解专一性不强等问题，正是由于这些问题的尚未解决，导致目前对木质素的生物降解开发尚未商业化。此外，大部分均是利用木质纤维素材料对菌株的木质素降解能力进行研究，而对于菌株降解纯木质素方面的研究还较少。通过开展菌株对于纯木质素的降解研究，更能明确菌株对木质素的降解能力和应用前景。
开展能高效降解木质素尤其是能高效降解纯木质素菌株的筛选对于开发工业化木质素降解菌株用于生物炼制工业将具有重要的现实意义，将有助于解决生物炼制过程中木质素预处理过程中的经济成本高、解聚效果差等问题。
因此，目前急需筛选得到一种具有可高效降解纯木质素的菌株。
发明内容
解决上述技术问题，本发明提供了一株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11，所述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18569，保藏日期为2019年09月09日。
本发明的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株来源于山林中枯立木或倒木上生长的真菌子实体，该菌株经测序分析，其ITS基因序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在Genbank中进行核酸序列比对，结果显示与白囊耙齿菌属的核酸序列相似度高达99.84％，将与其相似度高的菌株构建系统进化树(如图3所示)，结果显示，结合菌株形态特征和基于ITS基因序列的系统进化分析，鉴定为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，将其命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11。
所述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌种在PDA琼脂培养基上生长迅速，菌落呈现乳白色且均匀，扁平，有同生圆，菌丝呈现明显类似菊花的发散状(具体可见图1～2)。
本发明还提供了上述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在降解木质素中的应用。
本发明还提供了一种降解木质素的方法，所述方法为将上述白囊耙齿菌(Irpexlacteus)S-11接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液中，白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌体的浓度为6～10g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的接种体积与发酵培养基的体积之比为0.5～1.5:10。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的条件为：在温度为26～30℃，转速为160～190rpm的条件下发酵9～15天。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液的制备方法为：将白囊耙齿菌(Irpexlacteus)S-11菌丝体接种到种子培养基中，在温度为26～30℃，转速为160～190rpm的条件下培养2～5天。
本发明还提供了一种可用于降解木质素的产品，所述产品中含有白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11。
本发明还提供了一种发酵生产锰过氧化物酶的方法，所述方法为：将上述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种于种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种至含木质素的发酵培养基中发酵培养，得到发酵液；从发酵液中分离锰过氧化物酶。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液在发酵培养基中的接种量占发酵培养基总体积的至少10％。
有益效果：
(1)本发明提供了一种可高效降解木质素的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11，将本发明提供白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11接种至含有4g/L木质素的培养基中，于28℃，180rpm条件下培养11天后，对木质素的降解率和脱色率分别可高达33.81％和41.79％。
(2)本发明提供的一株可高效降解木质素的菌株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11对于纯木质素底物的降解，要高于国内外报道的同种属菌株对纯木质素的降解率，且降解时间较短，操作简单，适合生物炼制工业中木质素的生物预处理应用。
生物材料保藏
一株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11，分类学命名为白囊耙齿菌Irpexlacteus，已于2019年09月09日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18569，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11的菌落形态图；
图2：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11的菌丝形态图；
图3：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11基于ITS序列的系统发育树图；
图4：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在PDA-愈创木酚琼脂培养基上的产木质素降解酶检测图正面；
图5：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在PDA-愈创木酚琼脂培养基上的产木质素降解酶检测图背面；
图6：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在PDA-苯胺蓝琼脂培养基上的产过氧化物酶检测图正面；
图7：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在PDA-苯胺蓝琼脂培养基上的产过氧化物酶检测图背面；
图8：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在木质素发酵培养基培养过程中的生长曲线图；
