具有抗肿瘤活性的聚（HPMA）-PTA高分子化合物、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及高分子化学技术领域，具体为具有抗肿瘤活性的聚(HPMA)-PTA高分子化合物、制备方法及其应用。
背景技术
近年来，肿瘤微环境响应的聚合物抗癌药物输送系统引起广泛关注，如肿瘤部位较低的pH值和较高的谷胱甘肽含量等都被用于设计相应的响应性的抗癌药物输送系统。6-巯基嘌呤(6MP)目前主要用于白血病的治疗，但由于其水溶性差和毒副作用较大，在临床应用上有一定的限制，因此将小分子6MP连接到生物相容性好的聚合物上，并制备成肿瘤微环境响应的高分子抗癌药物是目前研究的重要领域。
聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)即聚(HPMA)是一种高分子药物载体，由于具有良好的生物相容性、水溶性、无免疫原性等优点，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物体内的稳定性，还可以增加药物在肿瘤部位的累积，使药效得到更好的发挥等特点，被作为药物载体已应用于临床。因此，将小分子药物6MP通过谷胱甘肽响应的共价键链接到聚(HPMA)上制备成高分子抗癌药物，提高对肿瘤的抑制作用有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的聚(HPMA)-PTA高分子化合物。
本发明的另一目的在于提供上述高分子化合物的制备方法。
本发明的进一步的目的在于提供上述化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有抗肿瘤活性的聚(HPMA)-PTA高分子化合物，其结构式如下:
式中，m＝1～20mol％，n＝80～99mol％。
一种具有抗肿瘤活性的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)PTA的制备：将6MP溶解于甲醇中，待其完全溶解后，加入甲醇钠和丙炔酸，将该溶液置于65℃油浴中回流过夜，向溶液中加入4mL蒸馏水进行淬灭，然后滴加1.0molL-1的盐酸形成沉淀，抽滤得到粗产品，将粗产品溶解于1.0molL-1的氢氧化钠溶解，再加入1.0molL-1的盐酸形成沉淀，抽滤得到纯产物，其结构式如下：
(2)聚(HPMA)-PTA高分子化合物的制备：将聚(HPMA)用溶剂二甲基亚砜(DMSO)溶解后，将该溶液置于冰水浴中冷却到0℃，加入步骤(1)得到的PTA，再加入二环己基碳二亚胺(DCC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在氮气保护下反应120h，反应结束用丙酮和乙醚的混合液沉淀，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心得高分子化合物，其结构式如下：
在步骤(2)中，PTA、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的滴加和反应温度为0℃。
步骤(2)中，PTA占总摩尔的1％～20％，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)占总摩尔的80％～99％。
在步骤(2)中，用丙酮和乙醚的混合液沉淀中，所述丙酮和乙醚的体积比为7:3-7:1。
一种具有抗肿瘤活性的聚(HPMA)-PTA高分子化合物在制备抗肿瘤药物上的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种含有6-巯基嘌呤(6MP)的具有抗肿瘤活性的聚合物，是将6-巯基嘌呤首先与炔丙酸反应，生成顺式3-(9H-嘌呤-6-基硫代)-丙烯酸，缩写为PTA，然后利用PTA上的羧基与聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺上羟基之间的反应，将PTA通过通过共价键连接到聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)上形成的水溶性的高分子化合物，属于高分子化学合成及应用领域。所制备的高分子化合物中的链接小分子药物的共价键在达肿瘤部位之后，被肿瘤细胞中大量存在的谷胱甘肽还原而断裂，释放出小分子药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。水溶性药物的减少了对正常组织的毒害，高分子载体聚(HPMA)使高分子药物体现出良好的生物相溶性，进一步降低了抗癌药物的毒副作用，因此在制备抗肿瘤药物中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为PTA的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的核磁共振氢谱；
图2为6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的红外图谱；
图3为6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的热重曲线；
图4为6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物在不同谷胱甘肽浓度时的释放曲线；
图5为6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物对HeLa细胞存活率的影响结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
(一)谷胱甘肽响应的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的制备
本发明的聚(HPMA)-PTA高分子化合物，是将6MP与炔丙酸反应，制备成小分子PTA，再通过PTA上的羧基与聚(HPMA)上的羟基之间的酯化反应，将PTA连接到聚(HPMA)上制备而成，体制备方法如下：
(1)PTA的制备：
将6MP溶解于甲醇中，待其完全溶解后，加入甲醇钠和丙炔酸，将该溶液置于65℃油浴中回流过夜，向溶液中加入4mL蒸馏水进行淬灭，然后滴加1molL-1的盐酸形成沉淀，抽滤得到粗产品，将粗产品溶解于1molL-1的氢氧化钠溶解，再加入1molL-1的盐酸形成沉淀，抽滤得到纯产物，其结构式如下：
(2)高分子化合物的制备：聚(HPMA)用溶剂二甲基亚砜(DMSO)溶解后，将该溶液置于冰水浴中冷却到0℃，加入PTA，再加入二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，在氮气保护下于0℃反应120h，反应结束用丙酮和乙醚的混合液沉淀，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心得高分子化合物，其结构式如下：
式中，m＝1～20mol％，n＝80～99mol％。
实施例1
