南苜蓿挥发油的提取方法及精油产品、喷雾剂
技术领域
本发明涉及一种南苜蓿挥发油的提取方法，属于挥发油提取技术领域。本发明还涉及含有上述南苜蓿挥发油的精油产品和喷雾剂。
背景技术
我国境内分布的苜蓿属(Medicago)植物主要分两种：紫花苜蓿(Medicago%20sativaLinn)和黄花苜蓿(Medicago%20polymorpha%20Linn)。通常人们所指的苜蓿，实际上是紫花苜蓿，对其活性成分研究也较为深入，如多糖、皂苷、挥发油等均有报道。紫花苜蓿在畜牧产业中发挥重要作用，主要用作动物饲料和牧草。与紫花苜蓿不同，黄花苜蓿，又称南苜蓿、黄花草子、磨盘草子、苜荠头、草头、金花菜等，主要分布于我国江浙一带，由于味道甘甜，口感适中，且具清热解毒、利湿退黄、通淋排石的功效，在江浙一带主要作为上等蔬菜食用。目前，有关南苜蓿活性成分的研究鲜有报道，由于植物形态、地理分布、用途的不同，致使南苜蓿与紫花苜蓿在活性成分与药理作用方面势必存在差异。同时，南苜蓿自古以来就在江浙地区作为蔬菜食用，且具有一定食疗价值。因此，对南苜蓿中活性成分进行研究是十分必要的。传统挥发油的收集方式是待提取器冷却后，打开旋塞，放水，收集上方的挥发油。这种操作往往使挥发油在下落过程中附着于器壁上，造成损失。同时，水中也溶解部分挥发油致使提取率进一步下降。因此，开发新的挥发油富集方法也同样重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种南苜蓿挥发油的提取方法，该提取方法绿色环保，安全性高；操作简便，提取率高，成本低，可行性强，且适合大规模生产。本发明还提供上述提取方法提取的南苜蓿挥发油制备的精油产品和喷雾剂。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种南苜蓿挥发油的提取方法，其包括以下步骤：
(1)新鲜南苜蓿洗净后，于50℃～60℃恒温干燥粉碎成为10～40目粒径。
原材粒径对挥发油提取率影响较大，这与提取溶剂接触面、粘度相关。当原材粒径过大时，由于原材与提取溶剂接触面小，从而不利于活性成分浸出。而当原材粒径过小时，较小的粒径增加了提取溶液的粘度，影响活性成分扩散，从而不利于成分浸出，导致提取率降低。为此，本发明南苜蓿粉碎成10～40目粒径，从而获得较高提取率，优选10目。
(2)以1:10～50g/mL料水比将粉碎的南苜蓿浸泡过夜。
当料液比过小时，由于原材不能被充分浸泡，活性成分释放减少；而当料液比过大时，活性成分被稀释，同样会降低提取率，且增加生产成本。因此，本发明的料液比(料水比)为1:10～50g/mL，在此料水比时提取率高，优选料水比为1:10g/mL。
(3)将步骤(2)中浸泡的南苜蓿采用挥发油提取装置，回流提取7h～11h。
当提取时间较短时，活性成分浸出不完全；而当提取时间过长时，挥发性成分，尤其萜类物质易被氧化，结构遭到破坏，致使提取率降低。因此，本发明提取时间确定7h～11h，在此提取时间下，提取率高，优选9h。
(4)提取结束，停止加热，待挥发油装置冷却至室温，收集提取器内液体。由于多数挥发油粘性较大，在放水过程中，容易粘附在容器壁上，加之水中溶解部分挥发油，致使挥发油提取率普遍较低。因此，为了提高挥发油提取率，本发明采用氯仿、二氯甲烷、乙醚等非极性溶剂对提取器内液体进行萃取，并对溶剂冲洗器壁，分层后富集有机相。以1:50(v/v)氯仿萃取提取器内液体中的挥发油，得率最高。
(5)挥干溶剂的温度选择很关键，温度过高会使挥发油成分挥发或溶剂蒸发量大带走挥发油性成分；温度过低则溶剂除不净。因此，采用低温减压蒸除溶剂得淡黄色南苜蓿挥发油，低温为5～30℃，优选20℃，如选择20℃旋蒸除去氯仿(非极性溶剂)得到南苜蓿挥发油。
一种含有上述南苜蓿挥发油的提取方法提取的南苜蓿挥发油的精油产品，其包括南苜蓿挥发油与乙醇，南苜蓿挥发油与乙醇的质量比为100～200:1。该质量比下，南苜蓿挥发油在乙醇中能够分散均匀，且抗菌活性最佳。
一种含有上述南苜蓿挥发油的提取方法提取的南苜蓿挥发油的喷雾剂，其包括南苜蓿挥发油与水杨酸，南苜蓿挥发油中叶绿醇含量高达48.21％，是主要的活性物质，该成分具有抗氧化、抗菌等作用，与水杨酸作用协同，二者复配可减少水杨酸用量，进而降低大剂量水杨酸所致的刺激性。南苜蓿挥发油与水杨酸的质量比为0.01～0.03：0.08～0.1，该质量比能增大水杨酸在水中的溶解度，利于南苜蓿挥发油与水杨酸发挥协同作用。