图9：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在木质素发酵培养基培养过程中产锰过氧化物酶活性变化图；
图10：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11在木质素发酵培养基培养过程中对木质素的降解率/脱色率变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、(NH4)2SO4 3.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、K2HPO41.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.0～7.2。
木质素发酵培养基：木质素4.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、K2HPO41.0g/L,NaCl 0.1g/L、MgSO4 0.3g/L、MnSO4 0.05g/L、FeSO4 0.01g/L、CuSO4 0.01g/L、ZnSO40.01g/L、CoCl2 0.005g/L、Na2MoO4 0.001g/L、KAl(SO4)2 0.001g/L、H3BO3 0.01g/L，pH 7.0～7.2。
PDA琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB 0.05g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
PDA-苯胺蓝琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、苯胺蓝0.1g/L、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB0.05 g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
PDA-愈创木酚琼脂培养基：200.0g马铃薯的提取液1000mL、葡萄糖10.0g/L、愈创木酚0.04％(w/v)、MgSO4 1.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、VB0.05 g/L、琼脂20.0g/L，pH 7.0～7.2。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
锰过氧化物酶活性检测方法：
通过在469nm处监测2,6-DMP被氧化成3,3',5,5'-四甲氧联对苯醌时的体系中吸光度的增加值来检测(ε469＝49600L·mol-1·cm-1)；3mL的测量体系中含有2780μL的醋酸钠缓冲液，1mmol·L-1的MnS04、1mmol·L-1的2,6-DMP和100μL粗酶液，反应在加入1mmol·L-1H2O2后开始启动，使用酶标仪在469nm处测定3min内体系中吸光度的增加值。
酶活定义：在上述检测条件下，将每分钟使lμmol底物转化为产物所需的酶量定义为一个国际制酶活单位(IU)，并以IU·mL-1的单位来表示酶活力。
木质素脱色率的检测方法：
将待测液与磷酸盐缓冲液(pH 7.6)按体积比1:2进行混合，使用紫外分光光度计在465nm处测定吸光度，根据下面公式计算脱色率：
脱色率(％)＝(A0-An)/A0×100；
式中，A0：空白对照的吸光度；An：发酵液发酵至第n天的吸光度。
木质素浓度的检测方法：
将待测液稀释至合适浓度后，检测器在280nm处的吸光度，同时配制碱木质素梯度溶液，并分别测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以木质素浓度为横坐标，绘制木质素标准曲线，根据标准曲线方程计算待测液的木质素浓度。
实施例1：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株的分离、筛选及种属鉴定
1、分离与筛选
将取自湖南省岳麓山中枯立木或倒木上涨势良好的真菌子实体通过无菌水清洗表面、75％酒精擦拭表面后，于超净台中用灭过菌的解剖刀将真菌子实体切成0.5cm×0.5cm的菌块，接于PDA琼脂培养基，置于28℃恒温培养箱中培养。
待PDA琼脂培养基上长出真菌菌丝体后，用接种铲切下0.5cm×0.5cm带有薄层培养基的菌丝体，接于新的PDA琼脂培养基中。
通过反复接种培养2～3代后获得微生物的纯菌落，将分离得到的纯菌落分别接种至PDA-苯胺蓝琼脂培养基和PDA-愈创木酚琼脂培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养，分别记录纯菌落在苯胺蓝培养基上的脱色圈直径和在愈创木酚培养基上的显色圈直径，脱色圈直径和显色圈直径最大的菌株即为产木质素降解酶能力最强的菌株，因此得到菌株S-11。
2、鉴定
将上述得到的菌株S-11的单菌落接种到PDA琼脂培养基上，然后将PDA琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5天，观察长出的菌落形态。菌种在PDA琼脂培养基上生长迅速，由图1～2可知，菌落呈现乳白色且均匀，扁平，有同生圆，菌丝呈现明显类似菊花的发散状。挑选在PDA琼脂培养基上生长良好的菌丝制成菌悬液，光学显微镜油镜下观察，其营养菌丝壁光滑，具分隔，多分枝，形态上与白囊耙齿菌相似。
3、菌株的系统发育树分析
采用天根生化科技有限公司提供的真菌基因组DNA提取试剂盒，抽提菌株S-11的基因组DNA，以此为模板，利用真菌ITS通用引物通过PCR反应扩增菌株的ITS序列片段，扩增得到的片段由上海生工生物工程有限公司进行测序(其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示)。将测序得到的菌株的ITS序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对分析，采用MEGA 5.1软件基于临近法构建系统发育树(如图3所示)。
由菌落形态特征与ITS序列分析实验结果，将该菌鉴定为白囊耙齿菌(Irpexlacteus)，命名为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11。
实施例2：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11产木质素降解酶的检测
将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种到PDA-愈创木酚琼脂培养基上，然后将PDA-愈创木酚琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5天，观察并记录菌落周围培养基的变色情况。
如图4～5所示，与未接种菌株的对照相比，接种了该菌的PDA-愈创木酚琼脂培养基上的菌落周围和底部有较大且清晰的红棕色的显色圈，显色圈的直径为：32mm，说明该菌株具有较强的产木质素降解酶的能力。