聚(HPMA)-PTA高分子抗癌药物的制备：将聚(HPMA)(0.14g，0.001mol)用二甲基亚砜(1mL)溶解，加入PTA(0.002g，0.1mmol)，DCC(0.046g)，DMAP(0.005g)，在氮气保护下于0℃反应120h，用丙酮和乙醚混合溶液沉淀，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心得目标高分子药物。
Mn＝2.4×104，Mw/Mn＝1.38.1H-NMR(400MHz,d6-DMSO,δ,ppm):3.68(-CH(OH)-ofHPMA),1.33-1.80(-CH2-ofHPMA),7.45(CHof6MP)，8.66(CHof6MP)。
实施例2
聚(HPMA)-PTA高分子抗癌药物的制备：将聚(HPMA)(0.14g，0.001mol)用二甲基亚砜(1mL)溶解，加入PTA(0.012g，0.6mmol)，DCC(0.046g)，DMAP(0.005g)，在氮气保护下于25℃反应120h，用丙酮和乙醚混合溶液沉淀，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心得目标高分子药物。
Mn＝2.17×104，Mw/Mn＝1.88.1H-NMR(400MHz,d6-DMSO,δ,ppm):3.68(-CH(OH)-ofHPMA),1.33-1.80(-CH2-ofHPMA),7.45(CHof6MP)，8.66(CHof6MP)。
实施例3
聚(HPMA)-PTA高分子抗癌药物的制备：将聚(HPMA)(0.14g，0.001mol)用二甲基亚砜(1mL)溶解，加入PTA(0.024g，0.15mmol)，DCC(0.046g)，DMAP(0.005g)，在氮气保护下于25℃反应120h进行聚合，用丙酮和乙醚混合溶液沉淀，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心得目标高分子药物。
Mn＝3.4×104，Mw/Mn＝2.10.1H-NMR(400MHz,d6-DMSO,δ,ppm):3.68(-CH(OH)-ofHPMA，),1.33-1.80(-CH2-ofHPMA),7.45(-CH-of6MP)，8.66(-CH-of6MP)。
如图1所示的PTA的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的核磁共振氢谱图，图1中通过核磁共振氢谱分析可以得出，化学位移在3.68ppm出现HPMA上和-OH相连的-CH-的特征峰，化学位移在3.02ppm出现HPMA上的-NHCH2-的特征峰，化学位移在0.9-1.3ppm现HPMA上-CH2-和聚合物中-CH3的特征峰，化学位移在7.45和8.66ppm出现6MP上的两组-CH-的特征峰，说明用本申请要求保护的制备方法得到的产物与本申请要求保护的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的结构一致。
如图2所示的6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的红外图谱，图2中通过在波数1607和1512cm-1分别出现了嘌呤杂环的特征振动吸收峰，高分子药物中存在6MP，说明用本申请要求保护的制备方法得到的产物与本申请要求保护的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的结构一致。
如图3所示的6MP的摩尔比为10％时制备的聚(HPMA)-PTA高分子药物的热重曲线，图3中通过热重曲线可以看出，高分子药物中6MP的含量为9.8％，说明用本申请要求保护的制备方法得到的产物与本申请要求保护的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的结构一致。
(二)谷胱甘肽响应的聚(HPMA)-PTA高分子化合物的体外释放
该聚合物是由小分子药物PTA中的羧基与聚(HPMA)上的羟基之间的反应键接到聚合物链上的，其中的-S-C＝C键会在癌细胞中过量的谷胱甘肽的作用下断裂，从而释放出完整的小分子6MP，而在人体正常的体液中，该键是稳定的。
为了测试聚合物药物中小分子药物在不同谷胱甘肽浓度下的的释放速率，分别将浓度为0.2mg/mL的聚合物的水溶液的谷胱甘肽的浓度值调到100、10和0.1mM并放置于37℃的恒温水溶中，在不同的时刻用三氯甲烷萃取释放下来的6MP，用紫外可见光谱仪在波长为320nm处测量其萃取液的吸光度，用不同时刻的吸光度与总的吸光度的比值作为不同时刻的释放速率，见图4。
结果显示在谷胱甘肽浓度为0.1mM时的释放缓慢，在100mM时的释放量接近20％，而在浓度为10和100mM的条件下释放较快，而且在前40mM时有一个明显的突发式释放，然后释放速率相对放慢，缓释时间延长。
结果说明聚(HPMA)-PTA高分子化合物在正常的体液中能够稳定存在，而在谷胱甘肽浓度较高的条件下却能够快速释放出小分子6MP，达到了药物缓慢释放的目的。
(三)体外抑制肿瘤细胞生长实验
采用四氮唑盐还原法(MTT法)对HeLa细胞株进行试验：取处于生长对数期的HeLa细胞，将细胞浓度调为2×104个/mL，在96孔培养板中加入90μL/孔，边缘孔用无菌PBS填充。
在5％CO2，37℃孵育，培养箱中放置待贴壁后，将聚(HPMA)-PTA和和纯PTA分别设定浓度为2.5、5、10、20、40μg/mL5个梯度的溶液加入，每个浓度均设3个复孔，加药后细胞继续培养24h后，取出先离心，后弃去96孔板内的上清培养液，用PBS冲洗2～3遍后，每孔加人20μLMTT(四氮唑，5mg/ml，即0.5％MTT)溶液，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养4h。
终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150μL的DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm测定各孔的吸光OD值。细胞生长抑制率按以下公式计算：
存活率＝[(实验组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％
测试结果见表1及图5，其中聚(HPMA)-PTA的IC50＝20.7μg/ml，6MP的IC50＝13.2μg/ml。
表1高分子药物与纯PTA体外48h抗癌活性数据
从结果可以看出，本发明制备的聚(HPMA)-PTA高分子化合物具有良好的抗肿瘤活性，由于高分子化合物所以能够在HeLa细胞表面聚集，被HeLa细胞内吞，增加了HeLa细胞对聚合物的摄取量，所以明显的增强了对HeLa细胞的抑制作用。
从结果分析得出纯6MP和聚合物药物对HeLa细胞的IC50值分别为18.5μg/ml和IC50＝22.7μg/ml，说明合成的高分子药物是一种有效的抗癌药物。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