本发明的有益效果：
1)本发明的南苜蓿挥发油的提取方法以水作为提取溶剂，绿色环保，安全性高；操作简便，成本低，可行性强，且适合大规模生产。
2)利用本发明的提取方法所得挥发油提取率高，达到0.251％(g/g)，大于传统方法挥发油提取率。
3)本发明制备出的南苜蓿挥发油具有良好的抑菌作用，所述南苜蓿挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、酿酒酵母均具有抑制作用，对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为2.5μL/mL；对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为5μL/mL；对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)为10μL/mL；对酿酒酵母的最低抑菌浓度(MIC)为10μL/mL。上述抑菌作用，可开发出抑菌精油、喷雾剂等产品。
4)本发明中南苜蓿挥发油应用于皮肤表面，具有美白、祛斑、嫩肤的效果。
具体实施方式
实施例1
(1)新鲜南苜蓿洗净后，于50℃恒温干燥粉碎成为40目粒径。
(2)以1:30g/mL料水比将粉碎的南苜蓿浸泡过夜。
(3)将步骤(2)中浸泡的南苜蓿采用挥发油提取装置，回流提取7h。
(4)提取结束，停止加热，待挥发油装置冷却至室温，用100mL乙醚冲洗、萃取提取器中液体，分层富集有机相。
(5)5℃减压蒸除乙醚得到南苜蓿挥发油，计算求得其提取率为0.183％。
实施例2
(1)新鲜南苜蓿洗净后，于60℃恒温干燥粉碎成为10目粒径。
(2)以1:10g/mL料水比将粉碎的南苜蓿浸泡过夜。
(3)将步骤(2)中浸泡的南苜蓿采用挥发油提取装置，回流提取9h。
(4)提取结束，停止加热，待挥发油装置冷却至室温，用100mL二氯甲烷冲洗、萃取提取器中液体，分层富集有机相。
(5)20℃减压蒸除二氯甲烷得到南苜蓿挥发油，计算求得其提取率为0.224％。
实施例3
(1)新鲜南苜蓿洗净后，于50℃恒温干燥粉碎成为20目粒径。
(2)以1:50g/mL料水比将粉碎的南苜蓿浸泡过夜。
(3)将步骤(2)中浸泡的南苜蓿采用挥发油提取装置，回流提取11h。
(4)提取结束，停止加热，待挥发油装置冷却至室温，用100mL氯仿冲洗、萃取提取器中液体，分层富集有机相。
(5)20℃减压蒸除氯仿得到南苜蓿挥发油，计算求得其提取率为0.251％。
采用气相色谱-质谱法(GC)分析上述实施例获得的南苜蓿挥发油中化学成分，分析条件如下：GCMS-QP2010气相色谱-质谱连用仪；分析柱Rxi-5sil(30m,0.25mm,0.25μm)；离子肼230℃；载气：氦气，流速1.0mL/min；柱温采用程序升温：以5℃/min由40℃升至60℃,保留2min,然后以15℃/min从60℃升至110℃保留4min,以5℃/min升至180℃,保留5min,以25℃/min升至280℃。将样品溶于乙醚，以1:30分流比注入GC-MS。分析结果与NIST%2005数据库比对，得到如表1所示的成分分析结果。
如表1所示，南苜蓿挥发油中鉴定出39种挥发性成分，占总量的88.19％，其中叶绿醇含量最多占到48.21％，是主要的活性成分。
表1%20南苜蓿挥发油中的化学成分
上述实施例获得的南苜蓿挥发油抑菌活性试验：
考察南苜蓿挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、酿酒酵母四种菌株的抑制作用。
一、抑菌活性测定
1、细菌培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH 7.2～7.4。
2、真菌培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，pH自然。制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂(煮沸20～30min，能被玻璃棒戳破即可)，用4层纱布过滤，再加糖和琼脂，加热融化后再补足水分至1000mL，121℃下灭菌20min。