实施例3：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株产过氧化物酶的检测
将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种到PDA-苯胺蓝琼脂培养基上，然后将PDA-苯胺蓝琼脂培养基倒置于28℃恒温培养箱中，培养3～5天，观察并记录菌落周围培养基的脱色情况。
如图6-图7所示，与对照相比，接种了该菌的PDA-苯胺蓝琼脂培养基的菌落周围和底部有较大且清晰的褪色圈，褪色圈的直径为：53mm，且菌丝仍然呈现自然色，这说明该菌能利用并代谢苯胺蓝，说明菌株具有较强的产木质素过氧化物酶或者锰过氧化物酶的能力。
实施例4：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株在木质素培养基中的生长
(1)将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为8.3g/L后得到种子液；
(2)将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样，样品于1,2000rpm、4℃离心10min后，去上清液得到菌丝球，将菌丝球用去离子水冲洗三遍后，于60℃烘箱中烘干至恒重并称重。
结果如图8所示，菌体生物量在培养的前3天一直保持增加直至第5天达到生长量的最大值，此时的菌体生物量为：815.2mg/L，之后开始下降并进入稳定期，这表明该菌可以利用培养基中的木质素作为碳源和能源物质进行生长。
实施例5：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株在木质素发酵培养基培养过程中产锰过氧化物酶活性变化特点
(1)将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为8.3g/L后得到白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液；
(2)将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样，将样品于1,2000rpm、4℃离心10min后，弃沉淀，上清液即为粗酶液。
分别检测粗酶液中锰过氧化物酶的酶活，结果如图9所示，该菌在木质素发酵培养基生长过程中的前7天，产生的锰过氧化物酶活性不断增加，第7天后酶活性变化不大，直至第11天达到最大值为34.53U/mL，这表明该菌在木质素发酵培养基生长过程中可产生大量的锰过氧化物酶用于木质素的降解，但是在降解过程中并未检测到该菌的木质素过氧化物酶和漆酶活性，这表明该菌对木质素的降解是依赖其分泌的锰过氧化物酶。
酶活测定反应体系：在50mmol·L-1、pH 5.0和pH 4.5的醋酸钠缓冲液中在37℃下进行，加入灭活的粗酶液样品作为参比。
实施例6：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株在木质素发酵培养基培养过程中对木质素的降解率变化特点
(1)将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为8.3g/L后得到白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液；
(2)将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样，将样品于1,2000rpm、4℃离心10min后，弃沉淀，上清液用于木质素浓度的检测。
结果(如图10所示)显示，在菌株培养过程中，木质素在前3天降解速度较快，在培养的第11天对木质素的降解率达到最大值，木质素的降解率趋势与该菌分泌的锰过氧化物酶活性趋势相似，这表明锰过氧化物酶可能是该菌降解木质素的主要酶类。该菌对木质素的降解检测实验表明该菌可以高效的降解纯木质素，且培养11天后对木质素的降解率可达33.81％。目前的研究表明白囊耙齿菌是分泌木质素降解酶类，并在木质纤维素生物质的预处理方面具有较好的应用前景，但是对于能高效降解纯木质素的白囊耙齿菌鲜有报道。本发明菌株对于木质素的降解要高于文献报道的其它同种属菌株在同种条件下对纯木质素的降解率。
实施例7：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌株在木质素发酵培养基培养过程中对木质素的脱色率变化特点
(1)将实施例1得到的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11菌丝体接种至种子培养基中进行培养，培养至菌体浓度为8.3g/L后得到白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液；
(2)将白囊耙齿菌(Irpex lacteus)S-11种子液以10％(v/v)的接种量，接种至木质素发酵培养基中，在28℃，180rpm下培养13d，从培养的第1天开始，每隔48h取样，将样品于12000rpm、4℃离心10min后，弃沉淀，上清液用于木质素浓度的检测。
木质素是一种黑褐色、可溶于水的物质，木质素的色度降低被认为与木质素的发色基团的断裂有关，即对木质素的脱色率检测也可以验证菌株对木质素的降解能力。结果(如图10所示)显示，培养过程中，木质素的脱色率一直在增加，并在第11天脱色率达到最大值41.79％，木质素的脱色率变化趋势与上述木质素降解率变化趋势一致，且均在菌株培养的第11天达到最大值，这进一步确证了该菌对纯木质素的高效降解能力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南林业科技大学
<120> 一株高效降解木质素的白囊耙齿菌
<130> BAA200550A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 629
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcctgcggaa ggatcattat cgagttttga acgggttgta gctggcctct cacgaggcat 60
gtgcacgcct ggctcatcca ctcttaacct ctgtgcactt tatgtaagag aaaaaaatgg 120
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gaaatgcatt agcgtgaatc ttacggatcg ccttcagtgt gataattatc tgcgctgcgg 540
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