3、磷酸盐缓冲液：甲液(0.2mol/L磷酸氢二钠溶液)：将35.814g磷酸氢二钠配成500mL溶液。乙液(0.2mol/L磷酸二氢钠溶液)：将7.8005g磷酸二氢钠配成250mL溶液。使用时，将81mL和19mL乙液混合均匀，配制成1000mL，pH 7.4的溶液即可。高压蒸汽灭菌20min，4℃保存于冰箱备用。
4、菌悬液的制备：菌种活化后，挑取生长最好的单菌落使用PBS缓冲液稀释，使用振荡器充分混匀，将菌悬液浓度调整至108cfu/mL～109cfu/mL范围内，保存至4℃冰箱备用。
5、样品纸片的制作：将南苜蓿挥发油以吐温80为溶剂配置成样品溶液。用打孔器将滤纸打成直径为6mm的圆形纸片，并滴加20μL样品溶液，以蒸馏水为空白对照，自然干燥备用。
6、纸片法实验的操作流程：用打孔器将滤纸制成直径为6mm的小圆滤纸片，高温干燥灭菌后备用。将不同培养基倒入平皿中制成平板，在超净工作台中将100μL菌悬液均匀涂布于培养基表面。用镊子将样品纸片放在对应的平板上，将平板倒置培养24h后观察抑菌圈。
7、结论：空白对照纸片均无抑菌圈，所有样品纸片均有抑菌圈，说明南苜蓿挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、酿酒酵母均有抑制作用。
二、最小抑菌浓度测定(MIC)
在超净工作台中，分别移取4mL细菌培养基和4mL真菌培养基至离心管中，然后加入1mL不同浓度的南苜蓿挥发油-吐温80乳化液，使其终浓度分别为25，15，10，5，2.5，1.25，0.625μL/mL，用振荡器充分震荡混匀，迅速倾倒至平皿中，在室温下静置待培养基凝固。吸取0.1mL菌悬液到已做好标记的平板中，使用无菌涂布棒涂布均匀，带平板充分吸收菌悬液后，将平板倒置。细菌于37℃培养箱中培养24h；真菌于28℃培养箱中培养48h，观察菌种的生长情况，与空白组对照，以菌落完全被抑制的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。结果表明：南苜蓿挥发油对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为2.5uL/mL，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为5μL/mL，对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)为10μL/mL，对酿酒酵母的最低抑菌浓度(MIC)为15uL/mL。因此，南苜蓿挥发油的抑菌作用由弱到强依次为酿酒酵母、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，对大肠杆菌的抑制作用最强。说明，南苜蓿挥发油具有很好的抑菌作用。
实施例4
采用实施例1中获得的南苜蓿挥发油，以乙醇为溶剂，按照挥发油与溶剂质量比为120:1(g/mL)，搅拌至均匀，装入棕色瓶中。
实施例5
采用实施例2中获得的南苜蓿挥发油，以乙醇为溶剂，按照挥发油与溶剂质量比为100:1(g/mL)，搅拌至均匀，装入棕色瓶中。
实施例6
采用实施例3中获得的南苜蓿挥发油，以乙醇为溶剂，按照挥发油与溶剂质量比为200:1(g/mL)，搅拌至均匀，装入棕色瓶中。
上述实施例4～6获得的精油产品具有抑菌作用，可与洗漱产品如牙膏、沐浴露、香皂、肥皂、洗面奶、洗手液等混合使用，已达到进一步清洁功效。
实施例7
采用实施例1中获得的南苜蓿挥发油0.01g，水100mL，水杨酸0.09g，制成喷雾剂。
实施例8
采用实施例2中获得的南苜蓿挥发油0.03g，水100mL，水杨酸0.08g，制成喷雾剂。
实施例9
采用实施例3中获得的南苜蓿挥发油0.02g，水100mL，水杨酸0.1g，制成喷雾剂。
实施例7～9获得的喷雾剂可用作爽肤水直接喷到皮肤表面，具有美白、祛斑、嫩肤的功效。
南苜蓿精油产品和南苜蓿挥发油喷雾剂美白、祛斑、嫩肤试验：
挑选皮肤较差，有雀斑等皮肤问题的志愿者10人，连续15天，使用南苜蓿精油产品和南苜蓿挥发油喷雾剂。实验结果表明：10名志愿者皮肤状况都有所改善，脸上雀斑淡化，皮肤相比实验前有光泽。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。
